毛　劼，孫　興，程娟獻(xiàn)，王心正，趙永強(qiáng)，王紅霞，何　昆，夏　晴*

（中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850）

基于質(zhì)譜檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物外源蛋白質(zhì)的消化穩(wěn)定性

毛劼，孫興，程娟獻(xiàn)，王心正，趙永強(qiáng)，王紅霞，何昆，夏晴*

（中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850）

基于無(wú)標(biāo)記定量質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)建立了一種新的轉(zhuǎn)基因生物外源蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性評(píng)價(jià)方法。以牛β-乳球蛋白、牛血清白蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，經(jīng)模擬人體胃/腸消化液消化后進(jìn)行凝膠電泳分離，切取目標(biāo)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行酶切，提取肽段進(jìn)行納升液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析?；贛ascot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定目標(biāo)蛋白質(zhì)。計(jì)算各消化時(shí)間點(diǎn)蛋白質(zhì)匹配肽段數(shù)與消化前蛋白質(zhì)匹配肽段數(shù)的比值，當(dāng)比值≤0.50時(shí)判斷為目標(biāo)蛋白質(zhì)在該時(shí)間段內(nèi)已消化。將此方法應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻“華恢1號(hào)”外源蛋白Cry1Ab/1Ac的消化穩(wěn)定性分析，結(jié)果顯示在模擬胃液中消化2 min時(shí)，比值下降到0.50以下，在模擬腸液中消化15 s后比值下降到0.50以下，表明該蛋白在胃/腸消化液中具有消化不穩(wěn)定性。

轉(zhuǎn)基因生物；消化穩(wěn)定性；質(zhì)譜；外源蛋白Cry1Ab/1Ac；無(wú)標(biāo)記定量

轉(zhuǎn)基因生物為全球創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和環(huán)境效益［1-2］的同時(shí)，其食用安全性也成為了人們關(guān)注的焦點(diǎn)［3-4］。根據(jù)美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局提供的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)清單，對(duì)于轉(zhuǎn)基因生物外源蛋白的食用安全性評(píng)價(jià)主要包括四方面：消化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)［5-7］、與已知的致敏原和毒蛋白進(jìn)行氨基酸序列同源性的比對(duì)、熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)［8］以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒理實(shí)驗(yàn)［9-10］。依據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（農(nóng)業(yè)部869號(hào)公告-2-2007《轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品食用安全檢測(cè) 模擬胃腸液外源蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性試驗(yàn)方法》）［11］，消化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)主要采用蛋白印跡法（Western blotting）。由于胃/腸液成分復(fù)雜，蛋白降解片段各異，難以預(yù)測(cè)，基于Western blotting技術(shù)的外源蛋白質(zhì)及其降解片段的識(shí)別依賴于高特異性識(shí)別的抗體，而在很多情況下難以獲得高質(zhì)量的特異性抗體，由于非特異性識(shí)別信號(hào)的干擾，難以獲得關(guān)于待測(cè)蛋白消化性的正確判斷結(jié)果。而隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅速發(fā)展，越來(lái)越多的優(yōu)質(zhì)外源基因被克隆和應(yīng)用，亟待一種方便、快捷并且不依賴于特定抗體的通用技術(shù)，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因外源蛋白質(zhì)的消化穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。

質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）技術(shù)具有高分辨、高靈敏度及高通量等優(yōu)點(diǎn)，其中無(wú)標(biāo)記定量的圖譜計(jì)數(shù)法無(wú)需復(fù)雜的數(shù)據(jù)處理步驟，概念簡(jiǎn)單、運(yùn)算速率快、假陽(yáng)性率低并且靈敏度高，在復(fù)雜樣本的蛋白質(zhì)鑒定和定量分析中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用［12-13］。由于圖譜計(jì)數(shù)法是一種半定量的方法，通過(guò)比較兩個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)間匹配肽段的鑒定圖譜數(shù)的比值即可獲得其變化關(guān)系。當(dāng)兩個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)匹配肽段的鑒定圖譜數(shù)的比值在0.50～2.00之間時(shí)，認(rèn)為數(shù)據(jù)點(diǎn)之間沒有變化；當(dāng)比值≤0.50時(shí)，認(rèn)為與前一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)相比降低；而當(dāng)比值≥2.00時(shí)，則認(rèn)為與前一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)相比增高［14］。

蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是天然存在于土壤中的革蘭氏陽(yáng)性菌，其在芽孢形成過(guò)程中可產(chǎn)生具有殺蟲活性的結(jié)晶蛋白質(zhì)，即Bt毒蛋白，Bt毒蛋白經(jīng)昆蟲腸道水解成多肽后，與其腸道特異受體位點(diǎn)結(jié)合，破壞細(xì)胞膜滲透壓的平衡導(dǎo)致細(xì)胞裂解，從而達(dá)到殺死昆蟲的目的［15-16］。該蛋白質(zhì)按氨基酸序列的同源性可分為45 大類，313 種。目前，抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻采用的Bt蛋白基因有cry1Ab、cry1Ac、cry1Ab/1Ac融合基因等［17］。轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻“華恢1號(hào)”外源Bt蛋白為我國(guó)自主合成的Cry1Ab/1Ac融合蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為68 277 D，其表達(dá)產(chǎn)物可以專一、高效地抑制二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟等水稻鱗翅目害蟲。對(duì)于轉(zhuǎn)基因水稻表達(dá)的外源蛋白質(zhì)Cry1Ab/1Ac消化穩(wěn)定性的研究一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)，而傳統(tǒng)的Western blotting方法對(duì)抗體要求高，且極易受非特異性識(shí)別信號(hào)的干擾，對(duì)于蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性不能提供準(zhǔn)確的判斷，給轉(zhuǎn)基因作物外源蛋白質(zhì)的食用安全性評(píng)價(jià)帶來(lái)了一定的困難。本研究采用高分辨、高靈敏度以及高通量的質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，基于無(wú)標(biāo)記定量方法成功建立了一種更為準(zhǔn)確的判斷蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性的分析方法。該方法可成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因水稻以及其他轉(zhuǎn)基因生物及食品中外源蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性的研究。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

基因工程表達(dá)純化Cry1Ab/1Ac蛋白質(zhì)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；胃蛋白酶、胰酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胃蛋白酶活力為3 200～4 500 U/mg pro；胰酶可滿足以下反應(yīng)體系要求：40 ℃、5 min內(nèi)，將其質(zhì)量25 倍的淀粉轉(zhuǎn)化為水溶性的碳水化合物；40 ℃、60 min內(nèi)（pH 7.5）消化掉其質(zhì)量25 倍的酪蛋白；37 ℃（pH 9.0），每毫克胰酶每分鐘能夠從橄欖油中至少水解生成2 μmol脂肪酸。

牛β-乳球蛋白（bovine β-lactoglobulin，BLG）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、大豆胰蛋白酶抑制劑（soybean trypsin inhibitor，STI）、NaHCO3、KH2PO4美國(guó)Sigma公司；鹽酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 美國(guó)Thermo公司；二硫蘇糖醇 美國(guó)Promega公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、溴酚藍(lán)、過(guò)硫酸銨（ammonium persulfate，APS）、甘氨酸、丙烯酰胺美國(guó)A-Pharmacia公司；質(zhì)譜純乙腈、質(zhì)譜純甲醇、質(zhì)譜純水 美國(guó)Fisher Scientific公司；質(zhì)譜純甲酸、碘乙酰胺 美國(guó)Acros公司。

1.2儀器與設(shè)備

AB Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源、納升級(jí)液相色譜Expert Nano LC 425及Analyst 2.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國(guó)AB公司；NESLAB gp100恒溫水浴箱美國(guó)Neslab公司；電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1蛋白質(zhì)樣本模擬胃/腸消化液消化

