郭 森， 朱 江， 王永為， 楊松鶴， 孔祥玉

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丁苯酞對(duì)缺血大鼠大腦皮質(zhì)中鈣通道Cav1.3表達(dá)的影響

郭 森1， 朱 江2， 王永為1， 楊松鶴1， 孔祥玉1

目的 探討丁苯酞對(duì)腦缺血大鼠大腦皮質(zhì)中鈣通道Cav1.3表達(dá)的影響及其腦保護(hù)作用的機(jī)制。方法 雄性Wistar大鼠36只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血對(duì)照組和丁苯酞治療組，每組12只。采用免疫組織化學(xué)方法和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測(cè)各組大鼠大腦皮質(zhì)中鈣通道Cav1.3表達(dá)的情況。采用TUNEL 法觀察大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果 與缺血對(duì)照組比較，丁苯酞治療組大鼠大腦皮質(zhì)中鈣通道Cav1.3表達(dá)有所增加(P<0.05)，但仍低于假手術(shù)組(P<0.05)，大腦皮質(zhì)中凋亡神經(jīng)元數(shù)量丁苯酞治療組明顯少于缺血對(duì)照組但多于假手術(shù)組(P<0.05)。結(jié)論 丁苯酞可以抑制缺血造成的腦皮質(zhì)中鈣通道Cav1.3表達(dá)的減少，減少缺血后大腦皮質(zhì)中的神經(jīng)元凋亡。

丁苯酞； 腦缺血； 大腦皮質(zhì)； L型鈣通道； 大鼠

L型鈣通道是電壓依賴型鈣通道，可進(jìn)一步分為Cav1.1、Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4 4個(gè)亞型。Cav1.3鈣通道主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，參與鈣穩(wěn)態(tài)、激素分泌、基因表達(dá)和突觸可塑性等多種功能的調(diào)控，并在神經(jīng)元的存活和死亡中有重要作用[1]。

丁苯酞(n-butylphthalide，NBP)，是我國(guó)具有獨(dú)立自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國(guó)產(chǎn)I 類(lèi)化學(xué)新藥，可以通過(guò)提高腦血流量、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡、抑制氧化應(yīng)激、減輕腦水腫等諸多途徑對(duì)抗缺血后所造成的神經(jīng)元損傷[2～5]。多年以來(lái)對(duì)其作用機(jī)制的研究一直廣受關(guān)注，本項(xiàng)目應(yīng)用免疫組織化學(xué)和蛋白印跡的方法，對(duì)丁苯酞在腦組織缺血過(guò)程中神經(jīng)元鈣通道Cav1.3表達(dá)方面的影響進(jìn)行研究，以探討丁苯酞在腦缺血過(guò)程中通過(guò)鈣通道Cav1.3途徑發(fā)揮保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及用藥 SPF級(jí)Wistar成年健康雄性大鼠，200～220 g，36只大鼠隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組、缺血對(duì)照組和丁苯酞治療組，每組12只，其中6只用于制作免疫組化標(biāo)本，6只用于制作蛋白印跡標(biāo)本。缺血組大鼠阻斷左側(cè)椎動(dòng)脈和雙側(cè)頸總動(dòng)脈。假手術(shù)組只暴露左側(cè)椎動(dòng)脈和雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不予阻斷。丁苯酞治療組大鼠術(shù)后，使用玻璃注射器進(jìn)行腹腔注射丁苯酞注射液(2ml/kg)，其余各組大鼠給予等量的生理鹽水腹腔注射。

1.2 主要藥品及試劑 丁苯酞氯化鈉注射液(中國(guó)石家莊制藥集團(tuán)有限公司)，兔源性抗Cav1.3抗體(購(gòu)自abcam公司)，生物標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(購(gòu)自北京中杉金橋公司)，小鼠源性抗β-actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體、總蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光底物(均購(gòu)自武漢博士德公司)，TUNEL試劑盒(購(gòu)自羅氏公司)。

