廖海君，李蕊伽，陶　敏，白亞娟，唐　菁，唐云明*

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

雜優(yōu)-2平菇漆酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

廖海君，李蕊伽，陶敏，白亞娟，唐菁，唐云明*

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

將雜優(yōu)-2平菇菌絲進(jìn)行液體培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE（diethylaminoethyl）-Sepharose fast flow層析和Superdex-200 prep grade層析等方法純化，獲得了電泳純的雜優(yōu)-2平菇漆酶，并對(duì)純化的漆酶進(jìn)行了部分酶學(xué)性質(zhì)研究。結(jié)果顯示，雜優(yōu)-2平菇漆酶比活力為115 U/mg，分子質(zhì)量約為244.0 kD，亞基分子質(zhì)量約為85.6 kD。最適反應(yīng)pH值和最適反應(yīng)溫度分別為5.0和55 ℃，在pH 6.0～8.0及40～55 ℃范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好；最適條件下，以2，2’-聯(lián)氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）為底物的Km值為2.1 mmol/L，最大反應(yīng)速率（vmax）為0.117 μmol/（min·L）。Fe2+、抗壞血酸對(duì)該酶活性具有完全抑制作用，乙二胺四乙酸、Ag+、Mg2+、Li+對(duì)該酶活性影響較??；草酸、甲醇、正丁醇、K+、Ca2+、Ba2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+、Mn2+、Co2+對(duì)該酶活性有不同程度的抑制作用；Cu2+激活作用不明顯；尿素、乙醇、異丙醇對(duì)該酶活性具有激活作用。

雜優(yōu)-2平菇；漆酶；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

漆酶（laccase，EC 1.10.3.2）是一類含銅的多酚氧化酶，分布廣泛，存在于真菌分泌物、高等植物、少量的細(xì)菌和昆蟲組織中，是由日本學(xué)者吉田（Yoshi）于1883年首次從日本紫膠漆樹漆液中發(fā)現(xiàn)的能催化漆固化過程的一種蛋白質(zhì)；1894年，Bertrand將該蛋白質(zhì)命名為漆酶（laccase）［1］。自漆酶被發(fā)現(xiàn)以來，該酶便成為生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)和化學(xué)等交叉學(xué)科的研究對(duì)象。近年來，隨著對(duì)漆酶性質(zhì)的研究，該酶在食品工業(yè)、造紙工業(yè)、廢水處理、環(huán)境污染物質(zhì)脫毒及降解、染料脫色等領(lǐng)域顯現(xiàn)出較大的應(yīng)用潛力和研究?jī)r(jià)值［2-5］，成為環(huán)境保護(hù)用酶的研究熱點(diǎn)。由于不同來源的漆酶具有不同的底物專一性和不同的性質(zhì)［6］，目前有多種來源的漆酶的酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用研究的相關(guān)報(bào)道［7-13］，但鮮見雜優(yōu)-2平菇（Pleurotus ostreatus heterosis-2）漆酶分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究的報(bào)道。雜優(yōu)-2平菇作為人工種植品種之一，其生長(zhǎng)能源主要來自于基質(zhì)中大分子物質(zhì)的分解，而漆酶作為一種胞外含銅多酚氧化酶，起著分解基質(zhì)中木質(zhì)素的作用。為充分了解雜優(yōu)-2平菇漆酶的酶學(xué)性質(zhì)，為其人工栽培提供理論支持，本實(shí)驗(yàn)對(duì)雜優(yōu)-2平菇發(fā)酵液中的漆酶進(jìn)行分離純化并對(duì)其部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，旨在為對(duì)漆酶進(jìn)一步研究、食用菌生產(chǎn)和工業(yè)應(yīng)用等方面提供參考。

1　材料與方法

1.1菌種、培養(yǎng)基與試劑

菌種為雜優(yōu)-2平菇，購(gòu)買于重慶伯民食用菌專業(yè)合作社。

改良PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂18 g/L、蛋白胨5 g/L、頭孢曲松鈉125 μg/L、蒸餾水 1 000 mL、pH值自然。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、頭孢曲松鈉125 μg/L、蒸餾水1 000 mL、pH值自然。

