張樹永，陳　琛，馬慶偉，曲　芬

乙型肝炎抗病毒治療中的耐藥基因突變檢測技術(shù)

張樹永，陳琛，馬慶偉，曲芬

中國是乙型肝炎（乙肝）的高發(fā)國家，抗病毒治療藥物耐藥突變的早期發(fā)現(xiàn)對于接受抗病毒治療的乙肝患者至關(guān)重要。理想的臨床檢測方法應(yīng)具有靈敏度高、特異性高、重復(fù)性好、檢測結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡單、通量高、價格適中以及能定量檢測等特點，并可檢出樣本中的多種混合突變。本文根據(jù)上述臨床需求，就近年來出現(xiàn)的一些乙肝耐藥突變檢測技術(shù)進(jìn)行討論，并介紹一種基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法的新檢測技術(shù)。

乙型肝炎病毒；耐藥基因變異；MALDI-TOF MS

我國HBV慢性感染者約為9000萬，居世界之首，每年約100萬人死于HBV感染所致的肝硬化、肝衰竭及原發(fā)性肝癌［1-2］。因此，有效防治慢性乙型肝炎是一項長期而又艱巨的任務(wù)。在臨床治療慢性乙型肝炎的方案中，使用抗病毒藥物是最主要的手段。抗HBV藥物可分為干擾素和核苷（酸）類兩大類。干擾素由于不良反應(yīng)多、耐受性差，對于失代償期肝硬化及嚴(yán)重肝臟損害患者在臨床上也限制了其使用；而核苷（酸）類藥物以其便捷的服用方式，強(qiáng)大的抗病毒效力以及較小的不良反應(yīng)贏得了最大的市場［3］。但是核苷（酸）類藥物在抗HBV治療中須要長期服藥，一旦出現(xiàn)病毒耐藥，可能導(dǎo)致治療失敗、病毒DNA反彈、肝功能惡化以及病情加重。因此，如何早期、及時、準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)病毒耐藥，從而調(diào)整治療方案，減輕肝臟損害，指導(dǎo)遠(yuǎn)期治療，在慢性乙型肝炎臨床治療中具有極其重要的意義。

1 HBV耐藥形成原因

HBV耐藥性的產(chǎn)生與其病毒特性息息相關(guān)。HBV屬嗜肝病毒科，是已知真核細(xì)胞中最小的DNA病毒。其基因組全長約3200 bp，具有4個部分重疊的編碼區(qū)：包膜蛋白基因區(qū)（S區(qū)）、核心蛋白基因區(qū)（C區(qū)）、聚合酶基因區(qū)（P區(qū)）和X蛋白基因區(qū)（X區(qū)）［4］。而核苷（酸）類藥物的靶點正是P區(qū)的產(chǎn)物之一，HBV聚合酶［5-6］。核苷（酸）類藥物包括兩大類：嘧啶類似物和嘌呤類似物。其化學(xué)結(jié)構(gòu)與聚合酶的底物脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy ribonucleoside triphosphate，dNTP）相似，因此可以和dNTP競爭，抑制HBV聚合酶的活性，進(jìn)而抑制HBV的復(fù)制［7-8］。但是，由于HBV的逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能，在體內(nèi)復(fù)制過程中，上述4個編碼區(qū)域均可能產(chǎn)生核苷（酸）的錯配，所以慢性感染的病毒群體具有野生株和不同突變株混合存在的特征，且不同株間的比例經(jīng)常變動。一旦突變產(chǎn)生的位置造成了藥物靶點的改變，就會導(dǎo)致具有耐藥特征的突變株的出現(xiàn)。目前已知的核苷（酸）類藥物的耐藥突變均發(fā)生在HBV的P區(qū)中。所以，當(dāng)患者長期服用同一種抗病毒藥物時，會給體內(nèi)的混合病毒株產(chǎn)生一種選擇壓力，在野生株消亡的同時，耐藥突變株會大量繁殖，賦予HBV強(qiáng)大的適應(yīng)能力，造成了疾病控制的困難。