1.3 大鼠腦缺血模型的制備 結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈：Wistar大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mg/kg)，仰位固定于手術(shù)操作臺(tái)上，頸部正中切口，鈍性分離胸鎖乳突肌及氣管旁血管和神經(jīng)，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈并結(jié)扎切斷，檢查無(wú)活動(dòng)性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。

電凝左側(cè)椎動(dòng)脈：Wistar大鼠俯位固定于手術(shù)操作臺(tái)上，于第1頸椎水平沿后正中線切開(kāi)皮膚，逐層分離肌肉，暴露第1頸椎橫突孔，將高頻電刀的電凝刀頭插入左側(cè)橫突孔內(nèi)電凝椎動(dòng)脈2 s，重復(fù)一次。檢查無(wú)活動(dòng)性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。蘇醒后，保溫飼養(yǎng)24 h。

1.4 標(biāo)本的采集

1.4.1 免疫組化標(biāo)本的采集 各組大鼠于相應(yīng)時(shí)段后，腹腔內(nèi)注射10%的水合氯醛麻醉(350 mg/kg)，開(kāi)胸行主動(dòng)脈插管，以200 ml生理鹽水經(jīng)主動(dòng)脈快速?zèng)_洗，隨后灌入4%多聚甲醛400 ml，固定，取出腦組織。組織后固定一夜，30%蔗糖中浸至組織下沉后行冠狀切面冷凍切片(厚40 μm)。

1.4.2 Western blot標(biāo)本的采集 各組大鼠于相應(yīng)時(shí)段后，腹腔內(nèi)注射10%的水合氯醛麻醉(350 mg/kg)，迅速斷頭取腦，PBS清洗血液，濾紙吸干表面液體，分提出大腦皮質(zhì)，稱重，組織勻漿，提取蛋白，BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。蛋白樣品-80 ℃保存。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 切片在0.01 mol/L PBS中漂洗10 min×2，含0.3%H2O2的PBS中30 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS中漂洗10 min ×3，含5%山羊血清2%BSA(Bovine Serum Albumin)的PBST(含0.1%TritonX-100 的0.01 mol/L PBS)封閉2 h，兔源性抗Cav1.3抗體(1∶200)4 ℃孵育過(guò)夜，切片在PBST中漂洗15 min × 4，生物標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(1∶400)室溫孵育1 h，PBST中漂洗10 min×3，親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(1∶100)室溫孵育1 h，PBS中漂洗10 min×3，在0.05% DAB 顯色液(0.05% DAB，0.03% H2O2，0.01 mol/L PBS緩沖液) 顯色7 min，貼片后，常規(guī)脫水、透明、封片。

1.6 Western blot步驟 6%SDS-PAGE凝膠電泳(120 V，2.5 h)，轉(zhuǎn)膜(300 mA，2 h)，蛋白上樣量100 μg，5%BSA中封閉2 h，兔源性抗Cav1.3抗體(1∶500)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗10 min×3，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(1∶2000)室溫孵育1 h，TBST漂洗10 min×3，ECL超敏發(fā)光液顯影。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 按原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，DAB顯色。細(xì)胞核中有黃褐色顆粒者為T(mén)UNEL陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。

1.8 圖像分析 免疫組織化學(xué)染色和細(xì)胞凋亡檢測(cè)的圖像采集時(shí)，嚴(yán)格保持照相條件的一致。照片輸入Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件，進(jìn)行圖像處理。免疫組織化學(xué)染色照片，各組均取相同皮質(zhì)部位，分析皮質(zhì)染色的平均光密度。細(xì)胞凋亡檢測(cè)的照片，各組均取相同皮質(zhì)部位，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。