2，2’-聯(lián)氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（2，2’-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS）（分析純）、牛血清白蛋白 美國(guó)Sigma公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）標(biāo)準(zhǔn)品、DEAE（diethylaminoethyl）-Sepharose fast flow、Superdex-200 prep grade和凝膠層析分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)GE Healthcare公司；考馬斯亮藍(lán)R-250 美國(guó)Bio-Rad公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

精密電子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Thermo Fisher Scientific LED股份有限公司；Mill-Q plus 超純水儀 美國(guó)Millipore公司；UV-2550型分光光度計(jì)、蛋白核酸定量?jī)x 日本島津公司；AKTA prime plus 蛋白純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；MC4L冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Uni Equip公司；垂直板電泳槽和電泳儀 美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.3方法

1.3.1漆酶的酶活力測(cè)定

使用ABTS法［14-17］：反應(yīng)總體系為3 mL，包括0.2 mL 0.5 mmol/L的ABTS，2.7 mL 0.1 mol/L pH 4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液和0.1 mL酶液。30 ℃條件下，測(cè)定反應(yīng)3 min內(nèi)420 nm波長(zhǎng)處的光密度值（OD420nm），以煮沸3 min后的滅活酶液為空白對(duì)照。酶活力單位定義為每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol的底物所需酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。漆酶活力按式（1）計(jì)算。

式中：V總、V酶分別代表反應(yīng)體系的總體積和反應(yīng)體系中酶液的體積/mL；?OD420nm代表光密度變化值；ε為吸光系數(shù)，其值為36 000 L/（mol·cm）；?t為反應(yīng)時(shí)間/min。

1.3.2雜優(yōu)-2平菇漆酶在液體培養(yǎng)基中活力的變化規(guī)律

將雜優(yōu)-2平菇菌絲塊接種于300 mL液體培養(yǎng)基中，3個(gè)重復(fù)，28 ℃、175 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，在超凈工作臺(tái)中，每天從每個(gè)重復(fù)中取3 mL液體培養(yǎng)基，測(cè)定其漆酶活力的變化值。

1.3.3蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

［18］，用牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用考馬斯亮藍(lán)染料法（Bradford法）和紫外分光光度法計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.3.4漆酶比活力計(jì)算

分離純化的每一步操作后所收集得到的總酶活力與總蛋白的比值即為所求漆酶比活力/（U/mg pro）。

1.3.5雜優(yōu)-2平菇漆酶粗酶液的制備

雜優(yōu)-2平菇菌種菌絲經(jīng)活化后，接種于PDA固體培養(yǎng)基中，用封口膜將平板密封后放于28 ℃培養(yǎng)6 d，用直徑為10 mm的無菌打孔器在長(zhǎng)滿菌絲的PDA培養(yǎng)基表面截取菌絲塊，用無菌接種針將菌絲塊接種于裝有300 mL液體培養(yǎng)基的500 mL三角錐形瓶中，每瓶接種量為20塊，在28 ℃、175 r/min條件下振蕩培養(yǎng)6 d，將發(fā)酵液用8 層紗布過濾，濾液即為漆酶粗酶液。

1.3.6雜優(yōu)-2平菇漆酶初酶液的制備

向粗酶液中加入硫酸銨至30%的飽和度，4 ℃靜置2 h，在4 000 r/min條件下離心40 min，收集上清液；再向上清液中加入硫酸銨至80%的飽和度，在4 ℃靜置2 h后，4 000 r/min離心50 min，去上清液收集沉淀。將沉淀溶解于20 mL 0.1 mol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液中，于4 ℃條件下透析24 h后，2 000 r/min 離心10 min，收集上清液，即為雜優(yōu)-2平菇漆酶的初酶液。

1.3.7DEAE-Sepharose fast fl ow層析

用0.05 mol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液平衡DEAESepharose fast flow層析柱（26 mm×15 cm）12 h，取10 mL初酶液上樣，用0～0.5 mol/L NaCl（用0.05 mol/L pH 6.0的磷酸緩沖液配制）溶液進(jìn)行線性洗脫。以0.5 mL/min的流速洗脫，每管收集體積為5 mL，分別測(cè)定各收集管漆酶的酶活力和蛋白含量。收集酶活力較高管中的酶液，透析濃縮后進(jìn)行凝膠層析。

