李晶晶，鄒　洋，安亦君，齊志群，李小麗，王　磊，黃敏君

1341例疑似肺孢子菌肺炎非HIV陽(yáng)性患者病原學(xué)診斷分析

李晶晶，鄒洋，安亦君，齊志群，李小麗，王磊，黃敏君

目的 探討六亞甲基四胺銀（gomori’s methenamine silver， GMS）染色鏡檢法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction， PCR）法檢測(cè)肺孢子菌肺炎（pneumocystis pneumonia， PCP）患者標(biāo)本的陽(yáng)性率，為臨床提供更有利的實(shí)驗(yàn)室支持依據(jù)。方法 采集1341例疑似PCP患者的深部誘導(dǎo)痰或支氣管肺泡灌洗液（broncho-alveolar lavage fluid， BALF）標(biāo)本，GMS鏡檢法和 PCR法相結(jié)合檢測(cè)肺孢子菌，任何一種方法檢測(cè)陽(yáng)性，即判斷為PCP。 結(jié)果 共285例診斷為PCP，其中114例為GMS染色鏡檢法陽(yáng)性，282例為PCR法檢測(cè)陽(yáng)性，111例為2種檢測(cè)方法雙陽(yáng)性，3例為GMS染色鏡檢法單獨(dú)陽(yáng)性（均為腎移植術(shù)后BALF樣品），171例為PCR方法單獨(dú)陽(yáng)性。深部誘導(dǎo)痰標(biāo)本中，GMS染色鏡檢法和PCR法陽(yáng)性檢出率分別為5.1％和16.2％（P＜0.05）；而B(niǎo)ALF標(biāo)本二者的陽(yáng)性檢出率分別為23.3％和42.2％（P＜0.05）。未知原因發(fā)熱合并肺炎患者和器官移植后接受免疫抑制劑治療者有更高的陽(yáng)性檢出率。結(jié)論 PCR法檢測(cè)PCP陽(yáng)性率高于GMS染色鏡檢法，PCR法檢測(cè)與GMS染色鏡檢法結(jié)合診斷PCP對(duì)臨床具有較高指導(dǎo)價(jià)值。

肺孢子菌肺炎；病原學(xué)；六亞甲基四胺銀染色；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

肺孢子菌是機(jī)會(huì)致病菌，由肺孢子菌引起的肺孢子菌肺炎（Pneumocystis pneumonia， PCP）是一種間質(zhì)性漿細(xì)胞性肺炎，常見(jiàn)于艾滋病患者，是目前常見(jiàn)的機(jī)會(huì)感染與致死的病因之一［1］。近年來(lái)，由于器官移植、腫瘤放化療和免疫抑制劑使用增加等原因所致獲得性免疫功能缺陷者的增多，PCP的發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)［2］。為探討PCP的六亞甲基四胺銀（gomori’s methenamine silver， GMS）染色鏡檢法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction， PCR）法檢測(cè)PCP患者標(biāo)本的陽(yáng)性率，為臨床提供更有利的實(shí)驗(yàn)室支持依據(jù)，本研究回顧性分析2011年1月—2014年10月由其他醫(yī)療機(jī)構(gòu)送檢我所的1341例疑似PCP的實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果，現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 為2011年1月—2014年10月由其他醫(yī)療機(jī)構(gòu)送到北京友誼醫(yī)院熱帶醫(yī)學(xué)研究所進(jìn)行PCP病原學(xué)檢測(cè)的標(biāo)本，選取可追蹤其基礎(chǔ)疾病并采樣規(guī)范的1341例疑似PCP非HIV陽(yáng)性患者的深部誘導(dǎo)痰或支氣管肺泡灌洗液（broncho-alveolar lavage fluid， BALF）標(biāo)本，回顧性分析GMS染色鏡檢法和PCR法的檢測(cè)結(jié)果。

