馬超++鄭德斌++賈磊++張博++肖廣俠

摘 要：天津半滑舌鰨工廠化水產(chǎn)養(yǎng)殖已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了快速的發(fā)展，本文對(duì)A1（漢沽地區(qū)養(yǎng)殖所用水源）、A2（漢沽區(qū)域流水式養(yǎng)殖水體）、B1（漢沽區(qū)域循環(huán)水系統(tǒng)處理水體）、B2（漢沽區(qū)域循環(huán)水系統(tǒng)養(yǎng)殖水體1）、Bb（漢沽區(qū)域循環(huán)水系統(tǒng)病魚專養(yǎng)池養(yǎng)殖水體）、C1（大港區(qū)域循環(huán)水系統(tǒng)處理水體）、C2（大港區(qū)域循環(huán)水系統(tǒng)養(yǎng)殖水體1）、Cb（大港區(qū)域循環(huán)水系統(tǒng)病魚專養(yǎng)池養(yǎng)殖水體）8個(gè)養(yǎng)殖區(qū)域的微生物，利用宏基因組技術(shù)對(duì)微生物多樣性進(jìn)行研究，初步獲取微生物遺傳信息。分析方法主要為對(duì)16S rRNA的高變區(qū)V3區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)拼接后的序列進(jìn)行分析，包括OTUs（Operational Taxonomic Uints）的提取、alpha多樣性分析、beta多樣性分析等。通過分析可知8個(gè)養(yǎng)殖區(qū)域的微生物多樣性之間存在著一定的差異。

關(guān)鍵詞：半滑舌鰨養(yǎng)殖；水體微生物；多樣性分析

中圖分類號(hào)： S966 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20160832010

目前野生半滑舌鰨數(shù)量驟減，大部分都為養(yǎng)殖品種。半滑舌鰨工廠化養(yǎng)殖是天津水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一。其經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，適合工廠化養(yǎng)殖，在我國(guó)已形成了較大的養(yǎng)殖規(guī)模。半滑舌鰨的養(yǎng)殖環(huán)境與半滑舌鰨的生長(zhǎng)及病害發(fā)生息息相關(guān)，因此分析工廠化養(yǎng)殖半滑舌鰨水環(huán)境中微生物的多樣性，對(duì)于研究半滑舌鰨的生長(zhǎng)和病害發(fā)生有著重要意義。

本文利用宏基因組技術(shù)對(duì)天津市工廠化養(yǎng)殖半滑舌鰨的水環(huán)境中的微生物多樣性進(jìn)行研究，初步獲取微生物遺傳信息，解讀半滑舌鰨養(yǎng)殖水環(huán)境中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類群及其豐度，揭示半滑舌鰨工廠化養(yǎng)殖水環(huán)境中的菌群特征，分析其菌群的組成和功能。探討?zhàn)B殖水環(huán)境微生物群落同魚病之間的關(guān)系，探求微生物群落對(duì)魚體健康的影響，以期從養(yǎng)殖池原位環(huán)境鑒定并篩選具有潛在益生作用的功能微生物。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 從樣品中提取總DNA后，針對(duì)16S rRNA的高變區(qū)V3區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增

對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行提純，末端修復(fù)，連上接頭、測(cè)序引物后，采用IlluminaMiSeq進(jìn)行測(cè)序。

1.2 分析流程

對(duì)于測(cè)序所得到的序列，通過去除低質(zhì)量、接頭污染等過程完成數(shù)據(jù)過濾，得到可信的目標(biāo)序列，用于后續(xù)分析。過濾后的序列，稱為Clean data或Clean Reads，將雙端測(cè)序相應(yīng)的read1與read2（read1與read2是指分別從5和3端2個(gè)方向測(cè)序所得到的序列片段）進(jìn)行拼接；利用軟件QIIME 1.8.0版本對(duì)拼接后的序列進(jìn)行分析，包括OTUs（Operational Taxonomic Uints）的提取、alpha多樣性分析、beta多樣性分析等。

2 結(jié)果分析

2.1 數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計(jì)

某些原始序列帶有adapter序列，或含有少量低質(zhì)量序列。經(jīng)過一系列數(shù)據(jù)過濾處理以去除雜質(zhì)數(shù)據(jù)，得到Clean Reads。Raw Reads包含低質(zhì)量的序列、接頭污染的序列、含N比例大于5%的序列，以及Clean Reads。Clean Reads所占的比例越高，數(shù)據(jù)質(zhì)量越好，根據(jù)每種序列所占的比例繪制如下柱狀圖，可以直觀地反映數(shù)據(jù)過濾情況。