參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（農(nóng)業(yè)部869號(hào)公告-2-2007）［11］提供的配方配制模擬人體胃/腸消化液。在模擬胃/腸消化液添加的待測(cè)蛋白質(zhì)，質(zhì)量濃度分別為2、5 g/L，在37 ℃分別進(jìn)行0、15 s及2、30、60 min的消化反應(yīng)，同時(shí)設(shè)不加待測(cè)蛋白質(zhì)的消化液（胃蛋白酶/胰酶）對(duì)照組和不加胃蛋白酶/胰酶的待測(cè)蛋白質(zhì)對(duì)照組。

1.3.2SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及膠內(nèi)酶切

將各處理組及對(duì)照組蛋白樣品進(jìn)行電泳分離，根據(jù)分子質(zhì)量切取蛋白條帶進(jìn)行膠內(nèi)酶切，提取肽段并干燥。

1.3.3質(zhì)譜檢測(cè)

肽段提取樣本上樣后進(jìn)行納升液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（nano liquid chromatography-electronic spray ionmass spectrum/mass spectrum，Nano LC-ESI-MS/MS）分析，正離子檢測(cè)，源溫度150 ℃，霧化氣流速為6 L/min，氣簾氣流速為25 L/min，電噴霧針電壓為2 300 V。蛋白鑒定采用數(shù)據(jù)依賴采集模式，每個(gè)一級(jí)掃描后進(jìn)行20 個(gè)MS/MS掃描。納升級(jí)液相色譜分離用富集柱和分析柱聯(lián)用方式。捕獲柱為Chrom XP C18（350 μm×0.5 mm，3 μm，120 ?），分析柱為3C18-CL-120（75 μm×150 mm，3 μm，120 ?）。流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的超純水，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的乙腈。進(jìn)樣速率為7 μL/min，進(jìn)樣時(shí)間3 min。分析柱流速為300 nL/min，總分析時(shí)間為60 min。流動(dòng)相B在2～40 min內(nèi)由5%線性升至40%，1 min內(nèi)升至80%，保留5 min，再在1 min內(nèi)回到5%，平衡13 min。每?jī)蓚€(gè)樣品之間加一個(gè)自動(dòng)校正樣品，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。

1.3.4質(zhì)譜無(wú)標(biāo)記定量測(cè)定

Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索設(shè)置如下條件：儀器類型為ESI-QUAD-TOF；檢索類型為MS/MS二級(jí)離子檢索；酶為胰蛋白酶；固定修飾為烷基化；可變修飾為乙?；⑷グ被?、氧化；分子質(zhì)量為單同位素質(zhì)量；肽段容差為2×10-5D；碎片容差為±0.2 D；允許最大的未被酶切位點(diǎn)數(shù)為2。通過(guò)Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、定量所鑒定目標(biāo)蛋白質(zhì)的匹配肽段數(shù)，根據(jù)各消化時(shí)間點(diǎn)蛋白質(zhì)匹配肽段數(shù)與消化前匹配肽段數(shù)的比值來(lái)判斷目標(biāo)蛋白質(zhì)的消化穩(wěn)定性。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)蛋白的消化穩(wěn)定性

在農(nóng)業(yè)部869號(hào)公告-2-2007中，BLG作為對(duì)照蛋白，在模擬胃液中穩(wěn)定，60 min內(nèi)不能被消化，而在模擬腸液中不穩(wěn)定，15 s內(nèi)被消化；BSA在模擬胃液中不穩(wěn)定，15 s內(nèi)被消化，而STI在模擬腸液中穩(wěn)定，60 min內(nèi)不能被消化。本研究采用BLG、BSA和STI建立了基于質(zhì)譜檢測(cè)轉(zhuǎn)基因外源蛋白質(zhì)的消化穩(wěn)定性分析方法。這3 種蛋白質(zhì)在模擬胃液消化實(shí)驗(yàn)和模擬腸液消化實(shí)驗(yàn)中的SDS-PAGE結(jié)果如圖1～4所示，得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表1～4，每個(gè)蛋白質(zhì)樣品重復(fù)進(jìn)行兩次實(shí)驗(yàn)，表中數(shù)據(jù)為兩次實(shí)驗(yàn)的平均值，其中消化后匹配肽段數(shù)與消化前匹配肽段數(shù)的比值用表示。