蛋白印跡的膠片掃描后，采用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)顯影條帶進(jìn)行分析，以目的條帶和β-actin條帶的IOD比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 鈣通道Cav1.3 免疫組織化學(xué)染色 切片中鈣通道Cav1.3被染成棕黃色顆粒，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)各層中均有大量鈣通道Cav1.3表達(dá)(見(jiàn)圖1A)；缺血對(duì)照組大鼠大腦皮質(zhì)中各層中鈣通道Cav1.3表達(dá)明顯減少(見(jiàn)圖1B)；丁苯酞治療組大鼠大腦皮質(zhì)中鈣通道Cav1.3表達(dá)與缺血對(duì)照組相比有明顯增加，但仍少于假手術(shù)組(見(jiàn)圖1C)(見(jiàn)表1)。

2.2 TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞 切片中細(xì)胞核中有黃褐色顆粒者為T(mén)UNEL陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。各組皮質(zhì)中均可見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，假手術(shù)組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，且染色較淺邊界不清(見(jiàn)圖1D)；缺血對(duì)照組大鼠大腦皮質(zhì)中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量多，染色深邊界清晰(圖1E)；丁苯酞治療組皮質(zhì)中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較缺血對(duì)照組有所減少，但仍明顯多于假手術(shù)組(見(jiàn)圖1F)。各組間TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量差異有顯著性(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

組別鈣通道Cav1.3染色OD值凋亡細(xì)胞假手術(shù)組缺血對(duì)照組丁苯酞治療組336.82±53.14123.03±19.58*204.68±16.27*△16.37±3.2839.14±4.03*26.83±3.92*△

與假手術(shù)組比較*P<0.05，與缺血對(duì)照組比較△P<0.05

A：假手術(shù)組鈣通道Cav1.3表達(dá)；B：缺血對(duì)照組鈣通道Cav1.3表達(dá)；C：丁苯酞治療組鈣通道Cav1.3表達(dá)；D：假手術(shù)組凋亡細(xì)胞；E：缺血對(duì)照組凋亡細(xì)胞；F：丁苯酞治療組凋亡細(xì)胞

圖1 大鼠大腦皮質(zhì)鈣通道Cav1.3免疫組織化學(xué)染色和TUNEL凋亡細(xì)胞檢測(cè)

2.3 蛋白印跡檢測(cè)鈣通道Cav1.3表達(dá) 大鼠大腦皮質(zhì)中鈣通道Cav1.3表達(dá)情況(見(jiàn)圖2、圖3)，丁苯酞治療組大鼠大腦皮質(zhì)中Cav1.3與β-actin IOD比值明顯大于缺血對(duì)照組大鼠(P<0.05)，但仍小于假手術(shù)組大鼠(P<0.05)，提示丁苯酞對(duì)于缺血后大鼠腦組織中的鈣通道Cav1.3有保護(hù)作用。

1：假手術(shù)組；2：缺血對(duì)照組；3：丁苯酞治療組

與假手術(shù)組比較*P<0.05；與缺血對(duì)照組比較△P<0.05

3 討 論

在缺血性神經(jīng)元損傷的過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載是公認(rèn)的啟動(dòng)細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素。而細(xì)胞外的Ca2+內(nèi)流是形成胞內(nèi)Ca2+超載的主要原因。L-型鈣通道是電壓依賴性鈣通道，有α1、α2、β、δ和γ5個(gè)亞單位組成。根據(jù)編碼α1亞單位的基因，L-型鈣通道又可分為Cav1.1、Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4 4種類(lèi)型。其中Cav1.3在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有著較為廣泛的分布，其在Ca2+超載過(guò)程中的作用一直廣受關(guān)注[2～5]。以往有研究顯示，缺血狀態(tài)下大鼠大腦皮質(zhì)中的L-型鈣通道開(kāi)放明顯增加，提示L-型鈣通道可能是Ca2+內(nèi)流的主要通道[6]。同時(shí)L-型鈣通道拮抗劑在缺血早期對(duì)神經(jīng)元保護(hù)作用的相關(guān)研究也支持上述觀點(diǎn)[7]。