1.2PCP的診斷 由于PCP缺少特異的臨床癥狀，診斷非常困難。臨床醫(yī)師對(duì)考慮免疫功能受損患者出現(xiàn)發(fā)熱、干咳、呼吸急促和呼吸困難等癥狀，并且胸部X線片雙肺呈典型碟形毛玻璃樣改變或迷霧狀陰影的患者高度懷疑為PCP，此類患者的深部誘導(dǎo)痰、BALF找到肺孢子菌包囊則確診為PCP，PCR法檢測(cè)到DNA陽(yáng)性為PCP的輔助診斷方法［2-3］。本研究中1341例病例均存在發(fā)熱、干咳、呼吸急促和呼吸困難等癥狀，且胸部X線片或CT顯示為毛玻璃樣改變。

1.3儀器及試劑 1N NaOH溶液、0.9％氯化鈉溶液、無(wú)水甲醇、5％過(guò)碘酸鈉、GMS染液等，TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒（DP305-02），TaKaRa Ex Tag酶 （DRR006A），5×Loading Buffer （GENEray， GR0205）。 PCR儀（型號(hào)PTC.200，Bio-Rad，美國(guó)）。

1.4檢測(cè)方法

1.4.1GMS染色鏡檢法 將BALF或液化后的深部誘導(dǎo)痰液2 ml，分裝在2個(gè)1.5 ml Ep管中，8000 rpm 離心5 min后得沉淀，加入0.9％氯化鈉溶液，混勻后8000 rpm 離心5 min，清洗沉淀一次。另一管沉淀用于基因組DNA的提取。將沉淀與少量0.9％氯化鈉溶液混勻后，滴于涂有小牛血清的玻片上，晾干，經(jīng)無(wú)水甲醇固定。5％過(guò)碘酸鈉氧化，室溫孵育15 min，蒸餾水沖洗數(shù)秒，晾干。涂片置GMS染液染缸，60 ℃溫箱孵育90 min至標(biāo)本轉(zhuǎn)為黃褐色，蒸餾水沖洗。晾干涂片，2％硫代硫酸鈉分化及亮綠復(fù)染2 min，蒸餾水沖洗數(shù)次，油鏡鏡檢。由2名技術(shù)員復(fù)核。

1.4.2PCR法檢測(cè) 按植物基因組DNA提取試劑盒提取標(biāo)本DNA，PCR引物為肺孢子菌線粒體大亞基rRNA（mtLSU rRNA）中的2個(gè)片段pAZ102E（5’-GATGGCTGTTTCCAAGCCCA-3’）和pAZ102H（5’-GTGTACGTTGCAAAGTACTC-3’），由中國(guó)SBS公司合成。PCR反應(yīng)使用25 μl反應(yīng)體系：10× buffer 2.5 μl，10 M 4×dNTPs 2.0 μl，10 μmol/L引物各0.5 μl，Ex Taq酶0.125 μl（購(gòu)自Takara公司），DNA模板5 μl，無(wú)菌去離子水補(bǔ)齊至25 μl。共設(shè)3個(gè)對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照：1 μl（人源肺孢子菌分離株P(guān)tl DNA），其余用無(wú)菌去離子水補(bǔ)齊；陰性對(duì)照：5 μl陰性患者標(biāo)本DNA；空白對(duì)照：5 μl無(wú)菌雙蒸水。反應(yīng)條件：變性 94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。取8 μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，100 mA電流電泳，35 min后停止電泳，取出凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描并保存圖像。PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)約346 bp。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2組率的比較用四格表χ2檢驗(yàn)，多組率的比較用R×Cχ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.11341例標(biāo)本總體陽(yáng)性率 1341例標(biāo)本中，2種方法共檢出陽(yáng)性標(biāo)本285例，陽(yáng)性率為21.3％。其中111例為2種檢測(cè)方法雙陽(yáng)性，3例為GMS染色鏡檢法單獨(dú)陽(yáng)性（均為BALF樣品，且均為腎移植術(shù)后），171例為PCR法單獨(dú)陽(yáng)性。PCR法陽(yáng)性率為21.0％（282/1341），GMS染色鏡檢法陽(yáng)性率為8.5％（114/1341）。以GMS染色鏡檢法為金標(biāo)準(zhǔn)，PCR法的靈敏度為97.4％（111/114）。