1.3.8Superdex-200 prep grade層析

用0.05 mol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液平衡Superdex-200 prep grade層析柱（16 mm×60 cm）10 h后，取1.3.7節(jié)所得酶液5 mL上樣，用0.05 mol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為0.3 mL/min，每管收集3 mL。測(cè)定各管收集液中漆酶的酶活力和蛋白含量，收集酶活力較高的酶液。在4 ℃條件下用去離子水透析12 h，冷凍干燥后于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.9雜優(yōu)-2平菇漆酶純度的鑒定及分子質(zhì)量的測(cè)定

將1.3.8節(jié)所得的漆酶，通過SDS-PAGE進(jìn)行純度鑒定，SDS-PAGE濃縮膠和分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%、12%，上樣量為10 μL。經(jīng)凝膠過濾層析和SDS-PAGE電泳分別測(cè)定漆酶的全分子質(zhì)量和亞基的分子質(zhì)量［18］。

1.3.10漆酶酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

1.3.10.1 漆酶最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性的測(cè)定

在不同溫度梯度（20～85 ℃，溫度梯度為5 ℃）、pH 4.8條件下測(cè)定漆酶活力，以酶活力最高值為100%，計(jì)算各溫度下的相對(duì)酶活力，確定其最適反應(yīng)溫度。將酶液置于不同溫度（30～65 ℃，溫度梯度為5 ℃），每隔20 min測(cè)定其酶活力，以不保溫的酶液酶活力為100%，計(jì)算各溫度下不同時(shí)間段的相對(duì)酶活力，研究該漆酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.10.2 漆酶最適反應(yīng)pH值與酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定

在pH 3.0～8.0范圍內(nèi)測(cè)定漆酶活力，以酶活力最高值為100%，計(jì)算不同pH值條件下的相對(duì)酶活力，確定其最適反應(yīng)pH值。將200 μL酶液分別與等體積不同pH 值（3～9）緩沖液混合均勻，4 ℃條件下靜置3 h后，分別測(cè)定酶活力，以200 μL酶液與等體積蒸餾水混勻的同等條件下所測(cè)漆酶活力值為100%，計(jì)算不同pH值下的相對(duì)酶活力，以研究該漆酶的酸堿穩(wěn)定性。

1.3.10.3 不同金屬離子對(duì)漆酶活性的影響

將不同濃度（10～50 mmol/L）的K+、Ca2+、Ba2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、Ag+、Mg2+、Li+、Cu2+離子與200 μL酶液等體積混勻，4 ℃條件下靜置30 min，測(cè)定其酶活力。以200 μL酶液與等體積蒸餾水混勻后在同等條件下所測(cè)酶活力值為100%，計(jì)算不同金屬離子在不同濃度下的漆酶相對(duì)酶活力。

1.3.10.4 不同化合物對(duì)漆酶活性的影響

將不同濃度（5～25 mmol/L）的抗壞血酸、草酸、尿素、EDTA與200 μL酶液等體積混勻后，4 ℃條件下靜置30 min，測(cè)定不同化合物不同濃度下的漆酶活力。以與200 μL酶液等體積混勻的蒸餾水在相同條件下的酶活力為100%，計(jì)算不同化合物在不同濃度時(shí)的漆酶相對(duì)酶活力。

1.3.10.5 不同醇類有機(jī)溶劑對(duì)漆酶活性的影響

將不同體積分?jǐn)?shù)（10%～50%）的甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇分別與200 μL漆酶酶液等體積混合后，4 ℃條件下靜置30 min，測(cè)定不同有機(jī)醇類物質(zhì)在不同含量下的漆酶酶活力。以與200 μL酶液等體積混勻的蒸餾水在相同條件下測(cè)的酶活力為100%，計(jì)算不同有機(jī)溶劑在不同濃度時(shí)的漆酶相對(duì)酶活力。

1.3.10.6 漆酶米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（vmax）的測(cè)定

配制不同濃度（0.1～1 mmol/L）的ABTS，在55 ℃、pH 5.0條件下測(cè)定漆酶的酶活力，采用雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk）［19］，求出漆酶的Km和vmax值。

2　結(jié)果與分析

2.1雜優(yōu)-2平菇漆酶在液體培養(yǎng)基中的活性變化規(guī)律

圖1　雜優(yōu)-2平菇漆酶酶活力變化Fig.1　Change in laccase activity from Pleurotus ostreatus heterosis-2 during culture