但在本研究中L-型鈣通道Cav1.3在大鼠大腦皮質(zhì)中的表達(dá)并未隨缺血損傷的加重而增加，反而呈現(xiàn)出表達(dá)減少的趨勢(shì)。出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能基于下述兩個(gè)原因。(1)L-型鈣通道Cav1.3在正常神經(jīng)元中參與多種重要的生理功能，如神經(jīng)元的基因調(diào)節(jié)，神經(jīng)元的發(fā)育過(guò)程等。Hirtz等在他們的研究中就曾指出，鈣通道Cav1.3在小鼠與聽(tīng)覺(jué)相關(guān)的腦干發(fā)育過(guò)程中起重要作用[8]。Nunez-Santana等的研究也顯示，在年老大鼠的海馬中鈣通道Cav1.3總的表達(dá)是減少的[9]。缺血會(huì)對(duì)神經(jīng)元的正常功能造成嚴(yán)重的影響。這種影響的機(jī)制是多方面的，而鈣通道Cav1.3功能和表達(dá)的改變是很難被我們排除在這些機(jī)制以外的。特別是在持續(xù)的慢性缺血過(guò)程中，鈣通道Cav1.3的變化很可能不同于急性缺血性損傷，它對(duì)神經(jīng)元的影響也不會(huì)只局限于Ca2+超載這一個(gè)方面，其在正常神經(jīng)元中所參與的生理功能的紊亂可能是造成神經(jīng)元損傷更重要的機(jī)制。(2)對(duì)于Ca2+在缺血性神經(jīng)元損傷中的作用，近期也有了一些不同的觀點(diǎn)，認(rèn)為降低胞內(nèi)Ca2+，反而會(huì)促進(jìn)凋亡。已有報(bào)道指出，大腦皮質(zhì)神經(jīng)元長(zhǎng)期接觸L-型鈣通道拮抗劑，使胞內(nèi)Ca2+降低可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[10]，而L-型鈣通道激動(dòng)劑Bay K8644可以阻斷缺糖缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[11]。由此可以推斷，在慢性缺血過(guò)程中鈣通道Cav1.3表達(dá)的減少也可能正是其導(dǎo)致遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的原因。這也正可以解釋L-型鈣通道拮抗劑在神經(jīng)保護(hù)作用方面所引起的爭(zhēng)議[12]。

L-鈣通道Cav1.3雖近幾年已被許多研究人員所關(guān)注，但對(duì)其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)所執(zhí)行的具體功能還有待進(jìn)一步的研究和探索。

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Effects of n-butylphthalide on expression of calcium channel Cav1.3 in ischemic cerebral cortex in rats

GUOSen，ZHUJiang，WANGYongwei，etal.

(DepartmentofHumanAnatomy，AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege，Chengde067000，China)

Objective To investigate the effects of n-butylphthalide on expression of calcium channel Cav1.3 in ischemic cerebral cortex in rats. Methods 36 Male Wistar rats were divided randomly into three groups：a sham group，an ischemia group and a butylphthalide treating group. There were 12 rats in each group. Immunohistochemical staining and Western blotting were used to detect expression of calcium channel Cav1.3.Tunel was used to show the apoptosis in cerebral cortex. Results Compared with the rats in sham group，the expression of calcium channel Cav1.3 decreased obviously in the ischemia group and butylphthalide treating group. Compared with the rats in the ischemia group，the expression of calcium channel Cav1.3 increased obviously in the butylphthalide treating group. In butylphthalide treating group neural apoptosis were was less than in ischemia group，but more than in sham group. Conclusion The n-butylphthalide can restrain the decline of expression of calcium channel Cav1.3 in ischemia cerebral cortex，and reduce apoptosis of neurons.

N-butylphthalide； Ischemia； Cerebral cortex； L-type calcium channel； Rat

1003-2754(2016)01-0038-04

2015-11-10；

2015-12-29

河北省教育廳資助項(xiàng)目(No.QN20131075)

(1.承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000)

郭 森，E-mail：guosen2004@126.com

R743

A