2.22種標(biāo)本用不同方法檢測(cè)的陽(yáng)性率

2.2.12種標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性率 1092例深部誘導(dǎo)痰標(biāo)本采用GMS染色鏡檢法和PCR檢測(cè)方法，共檢測(cè)陽(yáng)性177例，陽(yáng)性率為16.2％；249例BALF標(biāo)本采用2種方法檢測(cè)陽(yáng)性108例，陽(yáng)性率為43.4％。BALF標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性率高于深部誘導(dǎo)痰標(biāo)本（χ2=89.403，P=0.000）見(jiàn)表1。

表1　2種標(biāo)本用2種方法檢測(cè)結(jié)果［ 例（％）］Table 1 Results of GMS staining and PCR assay in sputum and BALF specimens［ cases（％）］

2.2.22種標(biāo)本用2種方法檢測(cè)的陽(yáng)性率 用GMS染色鏡檢法，249例BALF 標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性58例，陽(yáng)性率為23.3％；1092例深部誘導(dǎo)痰標(biāo)本檢測(cè)56例，陽(yáng)性率為5.1％。BALF 標(biāo)本陽(yáng)性率大于深部誘導(dǎo)痰標(biāo)本（χ2=86.014，P=0.000）。采用 PCR法檢測(cè)，249例BALF陽(yáng)性標(biāo)本105例，陽(yáng)性率為42.2％；1092例深部誘導(dǎo)痰陽(yáng)性標(biāo)本177例，陽(yáng)性率為16.2％。BALF 標(biāo)本陽(yáng)性率高于深部誘導(dǎo)痰標(biāo)本（χ2=82.283，P=0.000）。見(jiàn)表1。

2.35種疾病標(biāo)本用2種方法檢測(cè)結(jié)果 對(duì)1341例標(biāo)本按照患者原發(fā)病歸納為5種：惡性腫瘤繼發(fā)性免疫缺陷（惡性腫瘤組），器官移植后接受免疫抑制劑治療（器官移植組），自身免疫性疾病接受免疫抑制劑治療（自身免疫性疾病組），高齡患有慢性病（老年慢性病組），未知原因發(fā)熱合并肺炎（未知原因肺炎組）。分析5組檢測(cè)陽(yáng)性率。

GMS染色鏡檢法檢測(cè)各疾病組陽(yáng)性率為6.6％～13.1％，但各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.3575，P=0.0528）。PCR法檢測(cè)各疾病組陽(yáng)性率為10.1％～28.9％，未知原因肺炎組和器官移植組陽(yáng)性率分別為28.9％和26.6％，高于其他疾病組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=49.8271，P=0.000）。見(jiàn)表2。

表2　5種疾病標(biāo)本用2種方法檢測(cè)結(jié)果［ 例（％）］Table 2 Results of GMS staining and PCR assay in 5 kinds of diseases［ cases（％）］