2 核苷（酸）類抗病毒藥物耐藥位點及臨床意義

目前我國主要的核苷（酸）類抗病毒藥物共有4種：阿德福韋酯（adefovir dipivoxil， ADV）、拉米夫定（lamivudine， LAM）、替比夫定（telbivudine，LDT）和恩替卡韋（entecavir， ETV）。LAM耐藥株多有YMDD區(qū)域rtM204的突變，伴或不伴有其他位點的突變，最常見的LAM耐藥突變?yōu)閞tM204V/I、rtVl73L和rtLl80M。ADV耐藥發(fā)生率較低，181和236位置的變異與ADV的臨床耐藥直接相關(guān)，以rtN236T和rtAl81V/T突變?yōu)橹鳌?ETV耐藥相關(guān)變異是在rtM204V+rtLl80M變異基礎(chǔ)上，再聯(lián)合rtTl84、rtS202或rtM250 3個位點中至少1個位點的氨基酸替代變異。LDT目前發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵的耐藥類型rtM204I，與LAM存在交叉耐藥［9-13］。

長期抗病毒治療必須要面對可能隨之而來的病毒耐藥問題，病毒耐藥以基因變異為基礎(chǔ)，繼而出現(xiàn)病毒學(xué)突破、反彈和生化學(xué)突破，從而導(dǎo)致治療失敗［14］，出現(xiàn)疾病進(jìn)展甚至出現(xiàn)肝功能失代償、重癥肝炎或死亡。另一方面，藥物之間的交叉耐藥以及病毒的多重耐藥也會給后續(xù)治療的藥物選擇帶來極大的困難。隨著核苷（酸）類抗病毒藥物的普及和用藥時間延長，HBV耐藥株帶來的問題日益嚴(yán)重，在慢性乙型肝炎治療過程中密切監(jiān)測耐藥突變，成為耐藥管理的重要環(huán)節(jié)。

3 耐藥基因突變檢測技術(shù)的發(fā)展

得益于1983年Mullis發(fā)明的PCR技術(shù)，基因突變檢測在此后的30多年間得到了蓬勃的發(fā)展，隨著技術(shù)的不斷升級促生了多種檢測方法。

3.1限制性片段長度多態(tài)性法（restriction fragment length polymorphism， RFLP） RFLP是以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測方法。此方法在進(jìn)行PCR時，在突變位點引入限制性酶切位點，然后待PCR擴(kuò)增完成后使用限制性酶切分析片段長度，最后根據(jù)片段長度分析突變類型［15］。RFLP法應(yīng)用廣泛，靈敏度約為10％，但針對每個耐藥位點以及每個位點的每種突變都須要單獨設(shè)計PCR引物與限制性內(nèi)切酶位點，因此檢測結(jié)果會受到限制性內(nèi)切酶功能狀態(tài)、酶反應(yīng)條件的限制，且只能檢測單一突變位點，耐藥監(jiān)測范圍有限。

3.2多溫度單鏈構(gòu)象多態(tài)性法（multitemperature single-strand conformation polymorphism，MSSCP） MSSCP同樣是一種基于凝膠電泳的檢測方法。與RFLP法不同，MSSCP在非變性聚丙烯酰胺凝膠上利用了單鏈DNA 在中性條件下會形成二級結(jié)構(gòu)的特性，不同的二級結(jié)構(gòu)在電泳中會出現(xiàn)不同的遷移率。這種二級結(jié)構(gòu)依賴于堿基的組成，單個堿基的改變也會影響其構(gòu)象，最終會導(dǎo)致在凝膠上遷移速度的改變。由于該方法簡單快速，檢測靈敏度約為5％［16］，因而被廣泛運(yùn)用于未知基因突變的檢測。其弊端在于不能確定突變類型和具體位置。

3.3直接測序法和克隆測序法 直接測序法是目前最常用的耐藥檢測方法之一，也是不同檢測方法進(jìn)行對比時的金標(biāo)準(zhǔn)。其原理是將HBV基因組的逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)（P區(qū)）進(jìn)行擴(kuò)增后直接進(jìn)行測序分析。此方法最大的優(yōu)勢在于可同時檢測目的條帶中的已知和未知突變位點信息，最大的問題是檢測耗時長且靈敏度低，只有當(dāng)突變株超過總病毒量約20％以上時才可檢出［17］。與其類似的克隆測序法通過將患者血清PCR產(chǎn)物連接質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化細(xì)菌，再選取轉(zhuǎn)化成功的菌落進(jìn)行測序。與直接測序相比，經(jīng)過此方法得到的測序結(jié)果來源于同一個病毒，靈敏度有了很大的提高，但因其步驟繁瑣、耗時長、成本高等原因，不適合臨床檢驗使用。

