董超雄 楊柳平

【摘要】目的：探討HMGA2在睪丸癌組織中的表達及意義。方法：運用熒光定量PCR（Q-PCR）和Western blot 方法檢測HMGA2mRNA和蛋白在17例睪丸腫瘤和15例正常睪丸組織中的表達差異、免疫組織化學（IHC）方法檢測HMGA2蛋白在44例睪丸腫瘤，30例良性組織芯片中的表達差異。結果：HMGA2mRNA表達在癌組織中明顯高于良性組織：（9.09±2.95） vs. （3.86±1.66）， P=0.036、HMGA2蛋白在癌腫組織中的表達亦顯著高于良性組織：（9.27±2.91） vs. （4.66±1.62）， P=0.037。 HMGA2蛋白的表達高低和睪丸腫瘤的臨床分期及腫瘤大小密切相關，P<0.05。結論：HMGA2在睪丸腫瘤組織中上調(diào)表達并和腫瘤進展相關，有望成為睪丸腫瘤治療的分子靶點。

【關鍵詞】高遷移率蛋白A2；睪丸腫瘤；腫瘤進展

Up-regulated expression of HMGA2 in testicular cancer tissue and its clinical significanceDONG Chaoxiong， YANG Liuping. Department of Urology Surgery， Guangzhou 8th Peoples Hospital， Guangzhou 510440， Guangdong， China

【Abstract】Objectives： To investigate the expression and significance of HMGA2 in testicular cancer tissue. Methods： Using the fluorescent quantitative PCR （Q - PCR） and Western blot methods to detect HMGA2mRNA and protein in 17 cases of testicular tumors and 15 cases of normal testicular tissue， immunohistochemical （IHC） method to detect HMGA2 protein in 44 cases of testicular tumors and 30 cases of benign tissue by microarray. Results： HMGA2mRNA expression in cancerous tissue was significantly higher than that of benign group （9.09 ±2.95 VS 3.86± 1.66， P = 0.036）； HMGA2 protein expression in tumor tissue was significantly higher than that of benign organization （9.27±2.91 VS 4.66 ± 1.62， P = 0.037）. HMGA2 protein expression levels in testicular tumors were associated with clinical staging and the tumor size （P<0.05）. Conclusion： Up-expressed of HMGA2 in testicular cancer is associated with tumor progression and size， which is expected to become the molecular targets of testicular tumor treatment.

【Key words】HMGA2； Testicular tumors； Tumor progression

【中圖分類號】R679+.22；R737.21【文獻標志碼】A

睪丸腫瘤是青年男性最常見的惡性實體腫瘤，隨著腫瘤綜合治療的進展，睪丸癌的治愈率也得到了很大程度的提高。但對于臨床進展期及轉移性腫瘤，臨床治療效果仍舊較差，尋找合適的腫瘤進展期腫瘤標記物以及如何評估患者的預后風險是臨床上亟待解決的問題。

高遷移率蛋白A2（HMGA2）是在腫瘤中廣泛表達的蛋白之一，其表達異常與人類多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后相關。目前HMGA2與睪丸腫瘤組織的相關性國內(nèi)較少研究，我們在這方面做了一定研究，報道如下。

1材料和方法

1.1材料

收集近5年來醫(yī)院就診的17例睪丸腫瘤活檢或者手術組織標本以及15例正常睪丸活檢組織標本用于Q-PCR及WB實驗，其中腫瘤患者均未接受治療，初次確診為睪丸腫瘤，病理類型不限，所有標本均經(jīng)過最后的病理確認。組織來源取材時候均向患者說明，并簽署知情同意書。免疫組化（IHC）組織芯片標本包括44例睪丸腫瘤標本（病理及臨床分期不限）及30例良性對照標本。

主要試劑及儀器：主要試劑為Trizol試劑盒、逆轉錄試劑盒均購自上海捷瑞生物工程有限公司（Generay， Lot No.1382737），2×Taq PCR Master Mix購自北京天根生化科技有限公司（德國QIAGEN，Lot No.148049845）， HMGA2基因及內(nèi)參GAPDH基因PCR引物采用Primer 5.0軟件設計、上海英駿生物公司合成。主要儀器Image Quant 300紫外凝膠成像儀（GE）、紫外分光光度計（Ependofe）、Real-time PCR儀（BIORAD， IQ5）、兔抗人HMGA2多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司，SP試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物科技公司。

1.2方法

1.2.1熒光定量PCR檢測HMGA2mRNA的表達差異GenBank上查找目的基因mRNA序列，在CDS區(qū)設計特異性引物。GAPDH：F： 5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，R： 5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3。HMGA2：F： 5-CGAAAGGTGCTGGGCAGCTCCGG-3， R： 5-CCATTTCCTAGGTCTGCCTCTTG-3。反應條件：5×SYBR GreenⅠPCR buffer 10μL，上游引物F（10pmol/μL）和下游引物R（10pmol/μL）各1μL，dNTPs（10mM）1μL，Taq酶（3U/μL）1μL，ddH2O 31μL。反應條件為：95℃預變性5min，然后94℃40s，58℃退火40s，72℃45s，共40個循環(huán)。最后采用相對定量方法統(tǒng)計實驗結果。

1.2.2HMGA2蛋白表達定量檢測樣本加3倍體積預冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超聲波破碎，5000rpm，5mins離心。SDS-PAGE電泳，PVDF轉膜，HMGA2及GAPDH抗體濃度均為1：400，HRP標記的抗IgG抗體（1：30000）的二抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育1h后發(fā)光，顯影，圖象分析。