3 討 論

由于肺孢子菌不能被培養(yǎng)，在病原學(xué)檢測(cè)中鏡下找到肺孢子菌包囊是診斷PCP的金標(biāo)準(zhǔn)［4］。但其準(zhǔn)確性受很多因素限制。第一是標(biāo)本來(lái)源，病原學(xué)檢測(cè)所采用的標(biāo)本主要為深部誘導(dǎo)痰和（或）BALF。實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)深部誘導(dǎo)痰雖然具有獲取簡(jiǎn)單以及無(wú)創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，且送檢樣本較多，但荷菌量低，容易出現(xiàn)假陰性；而支氣管肺泡灌洗是一種侵襲性操作，獲取困難，是標(biāo)本來(lái)源上限制PCP準(zhǔn)確診斷的因素。第二，檢驗(yàn)人員的技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)影響對(duì)鏡檢結(jié)果的判定［5-6］。第三，肺孢子菌生活史階段為滋養(yǎng)體和包囊，比例為10∶1，以哪種形態(tài)存在與其生存環(huán)境關(guān)系密切，應(yīng)用僅使包囊著色的GMS染色鏡檢法作為病原學(xué)檢測(cè)手段來(lái)診斷PCP，會(huì)造成假陰性增加［7-9］。 因此僅靠病原學(xué)檢測(cè)很難得出正確的診斷。目前PCR法檢測(cè)肺孢子菌DNA片段被廣泛應(yīng)用于PCP的診斷。對(duì)多拷貝基因的檢測(cè)，如mtLSU rRNA或msg，使得PCP診斷的敏感性大大提高［4，6］。一些荷菌量很低無(wú)法通過(guò)病原學(xué)檢測(cè)查獲肺孢子菌的患者，也可通過(guò)PCR法完成實(shí)驗(yàn)室診斷［5］。經(jīng)過(guò)綜合考慮，我所采用病原學(xué)檢測(cè)與PCR法檢測(cè)相結(jié)合的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室PCP診斷。

由于GMS染色鏡檢法本身受到諸多因素影響，陽(yáng)性率不高，所以本文雖然以GMS染色鏡檢法為金標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算了PCR法檢測(cè)PCP的靈敏度，但是無(wú)法計(jì)算特異度。

已有文獻(xiàn)表明，針對(duì)HIV感染者PCP病例，咳痰標(biāo)本的病原檢出率僅為6％～30％，霧化吸入深部誘導(dǎo)痰液法能將檢出率提高到60％～72％；而選取BALF的病原檢出率可提高到98％～100％［10］。 本文的研究數(shù)據(jù)表明，采用GMS染色鏡檢法檢測(cè)深部誘導(dǎo)痰液和BALF標(biāo)本，陽(yáng)性檢出率都比較低，但相比而言，BALF 標(biāo)本更有利于肺孢子菌的檢出。同時(shí)，我們的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)分析也表明，采用PCR法檢測(cè)在不同送檢樣本類型中均具有相對(duì)較好的檢出率。因此將GMS染色鏡檢法和PCR法檢測(cè)相結(jié)合，更有利于PCP的實(shí)驗(yàn)室診斷。這提示，臨床一線醫(yī)務(wù)人員考慮患者PCP可能時(shí)，采集BALF比采集深部誘導(dǎo)痰得到的標(biāo)本更有利于PCP的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

隨著HIV感染者PCP預(yù)防性用藥措施的實(shí)施，該類人群在PCP發(fā)病率有所下降，目前PCP患者主要為非HIV感染者，如惡性腫瘤、器官移植或自身免疫性疾病等高危人群［5］。本文的送檢樣本中涉及到5類患者人群中，實(shí)驗(yàn)室采用GMS染色鏡檢法和PCR法相結(jié)合的檢測(cè)陽(yáng)性率，未知原因肺炎和器官移植患者陽(yáng)性率分別高達(dá)28.9％和26.6％。該數(shù)據(jù)對(duì)臨床醫(yī)生敲響了警鐘，不明原因發(fā)熱的診斷本就是目前醫(yī)學(xué)界的一個(gè)難題，在病因不明的情況下，機(jī)體免疫狀況發(fā)生改變合并PCP，將使得該類患者病因?qū)W診斷更加困難重重。因此，在非HIV陽(yáng)性患者中，接受免疫抑制劑治療的患者（特別是器官移植患者）繼發(fā)不明原因肺炎時(shí)，要考慮到PCP的可能。而對(duì)于未知發(fā)熱合并肺炎患者，實(shí)驗(yàn)室提供的肺孢子菌的檢測(cè)依據(jù)可能在患者診斷及救治中發(fā)揮重要作用。