3.4線性探針分析法（line probe assay， LiPA） LiPA是反向雜交技術(shù)的一種。在PCR步驟完成后，利用特異性探針對突變進(jìn)行檢測。這種方法重復(fù)性和特異性好，檢測靈敏度約為10％［18-19］，不足在于手動檢測操作步驟繁瑣，依靠肉眼對結(jié)果進(jìn)行判讀，主觀性較大。如使用自動化儀器進(jìn)行檢測，則儀器及配套試劑價格昂貴。

3.5基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)在其經(jīng)過特殊處理的撥片上錨定了多種針對突變位點的探針，特異性的PCR產(chǎn)物與探針雜交后經(jīng)過洗脫去除游離狀態(tài)的核苷酸序列后再在微排列掃描儀上掃描，并用軟件分析確定耐藥的類型，檢測靈敏度可達(dá)到10％。該技術(shù)最大的優(yōu)勢是通量極高，國外曾有研究小組在此平臺基礎(chǔ)上開發(fā)了同時檢測245種耐藥突變的檢測方法［20］，但由于此方法的芯片制作成本較高，因此臨床無法普及。另外，基因芯片技術(shù)對實驗人員的操作要求較高，其結(jié)果易受到背景熒光噪音的干擾。

3.6熒光定量PCR技術(shù) 實時熒光定量PCR（real-time PCR）是目前臨床除測序法外使用最廣泛的一種基因突變檢測技術(shù)。其檢測結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡便、成本低廉、耗時短等特點滿足了臨床需求，靈敏度約為10％，最低檢測濃度約為1000 IU/ml［21］。由于該技術(shù)使用的檢測儀器熒光通道數(shù)量有限，因此限制了其通量的提高，同一反應(yīng)孔內(nèi)僅可同時檢測2個突變位點和1個內(nèi)標(biāo)。目前臨床與HBV耐藥相關(guān)的已知常見突變位點有十余個，若全部檢測則每個樣品須要制備6～8管反應(yīng)液，大大增加了操作工作量和起始DNA模板量。另外，該技術(shù)每個位點的不同變異均須合成相應(yīng)的熒光探針，合成探針費用較高，而且由于HBV序列的變異以及存在二級結(jié)構(gòu)，有少于10％的序列無法與探針結(jié)合，從而影響到檢測的靈敏度。

3.7核酸質(zhì)譜檢測技術(shù) 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry， MALDITOF MS）是近年來應(yīng)用于臨床核酸檢測的新型軟電離生物質(zhì)譜。 基本原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程，然后在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時間不同而被檢測，測定離子的質(zhì)荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比，最后將飛行時間轉(zhuǎn)化為分子量并通過分析軟件得出檢測結(jié)果。與臨床常用的蛋白質(zhì)質(zhì)譜相比，核酸質(zhì)譜檢測技術(shù)在MALDITOF 的原理基礎(chǔ)上專門針對雙鏈DNA的特性進(jìn)行了特殊優(yōu)化，使得樣品在電離過程中不產(chǎn)生或產(chǎn)生較少的碎片離子，更適用于核酸大分子混合物的測定［22］。

與上述多種基因突變檢測技術(shù)相比，核酸質(zhì)譜平臺具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等特點，可在pmol水平上鑒別僅1個堿基差別的不同DNA片段。多重PCR技術(shù)的應(yīng)用和多種芯片規(guī)格，使得此技術(shù)可適應(yīng)低、中、高多種通量的臨床需求，完整檢測流程約耗時8 h。近年來，多個國內(nèi)外研究小組在核酸質(zhì)譜平臺進(jìn)行了檢測方法的開發(fā)并對該平臺的檢測靈敏度、特異性等指標(biāo)與其他基因突變檢測平臺進(jìn)行了對比。Kim等［23］利用質(zhì)譜平臺建立了HBV耐藥基因突變檢測體系，經(jīng)質(zhì)粒驗證該方法檢測靈敏度約為1％。后續(xù)的60份臨床樣本檢測結(jié)果顯示，核酸質(zhì)譜平臺與LiPA的一致性為95％（57/60），剩余3例樣本中的耐藥突變由于含量較低，LiPA方法未檢出。Rybicka等［24］開發(fā)的質(zhì)譜檢測平臺可同時檢測37個耐藥突變位點，檢測靈敏度與Kim等［23］研究結(jié)果相近，約為1％。該小組還利用82個臨床樣品對比了MSSCP、測序以及LiPA等多種方法（見表1）。結(jié)果顯示，直接測序法檢出率不足6％，LiPA反向雜交法檢出率低于21％，而MSSCP和核酸質(zhì)譜檢出率均為51.2％，二者一致性達(dá)98％。惟一1例MSSCP與質(zhì)譜檢測結(jié)果不同的樣品經(jīng)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該樣品中突變株的含量約為1％，超出MSSCP檢測范圍，從而造成漏檢。