圖1　模擬胃液消化的BLG蛋白SDS-PAGE圖Fig.1　SDS-PAGE analysis of BLG in stimulated gastric fluid

表1　模擬胃液消化BLG的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果Table1　MS analysis of BLG in stimulated gastric fluid

如圖1所示，在模擬胃液中消化的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，BLG的蛋白質(zhì)條帶均保持和消化前相同的強(qiáng)度，無(wú)減弱趨勢(shì)，證明模擬胃液消化BLG的實(shí)驗(yàn)體系有效。切取各消化時(shí)間段的BLG條帶進(jìn)行酶切提取及質(zhì)譜分析，通過(guò)Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、定量所鑒定目標(biāo)蛋白質(zhì)的匹配肽段數(shù)。根據(jù)各消化時(shí)間點(diǎn)蛋白質(zhì)匹配肽段數(shù)與消化前匹配肽段數(shù)的比值來(lái)判斷目標(biāo)蛋白質(zhì)的可消化性，若比值≤0.50則判斷為目標(biāo)蛋白質(zhì)在該時(shí)間點(diǎn)已消化，若0.50＜比值＜2則判斷其在該時(shí)間點(diǎn)和該溫度條件下未被消化。如表1所示，比值在所有時(shí)間點(diǎn)均大于0.50且小于2，表明BLG對(duì)胃消化液穩(wěn)定，與其已知的胃液消化特性相符。

圖2　模擬腸液消化的BLG蛋白SDS-PAGE圖Fig.2　SDS-PAGE analysis of BLG in stimulated intestinal fluid

表2　模擬腸液消化BLG的質(zhì)譜檢測(cè)Table2　MS analysis of BLG in stimulated intestinal fluid

如圖2所示，在模擬腸液中消化的各個(gè)時(shí)間段中，BLG的蛋白質(zhì)條帶在15 s時(shí)就已消失，證明模擬腸液消化BLG的實(shí)驗(yàn)體系有效。由表2質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)可知，BLG在模擬腸液消化15 s時(shí)，比值就下降至0.50以下，由此可判斷BLG在模擬腸液中15 s內(nèi)就已消化，為對(duì)腸液消化不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，與其已知的腸液消化特性相符。

圖3　模擬胃液消化的BSA蛋白SDS-PAGE圖Fig.3　SDS-PAGE analysis of BSA in stimulated gastric fluid

表3　模擬胃液消化BSA的質(zhì)譜檢測(cè)Table3　MS analysis of BSA in stimulated gastric fluid

如圖3所示，BSA在模擬胃液中消化15 s時(shí)蛋白質(zhì)條帶就已消失，且比值下降至0.50以下（表3），證明模擬胃液消化BSA的實(shí)驗(yàn)體系有效，BSA為對(duì)胃消化液不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，與其已知的胃液消化特性相符。

圖4　模擬腸液消化的STI蛋白SDS-PAGE 圖Fig.4　SDS-PAGE analysis of STI in stimulated intestinal fluid

表4　模擬腸液消化STI的質(zhì)譜檢測(cè)Table4　MS analysis of STI in stimulated intestinal fluid

如圖4所示，在模擬腸液中消化的各個(gè)時(shí)間段中，STI蛋白質(zhì)條帶的強(qiáng)度沒有減弱，且比值在所有時(shí)間點(diǎn)都大于0.50且小于2（表4），證明模擬腸液消化STI的實(shí)驗(yàn)體系有效，STI對(duì)腸消化液穩(wěn)定，與其已知的腸液消化特性相符。

2.2試樣蛋白的消化穩(wěn)定性結(jié)果表述

現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)是在實(shí)驗(yàn)體系工作正常的情況下，根據(jù)SDS-PAGE圖譜和Western blotting圖譜中試樣蛋白質(zhì)條帶及其可見降解片段消失的時(shí)間來(lái)判斷蛋白質(zhì)的可消化性。本研究依據(jù)BLG、BSA和STI在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中的消化穩(wěn)定性結(jié)果，建立了基于質(zhì)譜檢測(cè)試樣蛋白質(zhì)的消化穩(wěn)定性結(jié)果表述方法如下。