2.2 數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾得到Clean Data，下圖為本項(xiàng)目全部樣本的Clean Data數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)圖，可以很直觀看出Clean Data數(shù)據(jù)量已滿足要求。

2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量值分布

為了反映Clean Data的質(zhì)量，以保證分析的準(zhǔn)確性，以Q30/Q20堿基百分比作為指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，Q30/Q20堿基百分比越大說明測(cè)序錯(cuò)誤率小于0.1%/1%的堿基在總堿基中的比例越大。下圖以所有樣本為橫軸，以Q30百分比作為對(duì)應(yīng)的縱軸直觀地反映了最終過濾后的數(shù)據(jù)質(zhì)量，同時(shí)也反映了過濾后各個(gè)樣本的質(zhì)量的均一性（每個(gè)樣本的Q30堿基百分比相近）。

為了粗略反映測(cè)序過程中測(cè)序質(zhì)量的穩(wěn)定性，以Clean Reads的堿基位置作為橫坐標(biāo)，每個(gè)位置的平均測(cè)序質(zhì)量值作為縱坐標(biāo)，得到每個(gè)樣本測(cè)序質(zhì)量分布圖：

2.4 物種比較分析

在了解每個(gè)OTUs對(duì)應(yīng)的物種后，由于存在同一個(gè)物種具有多個(gè)不同的OTUs的情況。把具有相同物種分類的OTUs合并到一起，統(tǒng)計(jì)不同樣品間的物種成分變化，可以了解不同樣品之間的菌群多樣性。如下柱狀圖展示的是Phylum level下的各個(gè)樣品中的物種分布：

2.5 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性展示的是樣品內(nèi)的菌群的多樣性情況，包括菌種的類別豐富度以及菌種數(shù)目的均勻度。Alpha多樣性越高即細(xì)菌種類越豐富，細(xì)菌數(shù)目越均勻則表示此群落愈加穩(wěn)定。根據(jù)4種不同的計(jì)算指標(biāo)在不同的取樣深度下求得了alpha多樣性chao1度量指標(biāo)的值，如下圖所示：

區(qū)域Bb的物種多樣性最強(qiáng)，其次為C2和B1，區(qū)域Cb和A1的物種多樣性最差。

2.6 Beta多樣性分析

Beta多樣性展示的是樣品間的菌群的差異情況，根據(jù)樣品的物種分布，計(jì)算了unweightedUniFrac距離（只考慮各樣品中的物種類別差異）和weighted UniFrac距離（考慮了樣品之間物種類別差異以及各類別物種的豐度的差異）。

然后，對(duì)樣品間的距離矩陣進(jìn)行主成分分析，做出如下的三維PCA圖。

3 小結(jié)

對(duì)A1、A2、B1、B2、Bb、C1、C2、Cb8個(gè)養(yǎng)殖區(qū)域的微生物，利用宏基因組技術(shù)對(duì)微生物多樣性進(jìn)行研究，并對(duì)拼接后的序列進(jìn)行分析（OTUs（Operational Taxonomic Uints）的提取、alpha多樣性分析、beta多樣性分析等），各個(gè)區(qū)域的物種多樣性之間存在著一定的差異，其中區(qū)域Bb的物種多樣性最強(qiáng)，C2和B1次之，區(qū)域Cb和A1的物種多樣性最差。

參考文獻(xiàn)

[1]Pei，A. Y.et al.Diversity of 16S rRNA genes within individual prokaryotic genomes[J].Applied and Environmental Microbiology，2010（76）：3886-3897 .

[2]Vasileiadis，S.et al.Soil bacterial diversity screening using single 16S rRNA gene v regions coupled with Multi-Million read generating sequencing technologies[J].PLoS ONE，2012（7）：e42671.

[3]Caporaso，J. G. et al.QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J]. Nat Meth，2010（7）：335-336.

[4]Ahn，J.et al.Human gut microbiome and risk for colorectal cancer[J].Journal of the National Cancer Institute，2013（105）：1907-1911.

[5]Adler，C.J.et al.Sequencing ancient calcified dental plaque shows changes in oral microbiota with dietary shifts of the neolithic and industrial revolutions[J].Nat Genet，2013（45）：450-455.

[6]Zhang，J.Kobert，K.Flouri，T.&Stamatakis，A. PEAR：a fast and accurate illumina Paired-End reAdmergeR[J].Bioinformatics，2013（30）：btt593-620.