雜優(yōu)-2平菇發(fā)酵液中漆酶活力的測(cè)定結(jié)果如圖1所示。雜優(yōu)-2平菇在生長(zhǎng)前期產(chǎn)酶量較低，因此漆酶活力較低。在第6 天酶活力達(dá)到峰值，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力逐漸降低。有研究表明漆酶與菌體的呼吸作用有關(guān)，為菌體生長(zhǎng)提供更多可利用的能量，從而加快菇類的生長(zhǎng)發(fā)育［20］。在本實(shí)驗(yàn)中，第6天后漆酶活力開始下降，可能是因液體培養(yǎng)基中菌絲體數(shù)量增多而氧的含量減少，導(dǎo)致漆酶菌絲呼吸作用減慢，產(chǎn)漆酶量減少，而消耗漆酶量大于生產(chǎn)量。

2.2雜優(yōu)-2平菇漆酶的分離純化

經(jīng)DEAE-Sepharose fast flow層析后的雜優(yōu)-2平菇漆酶結(jié)果如圖2所示，酶活力峰主要集中在42～51 管，其中第47管的酶活力值最高。離子交換層析所得酶液，經(jīng)Superdex-200 prep grade層析（圖3），結(jié)果表明雜優(yōu)-2平菇漆酶酶活力峰主要集中在27～39 管，第30管時(shí)酶活力峰最高，次峰為第36管。該結(jié)果說明經(jīng)離子交換層析所得的酶液有2 個(gè)活性峰。棄次峰酶液，收集第30管（主峰）附近各管的酶液，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示單一條帶（圖4），表明雜優(yōu)-2平菇漆酶分離純化已達(dá)電泳純。后續(xù)研究均以該酶液為材料進(jìn)行。雜優(yōu)-2平菇漆酶純化結(jié)果如表1所示：最終得到雜優(yōu)-2平菇漆酶回收率為6.96%，純化倍數(shù)為111.65 倍，比活力達(dá)到115 U/mg pro。

圖2　雜優(yōu)-2平菇漆酶酶液DEAE-Sepharose fast flow層析結(jié)果Fig.2　DEAE-Sepharose fast flow chromatography of laccase from Pleurotus ostreatus heterosis-2

圖3　雜優(yōu)-2平菇漆酶酶液Superdex-200 prep grade 層析結(jié)果Fig.3　Superdex-200 prep grade chromatography of laccase from Pleurotus ostreatus heterosis-2

表1　雜優(yōu)-2平菇漆酶酶液分離純化結(jié)果Table1　Summary of purification of laccase from Pleurotus ostreatus heterossiiss-2

2.3雜優(yōu)-2平菇漆酶的分子質(zhì)量

由圖4可知，經(jīng)SDS-PAGE測(cè)得雜優(yōu)-2平菇漆酶的亞基分子質(zhì)量約為85.6 kD，經(jīng)過Superdex-200 prep grade層析測(cè)得全酶分子質(zhì)量為244.0 kD（圖5），由此可推測(cè)雜優(yōu)-2平菇漆酶由3個(gè)亞基組成。

圖4　雜優(yōu)-2平菇漆酶的SDS-PAGE圖譜Fig.4　SDS-PAGE of the laccase

圖5　Superdex-200 prep grade層析測(cè)得雜優(yōu)-2平菇漆酶的分子質(zhì)量Fig.5　Molecular weight estimation of the laccase by Superdex-200 prep grade chromatography

2.4雜優(yōu)-2平菇漆酶的部分酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1漆酶最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性

圖6　反應(yīng)溫度對(duì)雜優(yōu)-2平菇漆酶活力的影響Fig.6　Effect of temperature on the activity of the laccase

由圖6可知，雜優(yōu)-2平菇漆酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，漆酶活力呈先增大后減小的趨勢(shì)，在25～35 ℃之間，酶活力變化不大，40～65 ℃范圍內(nèi)，相對(duì)酶活力保持在90%以上，70 ℃后酶活力開始逐漸降低。由圖7可見，在40～45 ℃范圍內(nèi)保溫3 h后，相對(duì)酶活力均保持在較高水平（75%左右），50～55 ℃范圍內(nèi)保溫2 h后，相對(duì)酶活力均維持在50%左右，60～65 ℃范圍保溫1 h后，幾乎無酶活力。