1.2.3IHC檢測HMGA2表達情況 免疫組化按照常規(guī)SP法試劑盒要求操作，多克隆抗體HMGA2工作濃度為1：200。，DAB試劑盒顯色，蘇木素復染胞核，以PBS 替代一抗作為陰性對照。結果判斷：觀察10個具有代表性的顯微鏡視野并確定陽性染色部位和陽性染色細胞的數(shù)量。陽性染色細胞百分比得分為：0分 （小于5%）， 1分 （5%～15%），2分 （15%～50%），3分（>50%）。染色強度評分：0分（不著色0），1分（淡黃色+），2分（深黃色++），3分（棕褐色染色+++）。總的免疫組化得分為陽性染色細胞百分比得分+染色強度得分。5分以上為高表達。

1.3統(tǒng)計學處理

使用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。正態(tài)分布的計量資料數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用Wilcoxon秩和檢驗分析HMGA2蛋白在癌和良性組織之中IHC表達強度差異情況；Pearson χ2檢驗分析HMGA2蛋白在癌組織中的免疫組化評分與患者臨床病理參數(shù)之間的關系。所有統(tǒng)計資料P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2實驗結果

2.1HMGA2mRNA在睪丸腫瘤組織中的表達水平

以GAPDH為參照基因，Q-PCR結果顯示HMGA2mRNA表達水平在睪丸腫瘤組織中明顯高于良性組織）9.09±2.95） vs. （3.86±1.66），P=0.036。見圖1A。

2.2HMGA2蛋白在癌組織中的表達

在17例腫瘤組織和15例良性組織中，Western blot實驗證實HMGA2蛋白在癌組織中的表達均高于對應的良性組織（9.27±2.91） vs. （4.66±1.62），P=0.037。見圖1B、圖1C。

2.3HMGA2蛋白主要表達定位在細胞胞質(zhì)

免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)HMGA2蛋白主要表達定位在細胞胞質(zhì)，陽性信號為棕黃色。癌組織和良性組織中均有表達（見圖2）。根據(jù)Wilcoxon秩和檢驗比較HMGA2蛋白在睪丸癌和良性組織中染色強度變化，各個評分區(qū)間統(tǒng)計學差異明顯（P<0.001），說明HMGA2在癌組織中的評分高于良性組織。把44例睪丸癌組織標本根據(jù)染色評分分為≤4分組（低表達），≥5分組（高表達）兩組，我們發(fā)現(xiàn)：HMGA2蛋白表達情況和患者年齡、婚姻與否、病理類型、轉移組間無統(tǒng)計學差異，和腫瘤臨床分期（χ2=6.070，P=0.014），腫瘤大小（χ2=5.698，P=0.017）組間差異明顯。見表1。

3討論

人類HMGA2基因[1，2] （HMGI-C基因），位于染色體12q-15區(qū)[3-5]，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，其中外顯子1～3編碼3個DNA結合區(qū)域，外顯子4編碼DNA結合區(qū)域和酸性羧基末端之間的間隔區(qū)，外顯子5則編碼酸性羧基末端。HMGA2目前認為是一種結構轉錄因子，可以對大量基因的轉錄和活化進行調(diào)節(jié)[6]，特別是那些與細胞增殖和凋亡相關的基因。所以說HMGA2在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉移過程中發(fā)揮著重要作用[7，8]。HMGA2的致癌機制目前尚不明確[9]，可能的原因是其異常激活、調(diào)控與腫瘤形成和進展的多種基因協(xié)同作用所致。Seville [10]指出：HMGA2可調(diào)控轉錄因子E2F1，進而抑制細胞分裂進入S期。Fedele[11] 也指出HMGA2的過表達進而激活E2F1的活性對腫瘤的形成是至關重要的[12]，而E2F1作為一類重要的轉錄因子家族成員，已經(jīng)明確和大多腫瘤的發(fā)生和進展相關。表1HMGA2蛋白在睪丸腫瘤組織中的表達與患者臨床病理之間的相關聯(lián)系特征nHMGA2（n= 44）低表達高表達χ2 P年齡<40206140.0560.813≥4024816病理類型精原細胞257180.3890.533非精原19712臨床分期

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HMGA2的過表達與多種腫瘤相關，包括乳腺癌[13]、胰腺癌[14]和非小細胞肺癌[15] ，同時HMGA2的異常表達和這些腫瘤的預后也密切相關，這和本研究結果類似。我們的結果發(fā)現(xiàn)HMGA2在睪丸組織中明顯高表達，并且HMGA2的表達強度和腫瘤的臨床分期及腫瘤大小明顯相關，說明HMGA2蛋白可促進癌腫細胞的增殖或者是減弱癌細胞的凋亡。Pentimalli[16] 指出HMGA2的致癌性也和其過表達破壞DNA的修復能力有關。而比較明確的是機體DNA自身的修復系統(tǒng)是抵抗腫瘤形成最好的防御，HMGA2與DNA損害細胞應答的關鍵因子ATM激酶有關。它與激活型的ATM相似，從而影響其DNA修復功能。但是，我們的結果并沒有發(fā)現(xiàn)HMGA2蛋白的表達強度和癌腫的轉移以及病理類型相關，這和一些學者的研究結果有出入?？赡艿脑蚴俏覀兊膶嶒灅颖緮?shù)目較少，另外并沒有患者的確切生存資料供分析。當然具體深層次的分子機制還有待進一步研究。

本研究揭示出HMGA2在人睪丸組織中有較強的表達，并與腫瘤臨床分期密切相關，對睪丸癌的預后判斷具有重要意義，有望作為睪丸癌進展及預后判斷的指標，并有可能作為睪丸癌治療干預的新靶點。參考文獻

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