表1　核酸質(zhì)譜、MSSCP、LiPA和直接測序法的乙肝YMDD多態(tài)性檢測對比Table 1 Comparison of YMDD polymorphism detection of HBV using MALDI-TOF MS， MSSCP， LiPA and direct sequencing

4 展 望

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療概念的提出，未來耐藥基因突變檢測的趨勢也將由現(xiàn)有的定性檢測發(fā)展至未來的定量檢測。核酸質(zhì)譜是目前惟一能對每一個檢測位點分別進(jìn)行耐藥突變定量檢測的技術(shù)，其檢測結(jié)果可發(fā)現(xiàn)＞1％的突變比例，因此可將其應(yīng)用于臨床治療中的早期耐藥監(jiān)測。耐藥突變定量檢測的出現(xiàn)，可在未來為個性化臨床治療方案的制定及調(diào)整提供極其重要的依據(jù)，對提高治療效果具有重要意義。

綜上所述，現(xiàn)有HBV耐藥基因突變檢測方法多種多樣，但在實際臨床應(yīng)用中選擇一個合適的耐藥突變檢測方法必須進(jìn)行多方位的考慮。目前主要的耐藥突變檢測方法大多具有通量較低、成本高、技術(shù)和設(shè)備要求高、操作繁瑣和耗時費力等缺點，不利于在基層醫(yī)院應(yīng)用。而新出現(xiàn)的MALDI-TOF MS核酸質(zhì)譜檢測成本與熒光定量PCR相近，操作簡便，可同時檢測數(shù)十個位點，數(shù)據(jù)分析簡單直觀。質(zhì)譜平臺對HBV基因耐藥突變檢測靈敏度為1％，遠(yuǎn)高于其他方法，可更早檢出與抗病毒藥物耐藥相關(guān)的HBV變異，更早發(fā)現(xiàn)耐藥的產(chǎn)生。

［1］ 王貴強(qiáng)，王福生，成軍，等. 慢性乙型肝炎防治指南（2015年版） ［J］. 中華實驗和臨床感染病雜志（電子版），2015，9（5）:1-18.

［2］ 丁善龍，王杰，魯鳳民. 乙型肝炎研究及我國防治現(xiàn)狀［J］.傳染病信息，2013，26（6）:368-372.

［3］ 姚偉明，徐東平. 抗HBV藥物靶位的研究進(jìn)展［J］. 傳染病信息， 2013，26（6）:323-326.

［4］ Zhang Q， Cao G. Genotypes， mutations， and viral load of hepatitis B virus and the risk of hepatocellular carcinoma: HBV properties and hepatocarcinogenesis［J］. Hepat Mon， 2011， 11（2）:86-91.

［5］ Cento V， Mirabelli C， Dimonte S， et al. Overlapping structure of hepatitis B virus （HBV） genome and immune selection pressure are critical forces modulating HBV evolution［J］. J Gen Virol， 2013，94（Pt 1）:143-149.

［6］ Delaney WE . Molecular virology of chronic hepatitis B and C: parallels， contrasts and impact on drug development and treatment outcome［J］. Antiviral Res ， 2013， 99（1）:34-48.

［7］ Wang XY， Wei ZM， Wu GY， et al. In vitro inhibition of HBV replication by a novel compound， GLS4， and its efficacy against adefovir-dipivoxil-resistant HBV mutations［J］. Antivir Ther，2012， 17（5）:793-803.

［8］ Fung J， Lai CL， Seto WK， et al. Emerging drugs for the treatment of hepatitis B［J］. Expert Opin Emerg Drugs， 2016， 21（2）:183-193.

［9］ 許智慧，劉妍，徐東平. 針對不同靶點的抗HBV新藥研究進(jìn)展［J］. 傳染病信息，2015，28（5）:257-261， 283.

［10］ Menéndez-Arias L， álvarez M， Pacheco B. Nucleoside/nucleotide analog inhibitors of hepatitis B virus polymerase: mechanism of action and？resistance［J］. Curr Opin Virol， 2014， 8:1-9.

［11］ Yang S， Xing H， Wang Q， et al. De novo entecavir+adefovir dipivoxil+lamivudine triple-resistance mutations resulting from sequential therapy with adefovir dipivoxil， and lamivudine［J］. Ann Clin Microbiol Antimicrob， 2016， 15（1）:24.