PCP是接受化療的腫瘤患者和接受器官移植等細(xì)胞免疫功能低下患者最常見(jiàn)的感染性疾?。?1］。隨著人口老齡化以及器官移植的廣泛開(kāi)展，PCP發(fā)病率逐年增多［5］。我國(guó)大多數(shù)地區(qū)的醫(yī)生及檢驗(yàn)人員對(duì)PCP的了解甚少，易誤診為細(xì)菌性、病毒性、結(jié)核性或真菌性感染。因此，當(dāng)免疫功能受損患者或高齡慢性病患者出現(xiàn)發(fā)熱、干咳、呼吸困難且癥狀與體征不相符時(shí)，臨床醫(yī)師應(yīng)注意有無(wú)合并PCP的可能。對(duì)免疫功能正常的肺部感染但原因待查的患者也應(yīng)注意鑒別PCP，及早進(jìn)行鏡檢和（或）DNA檢測(cè)。

總之，實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展PCP檢測(cè)技術(shù)和結(jié)果判定對(duì)臨床醫(yī)師診斷和制定PCP的治療方案至關(guān)重要。目前肺孢子菌無(wú)法進(jìn)行體外培養(yǎng)，也限制其診斷方法的發(fā)展［12］。我們將PCR法與GMS染色鏡檢法相結(jié)合，提高了PCP的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)和水平，為PCP的臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)室參考依據(jù)，為該類患者能夠得到及時(shí)救治提供實(shí)驗(yàn)室支持。

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（2016-05-12收稿 2016-07-05修回）

（責(zé)任編委 曲 芬 本文編輯 張?jiān)戚x）

Etiological analysis of 1341 suspected cases without HIV positive of Pneumocystis pneumonia

LI Jing-jing ， ZOU Yang*， AN Yi-jun， QI Zhi-qun， LI Xiao-li， WANG Lei， HUANG Min-jun
Division of Parasitic Disease of Beijing Tropical Medicine Research Institute，Beijing Friendship Hospital Affiliated Capital Medical University， Beijing 100050， China

， E-mail: zouyang1027@163.com

Objective To discuss the positive rate of Pneumocystis pneumonia （PCP） patients specimens detected by gomori’s methenamine silver （GMS） staining and polymerase chain reaction （PCR） used so as to provide more supportable laboratory basis for clinical practice. Methods A total of 1314 cases of suspected PCP patients with deep induced sputum or broncho-alveolar lavage fluid （BALF） specimens were collected. GMS staining microscopy and PCR method were combined to detect pneumocystis， it could be identified as PCP in the event of any method showing positive. Results A total of 285 patients were diagnosed as PCP， 114 of whom were GMS staining microscopic staining positive， 282 cases were PCR positive， 111 cases were double positive detected by 2 methods， 3 cases were GMS positive staining microscopic alone （all BALF after renal transplantation）， and 171 cases of samples were PCR positive alone. In deep induced sputum specimens， GMS staining microscopy and PCR positive rates were 5.1％ and 16.2％ respectively （P＜0.05 and BALF）； And in BALF specimens， the positive rates were 23.3％ and 42.2％ respectively （P＜0.05）. Patients with unknown cause fever complicated with pneumonia and organ transplant patients receiving immunosuppressive therapy had higher positive detection rate. Conclusions The positive rate of PCP detected by PCR method is higher than that by GMS staining microscopy， and the detection of PCP by the combination of PCR method and GMS staining microscopy has higher diagnostic value for clinical guidance.

pneumocystis pneumonia； etiology； GMS staining； PCR

R519.8

A

1007-8134（2016）05-0272-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2016.05.004

北京市醫(yī)院管理局臨床技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目（XMLX201502）

100050，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 北京熱帶醫(yī)學(xué)研究所寄生蟲(chóng)病研究室（李晶晶、鄒洋、安亦君、齊志群、李小麗、王磊、黃敏君）；熱帶病防治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（李晶晶、鄒洋、安亦君、齊志群、李小麗、王磊、黃敏君）（李晶晶和鄒洋同為第一作者）

鄒洋，E-mail: zouyang1027@163.com