圖7　雜優(yōu)-2平菇漆酶的熱穩(wěn)定性Fig.7　Thermal stability of the laccase

2.4.2漆酶最適反應(yīng)pH值與酸堿穩(wěn)定性

圖8　pH值對(duì)雜優(yōu)-2平菇漆酶活力的影響Fig.8　Effect of pH on the activity of the laccase

由圖8可知，雜優(yōu)-2平菇漆酶在pH 5.0時(shí)有最大酶活力，因此該酶的最適反應(yīng)pH值為5.0。在pH 3.0～5.0范圍內(nèi)，酶活力較高，當(dāng)pH值大于8.0時(shí)，該漆酶活力幾乎完全喪失。酸堿穩(wěn)定性結(jié)果如圖9所示，在pH 6.0～7.0范圍內(nèi)孵育3 h后，漆酶相對(duì)酶活力為98%左右，pH 8.0時(shí)相對(duì)酶活力最大，而當(dāng)pH＞9.0時(shí)，相對(duì)酶活力開始有下降趨勢(shì)。

圖9　雜優(yōu)-2平菇漆酶的酸堿穩(wěn)定性Fig.9　pH stability of the laccase

2.4.3不同金屬離子對(duì)漆酶活性的影響

在不同濃度條件下，不同金屬離子及同一種金屬離子均表現(xiàn)出對(duì)該漆酶的不同作用效果（圖10），Ag+、Mg2+、Li+對(duì)漆酶活性影響不大；K+、Ca2+、Ba2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+、Mn2+、Co2+均對(duì)該酶有不同程度的抑制作用，其中Fe2+具有強(qiáng)烈抑制作用；Cu2+促進(jìn)作用不明顯（表現(xiàn)為輕微抑制作用或無太大影響）。

圖10　不同金屬離子對(duì)雜優(yōu)-2平菇漆酶活力的影響Fig.10　Effects of various mental ions on the activity of the laccase

2.4.4不同化合物對(duì)漆酶活力的影響

圖11　不同化合物對(duì)雜優(yōu)-2平菇漆酶活力的影響Fig.11　Effects of various compounds on the activity of the laccase

由圖11可知，尿素對(duì)該酶有促進(jìn)作用，在濃度為10 mmol/L時(shí)促進(jìn)作用較明顯；草酸和抗壞血酸對(duì)該酶有抑制作用，其中抗壞血酸抑制作用較強(qiáng)烈，濃度為5 mmol/L時(shí)完全抑制；EDTA對(duì)該酶作用不明顯。

2.4.5不同醇類有機(jī)溶劑對(duì)漆酶活性的影響

由圖12可知，乙醇、異丙醇在體積分?jǐn)?shù)為20%和30%時(shí)，對(duì)漆酶具有促進(jìn)作用，甲醇和正丁醇對(duì)漆酶具有抑制作用，其中正丁醇抑制作用強(qiáng)于甲醇。

圖12　不同醇類有機(jī)溶劑對(duì)雜優(yōu)-2平菇漆酶活力的影響Fig.12　Effects of alcohols on the activity of the laccase

2.4.6漆酶米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（vmax）的變化

在55 ℃、pH 5.0條件下，以不同濃度的ABTS為漆酶反應(yīng)底物，測(cè)定漆酶反應(yīng)速率（v）。采用Lineweaver-Burk法得到1/［S］與1/v的關(guān)系曲線（圖13），計(jì)算得到雜優(yōu)-2平菇漆酶對(duì)ABTS的Km值為2.1 mmol/L，vmax為0.117 μmol/（min·L）。

圖13　雙倒數(shù)法測(cè)定雜優(yōu)-2平菇漆酶的米氏常數(shù)Fig.13　Kmdetermination of the laccase by Lineweaver-Burk plot