［12］ Yin F， Wu Z， Fang W， et al. Resistant mutations and quasispecies complexity of hepatitis B virus during telbivudine treatment［J］. J Gen Virol， 2015 ， 96（11）:3302-3312.

［13］ Sun M， Tan G， Song J， et al. Profile of HBV plymerase gene mutations during entecavir treatment in patients with chronic hepatitis B［J］. Clin Res Hepatol Gastroenterol， 2016 ， S2210-7401（16）30031-6.

［14］ Salpini R， Alteri C， Cento V， et al. Snapshot on drug-resistance rate and profiles in patients with chronic hepatitis B receiving nucleos（t）ide analogues in clinical practice［J］. J Med Virol，2013， 85（6）:996-1004.

［15］ 孫劍，侯金林，肖蕾，等. 三種乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥突變的酶切分析方法及其應(yīng)用［J］.中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2003，17（1）:18-20.

［16］ Kaczanowski R， Trzeciak L， Kucharczyk K. Multitemperature single-strand conformation polymorphism ［J］. Electrophoresis，2001， 22（16）:3539-3545.

［17］ Zoulim F. New nucleic acid diagnostic tests in viral hepatitis［J］. Semin Liver Dis， 2006， 26（4）:309-317.

［18］ Ozekinci T， Mese S， Ozbek E， et al. Lamivudine and adefovir motif variants detected in chronic Hepatitis B patients［J］. Clin Ter，2014， 165（1）:13-17.

［19］ Vutien P， Trinh HN， Garcia RT， et al. Mutations in HBV DNA polymerase associated with nucleos（t）ide resistance are rare in treatment-naive patients［J］. Clin Gastroenterol Hepatol， 2014，12（8）:1363-1370.

［20］ Chan K， Yam I， Yuen J， et al. A comprehensive HBV array for the detection of HBV mutants and genotype［J］. Clin Biochem，2011， 44（14-15）:1253-1260.

［21］ Rahimi R， Hosseini SY， Fattahi MR， et al. YMDD motif mutation profile among patients receiving liver transplant due to hepatitis B virus infection with long term lamivudine/immunoglobulin therapy［J］. Hepat Mon， 2015， 15（7）:e27120.

［22］ 毛遠(yuǎn)麗， 秦建成， 李波. 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)在感染性疾病病原及耐藥檢測中的應(yīng)用［J］. 傳染病信息， 2014，27（5）:270-273，278.

［23］ Kim HS， Han KH， Ahn SH， et al. Evaluation of methods for monitoring drug resistance in chronic hepatitis B patients during lamivudine therapy based on mass spectrometry and reverse hybridizationp［J］. Antivir Ther， 2005， 10（3）:441-449.

［24］ Rybicka M， Stalke P， Dreczewski M， et al. High-throughput matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry as an alternative approach to monitoring drug resistance of hepatitis B virus［J］. J Clin Microbiol， 2014，52（1）:9-14.

（2016-03-11收稿 2016-05-12修回）

（責(zé)任編委 李 軍 本文編輯 胡 玫）

Techniques for HBV drug-resistant mutation detection during antiviral therapy

ZHANG Shu-yong， CHEN Chen， MA Qing-wei， QU Fen*
Clinical Laboratory Center， 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China

，E-mail: qf302@163.com

China is a country with high incidence of hepatitis B （HBV）. The early detection of antiviral drug resistance mutations in patients with hepatitis B is essential for the treatment of hepatitis B patients. Theoretically， the ideal clinical detection method should be with high sensitivity and high specificity， good repeatability， accurate detection results and also has the advantages of simple operation， high flux，moderate price， available quantitative detection， and can detect a variety of mixed mutations in samples. In this paper， based on the above clinical requirements， the authors have discussed the detection technology of hepatitis B drug-resistance mutations in recent years， and introduced a new detection technology based on matrix-assisted laser desorption /ionization time- of -flight mass spectrometry（MALDI-TOF MS）.

HBV； drug-resistant genetic variation； MALDI-TOF MS

R51

A

1007-8134（2016）05-0311-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2016.05.014

首都市民健康培育課題（Z151100003915151）

100039 北京，解放軍第三○二醫(yī)院臨床檢驗中心（張樹永，曲芬）；100853 北京，解放軍總醫(yī)院臨床檢驗科（陳琛）；102206，北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司（馬慶偉）

曲芬，E-mail: qf302@163.com