在實(shí)驗(yàn)體系工作正常的情況下，根據(jù)SDS-PAGE蛋白條帶酶切后的質(zhì)譜檢測(cè)所獲得匹配肽段數(shù)，計(jì)算各消化時(shí)間點(diǎn)蛋白質(zhì)匹配肽段數(shù)與消化前蛋白質(zhì)匹配肽段數(shù)的比值，當(dāng)0.50＜比值＜2時(shí)判斷為目標(biāo)蛋白質(zhì)在該時(shí)間段內(nèi)未消化，當(dāng)比值≤0.50時(shí)判斷為目標(biāo)蛋白質(zhì)在該時(shí)間段內(nèi)已消化，當(dāng)比值≥2時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。試樣蛋白質(zhì)在模擬胃液和模擬腸液中的可消化性分別表述為：

試樣蛋白質(zhì)在0～15 s內(nèi)，消化后與消化前蛋白質(zhì)匹配肽段數(shù)的比值≤0.50，則表明已消化，表述為該蛋白質(zhì)在模擬胃/腸液中極易消化。

試樣蛋白質(zhì)在15 s～2 min內(nèi)，消化后與消化前蛋白質(zhì)匹配肽段數(shù)的比值≤0.50，則表明已消化，表述為該蛋白質(zhì)在模擬胃/腸液中易消化。

試樣蛋白質(zhì)在2～30 min內(nèi)，消化后與消化前蛋白質(zhì)匹配肽段數(shù)的比值≤0.50，則表明已消化，表述為該蛋白質(zhì)在模擬胃/腸液中可消化。

試樣蛋白質(zhì)在30～60 min內(nèi)，消化后與消化前蛋白質(zhì)匹配肽段數(shù)的比值≤0.50，則表明已消化，表述為該蛋白質(zhì)在模擬胃/腸液中難消化。

試樣蛋白質(zhì)于60 min時(shí)，消化后與消化前蛋白質(zhì)匹配肽段數(shù)的比值仍＞0.50，則表明仍不能被消化，表述為該蛋白質(zhì)在模擬胃/腸液中極難消化。

2.3應(yīng)用于Cry1Ab/1Ac的消化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將轉(zhuǎn)基因水稻“華恢1號(hào)”外源蛋白質(zhì)Cry1Ab/1Ac進(jìn)行模擬胃消化液消化處理，然后進(jìn)行SDS-PAGE分離（圖5），切取各消化時(shí)間段的Cry1Ab/1Ac蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行酶切提取及質(zhì)譜分析，通過(guò)Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、定量所鑒定蛋白質(zhì)的匹配肽段數(shù)，從而得到各時(shí)間點(diǎn)Cry1Ab/1Ac蛋白質(zhì)匹配肽段數(shù)與消化前蛋白質(zhì)匹配肽段數(shù)的比值。Cry1Ab/1Ac在模擬胃液中的可消化性見表5。在模擬胃液中消化15 s時(shí)，比值仍＞0.50；消化2 min時(shí)，比值下降到0.50以下；消化30 min和消化60 min時(shí)，比值均在0.50以下。說(shuō)明轉(zhuǎn)基因水稻外源蛋白質(zhì)Cry1Ab/1Ac在2 min內(nèi)可被消化，在模擬胃液中的消化特性為易消化。

圖5　轉(zhuǎn)基因生物外源蛋白Cry1Ab/1Ac在模擬胃液中消化的SDS-PAGE圖PAGEFig.5　SDS-PAGE analysis of Cry1Ab/1Ac in stimulated gastric fluid

表5　模擬胃液消化轉(zhuǎn)基因水稻外源蛋白質(zhì)Cry1Ab/1Ac的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果Table5　MS analysis of Cry1Ab/1Ac in stimulated gastric fluid