3　討論與結(jié)論

漆酶是一類含銅氧化酶，其來源廣泛，在環(huán)境保護(hù)、飲料加工、污染物降解等方面具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。漆酶存在于食用菌菌體中，菌體在生長(zhǎng)過程中，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)木質(zhì)素，需要在菌體分泌的以胞外漆酶為主體的氧化酶及其他酶（如過氧化物酶、酪氨酸酶等）的共同作用下，才能將木質(zhì)素分解成能為可直接吸收利用的小分子物質(zhì)。而且該胞外酶在分解木質(zhì)素的同時(shí)，產(chǎn)生有毒的醌類或酚類物質(zhì)，能夠抑制雜菌生長(zhǎng)，從而防止雜菌污染［21］。其次，漆酶與菌體呼吸作用有關(guān)，有利于維持呼吸過程中電子傳遞的正常運(yùn)行，為菌體生長(zhǎng)提供更多可利用的能量。

目前，已有多種真菌漆酶被分離純化，其理化性質(zhì)也被廣泛研究。盡管最適反應(yīng)溫度、pH值等在相似范圍內(nèi)，但由于漆酶的來源不同，其酶學(xué)性質(zhì)呈現(xiàn)差異性。綜合已有食用菌漆酶數(shù)據(jù)，漆酶最適反應(yīng)溫度范圍為25～80 ℃。黎莉等［22］對(duì)金針菇漆酶性質(zhì)的研究結(jié)果表明，其最適反應(yīng)溫度為40 ℃，最適反應(yīng)pH值為 2.0～4.5；李學(xué)梅等［23］對(duì)平菇漆酶性質(zhì)研究結(jié)果為其最適反應(yīng)溫度60 ℃，最適反應(yīng)pH 3.0；劉新穎等［24］對(duì)雙鮑菇漆酶性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)溫度為25 ℃，最適反應(yīng)pH 5.0；陳瓊?cè)A等［25］對(duì)韋伯靈芝漆酶性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)溫度為50～60 ℃，最適反應(yīng)pH 4.6。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以雜優(yōu)-2平菇為實(shí)驗(yàn)材料分離純化的漆酶，其最適反應(yīng)溫度為55 ℃，高于白靈側(cè)耳漆酶（50 ℃）［26］，低于紫杉木齒菌漆酶（60 ℃）［15］，該酶在該溫度條件下熱穩(wěn)定性較好，保溫2 h后，剩余相對(duì)酶活力為50%左右；該酶最適反應(yīng)pH 5.0，與雙鮑菇漆酶和木腐真菌漆酶［24，27］最適反應(yīng)pH值相同，高于靈芝漆酶最適反應(yīng)pH 3.0、糙皮側(cè)耳菌漆酶pH 4.0，彩絨革蓋菌pH 4.6［28-29］。在pH 3～8、4 ℃條件下靜置3 h，其穩(wěn)定性隨pH值的增大而增大，與平菇漆酶酸堿穩(wěn)定性相同。表明該酶在酸性和中性環(huán)境中有更強(qiáng)的適應(yīng)性。

金屬離子Fe2+對(duì)該漆酶活性有強(qiáng)烈抑制作用，其可能原因是Fe2+通過催化氧化還原產(chǎn)物ABTS+·的還原作用，使其恢復(fù)到底物起始狀態(tài)來延緩酶催化氧化反應(yīng)的進(jìn)程［30］。K+、Ca2+、Ba2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+、Mn2+、Co2+對(duì)該酶具有抑制作用，且隨金屬離子濃度的增大，抑制作用越強(qiáng)；Cu2+對(duì)該酶在濃度為0.2 mmol/L具有促進(jìn)作用，高于或低于該濃度均表現(xiàn)抑制作用，而大多數(shù)研究表明Cu2+能明顯促進(jìn)漆酶活性，少數(shù)對(duì)漆酶活性無影響或有抑制作用；也有研究表明，高濃度金屬離子對(duì)白腐菌的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生一定毒害作用，這也許可以解釋高濃度下雜優(yōu)-2平菇漆酶活力降低的原因［15］。然而，低濃度條件下，金屬離子對(duì)漆酶活性影響不大或降低，因此仍需進(jìn)一步研究。Ag+、Mg2+、Li2+對(duì)該漆酶活性影響不大。在所研究的金屬離子中，沒有能使雜優(yōu)-2平菇漆酶活性明顯增強(qiáng)的金屬離子。抑制劑EDTA在濃度為25 mmol/L、4℃條件下，孵育30 min，其剩余相對(duì)酶活力仍有89%，表明EDTA對(duì)該酶活性影響不大，該結(jié)果與抑制劑EDTA對(duì)紫杉木齒菌漆酶活性影響結(jié)果相同［15］。