將Cry1Ab/1Ac進(jìn)行模擬腸消化液消化處理，然后進(jìn)行SDS-PAGE分離（圖6），切取各消化時(shí)間段的Cry1Ab/1Ac蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行酶切提取及質(zhì)譜分析，通過(guò)Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、定量所鑒定蛋白質(zhì)的匹配肽段數(shù)，計(jì)算得到各時(shí)間點(diǎn)Cry1Ab/1Ac蛋白質(zhì)匹配肽段數(shù)與消化前匹配肽段數(shù)的比值。Cry1Ab/1Ac在模擬腸液中消化情況總結(jié)列于表6，Cry1Ab/1Ac在模擬腸液中消化15 s內(nèi)比值下降至0.50以下，并且其余各消化時(shí)間點(diǎn)的比值均≤0.50。需要指出的是，雖然表6中比值呈先下降又上升的趨勢(shì)，但均≤0.50，因此仍為已消化。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明Cry1Ab/1Ac在15 s內(nèi)可被消化，在模擬腸液中的消化特性判斷為極易消化。

圖6　轉(zhuǎn)基因生物外源蛋白Cry1Ab/1Ac在模擬腸液中消化的SDS-PAGE圖Fig.6　SDS-PAGE analysis of Cry1Ab/1Ac in stimulated intestinal fluid

表6　模擬腸液消化轉(zhuǎn)基因水稻外源蛋白質(zhì)Cry1Ab/1Ac的質(zhì)譜檢測(cè)Table6　MS analysis of Cry1Ab/1Ac in stimulated intestinal fluid

3　結(jié) 論

蛋白質(zhì)的消化穩(wěn)定性是指外源蛋白在進(jìn)入人體胃/腸消化系統(tǒng)后的降解程度，一般利用人工模擬胃液和腸液在體外進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Astwood［18］首次將體外胃蛋白酶消化實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于食物致敏原的消化穩(wěn)定性評(píng)價(jià)之后，消化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)就成為轉(zhuǎn)基因作物外源蛋白質(zhì)食用安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容之一。Taylor等［19-20］的實(shí)驗(yàn)表明，若一種蛋白質(zhì)在模擬胃液或腸液中能迅速被消化，可認(rèn)為其對(duì)機(jī)體產(chǎn)生致敏作用的概率很小。傳統(tǒng)判定蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性的Western blotting方法，需要制備針對(duì)外源蛋白質(zhì)高度特異的抗體，且極易受胃/腸消化液內(nèi)蛋白質(zhì)及其降解片段等產(chǎn)生的非特異性識(shí)別信號(hào)的干擾，常常難以準(zhǔn)確地判斷蛋白質(zhì)的消化穩(wěn)定性。

質(zhì)譜技術(shù)因其具有高分辨、高靈敏度以及高通量等優(yōu)點(diǎn)，是蛋白質(zhì)定性及定量研究的重要手段?；谫|(zhì)譜的定量分析包括穩(wěn)定同位素標(biāo)記（stable isotopic labeling）和無(wú)標(biāo)記（label-free）兩種方法［21］。圖譜計(jì)數(shù)法首次由Liu Hongbin等［22］提出，是無(wú)標(biāo)記定量方法之一，該方法把蛋白質(zhì)中肽段的鑒定圖譜總數(shù)作為定量指標(biāo)來(lái)定量蛋白質(zhì)，通過(guò)SEQUEST和Mascot等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、定性及定量分析［23-24］。圖譜計(jì)數(shù)法作為一種快速的半定量方法，無(wú)需復(fù)雜的數(shù)據(jù)處理步驟，只需統(tǒng)計(jì)匹配肽段的鑒定圖譜數(shù)，具有概念簡(jiǎn)單、運(yùn)算速率快、假陽(yáng)性率低以及能夠高靈敏度地反映蛋白質(zhì)表達(dá)水平等特點(diǎn)，得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用［12-13］。

本研究基于BLG、BSA和STI成功建立了基于質(zhì)譜檢測(cè)的蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)方法，并且將該方法應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻表達(dá)外源蛋白質(zhì)Cry1Ab/1Ac的消化穩(wěn)定性評(píng)價(jià)中。通過(guò)Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、定量所鑒定目標(biāo)蛋白質(zhì)的匹配肽段數(shù)，根據(jù)各消化時(shí)間點(diǎn)蛋白質(zhì)匹配肽段數(shù)與無(wú)消化液組匹配肽段數(shù)的比值來(lái)判斷目標(biāo)蛋白質(zhì)的消化穩(wěn)定性，若比值≤0.50則判斷為目標(biāo)蛋白質(zhì)在該時(shí)間段內(nèi)已消化。Cry1Ab/1Ac在模擬胃液中消化2 min時(shí)比值下降至0.50以下，為易消化；Cry1Ab/1Ac在模擬腸液中15 s內(nèi)比值下降至0.50以下，為極易消化，表明該外源蛋白質(zhì)在模擬胃/腸消化液中不具有消化穩(wěn)定性。該結(jié)果與基于SDS-PAGE以及用傳統(tǒng)免疫印跡方法獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符［6-7，25］。本研究成功建立了一種基于質(zhì)譜無(wú)標(biāo)記定量的判斷轉(zhuǎn)基因水稻和其他轉(zhuǎn)基因生物及食品中外源蛋白質(zhì)的消化穩(wěn)定性的分析方法。目前我國(guó)質(zhì)譜技術(shù)及儀器已越來(lái)越普及，并且值得注意的是，該技術(shù)具有無(wú)需依賴特異性抗體的優(yōu)點(diǎn)，因此基于質(zhì)譜無(wú)標(biāo)記定量方法的轉(zhuǎn)基因生物外源蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性的檢測(cè)方法具有很強(qiáng)的實(shí)用性和推廣性。

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Mass Spectrometry-Based Analysis of Digestive Stability of Target Protein in Genetically Modified Organism

MAO Jie， SUN Xing， CHENG Juanxian， WANG Xinzheng， ZHAO Yongqiang， WANG Hongxia， HE Kun， XIA Qing*
（National Center of Biomedical Analysis， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100850， China）

Digestive stability analysis of exogenous protein is one of the important indexes of genetically modified organisms（GMO） safety assessment. In the present study， we established a novel assessment assay for protein digestive stability based on label-free quantification of mass spectrometry using bovine β-lacto globulin （BLG）， bovine serum albumin （BSA） and soybean trypsin inhibitor （STI） as standard proteins. Protein samples were treated with simulated gastric/intestinal fluids（SGF/SIF）， and then separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The target bands were then cut out and trypsinized. The extracted peptides were analyzed by nano liquid chromatography-electronic spray ion-mass spectrum/mass spectrum and identified by Mascot software. By calculating the ratio between the matched peptide numbers of the target protein before and after SGF/SIF treatment， the digestibility of the target protein was estimated. When the ratio was lower than 0.50， the target protein was considered digestible. This newly developed assay was applied to Cry1Ab/1Ac，the exogenous protein of the genetically modified rice ‘Huahui No. 1’. The results showed that the ratio was lower than 0.50 after digestion in SGF for 2 minutes， while it decreased to less than 0.50 after digestion in SIF for 15 seconds， indicating that it is very liable to be digested. Our study provides a novel MS-based method for digestive stability analysis of target proteins from genetically modified organisms， which is easy to operate with no need for specific antibody.

genetically modified organisms； digestive stability； mass spectrometry； exogenous protein Cry1Ab/1Ac；lable-free quantification

10.7506/spkx1002-6630-201619011

TS207.3

A

1002-6630（2016）19-0064-06

毛劼， 孫興， 程娟獻(xiàn)， 等. 基于質(zhì)譜檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物外源蛋白質(zhì)的消化穩(wěn)定性［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（19）： 64-69. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619011. http：//www.spkx.net.cn

MAO Jie， SUN Xing， CHENG Juanxian， et al. Mass spectrometry-based analysis of digestive stability of target protein in genetically modified organism［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 64-69. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201619011. http：//www.spkx.net.cn

2015-12-02

國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2014ZX08011007；2016ZX08011007）；國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)（2012YQ180117）

毛劼（1987—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)。E-mail：maojie@proteomics.cn

夏晴（1973—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)槟[瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)、轉(zhuǎn)基因食品安全評(píng)價(jià)。E-mail：qxia@ncba.ac.cn