雜優(yōu)-2平菇漆酶亞基分子質(zhì)量約為85.6 kD，全分子質(zhì)量為244.0 kD，通常漆酶分子質(zhì)量在40～80 kD之間，與毛木耳LacA（110 kD）［31］，白靈側(cè)耳pnLac（65 kD）［26］，紫杉木齒菌漆酶（55.5 kD）［15］，韋伯靈芝漆酶（40 kD）［25］，靈芝漆酶同工酶（65～68 kD）［32］有很大差異且高于常見漆酶分子質(zhì)量，表明不同來源漆酶分子質(zhì)量間存在較大差異。該酶對(duì)底物ABTS的Km值為2.1 mmol/L，vmax為0.117 μmol/（min·L），其Km值均高于紫杉木齒菌漆酶（5.18×10-2mmol/L）、韋伯靈芝漆酶（1.38×10-2mmol/L）、白靈側(cè)耳pnLac（0.117 mmol/L）和靈芝漆酶同工酶（3.7×10-3mmol/L）［15，25-26，32］，表明該酶與底物的親和力較差。

本實(shí)驗(yàn)以雜優(yōu)-2平菇為實(shí)驗(yàn)材料分離純化漆酶，其操作流程簡(jiǎn)單，在40～55 ℃條件下的熱穩(wěn)定性較好。自然界中，漆酶產(chǎn)量低，因此對(duì)漆酶及其酶學(xué)性質(zhì)的研究，不僅對(duì)改造漆酶分子結(jié)構(gòu)、高效表達(dá)及基因克隆有重要意義，而且對(duì)食用菌菌種改良和栽培有實(shí)踐意義。對(duì)雜優(yōu)-2平菇漆酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，可對(duì)其在生產(chǎn)、工業(yè)等方面的應(yīng)用提供參考。

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Isolation， Purification and Characterization of Laccase from Pleurotus ostreatus Heterosis-2

LIAO Haijun， LI Ruijia， TAO Min， BAI Yajuan， TANG Jing， TANG Yunming*
（Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region， Ministry of Education， Chongqing Sweetpotato Engineering Research Center， School of Life Science， Southwest University， Chongqing 400715， China）

An electrophoretically pure laccase from the fermentation broth of Pleurotus ostreatus heterosis-2 was obtained through ammonium sulfate fractionation， DEAE-Sepharose fast flow chromatography and Superdex-200 prep grade chromatography. The results indicated that the specific activity of the purified enzyme reached 115 U/mg. The relative molecular weight of the laccase was approximately 244.0 kD， with a subunit molecular mass of roughly 85.6 kD. The enzymatic properties showed that the optimum pH and temperature for the laccase were 5.0 and 55 ℃， respectively. The enzyme was stabled at pH 6.0-8.0 and 40-55 ℃， and its apparent Kmand vmaxwere 2.1 mmol/L and 0.117 μmol/（min·L），respectively. Fe2+and ascorbic acid could completely inactivate the laccase， whereas the enzyme activity was slightly affected by EDTA， Ag+， Mg2+and Li+. Cu2+had little activating effect on laccase activity. The enzyme activity of laccase could be activated by urea， ethanol， and isopropanol， and inhibited by oxalic acid， methanol， n-butanol， K+， Ca2+， Ba2+，Zn2+， Cd2+， Pb2+， Mn2+， and Co2+.

Pleurotus ostreatus heterosis-2； laccase； isolation and purifi cation； enzymatic properties

10.7506/spkx1002-6630-201619025

Q946.5

A

1002-6630（2016）19-0147-07

廖海君， 李蕊伽， 陶敏， 等. 雜優(yōu)-2平菇漆酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（19）： 147-153. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201619025. http：//www.spkx.net.cn

LIAO Haijun， LI Ruijia， TAO Min， et al. Isolation， purification and characterization of laccase from Pleurotus ostreatus heterosis-2［J］. Food Science， 2016， 37（19）: 147-153. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201619025. http://www.spkx.net.cn

2015-10-30

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（XDJK2016C110）

廖海君（1989—），女，碩士研究生，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：heking_liao@yahoo.com

唐云明（1960—），男，教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn