于瑤，何金丹，王振，李世朋，喻文立，杜洪?。?天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 3009；.天津市第一中心醫(yī)院麻醉科，天津 3009）

肝缺血/再灌注損傷（HIRI）是肝臟手術(shù)過程中常見的病理生理變化[1]，也是導(dǎo)致肝移植術(shù)后早期及晚期移植物功能衰竭甚至患者死亡的主要原因[2]。低溫處理、缺血預(yù)處理及應(yīng)用肝臟保護劑等多種手段已被用于減輕HIRI[3-5]，但仍不能滿足臨床需要，探討更好的肝臟保護機制已成為肝移植領(lǐng)域亟待解決的臨床問題。自噬是廣泛存在于真核生物中的一種溶酶體依賴性降解途徑，是細胞存活、物質(zhì)代謝和再利用的重要途徑[6]。自噬在缺血/再灌注（I/R）過程中起著雙重的調(diào)控作用，對于細胞的存活或凋亡起著至關(guān)重要的作用[7-9]。牡荊素是從山楂葉中提取的黃酮類有效成分，具有抗炎和抗氧化作用[10]，被用于治療心血管疾病。有研究顯示牡荊素對大鼠心肌IRI具有良好的保護作用[11]，但其在HIRI中的作用研究較少，機制尚不明確。本研究就牡荊素對小鼠HIRI的影響進行探究，為認識牡荊素調(diào)控自噬在I/R中的作用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：18只健康的雄性C57BL/6小鼠（體重為20～25 g），由天津醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠6只，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，環(huán)境溫度為22～24℃，相對濕度為40%～60%，自然晝夜。

1.2 試劑：牡荊素（純度為99.8%，西安昊軒生物科技公司）、原位末端標記（TUNEL）試劑盒（德國Roche公司）、兔抗鼠自噬調(diào)控因子Beclin1、抗凋亡相關(guān)基因Bcl-2、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體以及羊抗兔辣根過氧化物酶（HPR）標記二抗（美國CST公司）、ECL Plus超敏發(fā)光液（北京Solarbio公司）。

1.3 建立小鼠肝臟HIRI模型[12]：將小鼠隨機分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血/再灌注組（I/R組）和牡荊素組（Vitexin組）。所有小鼠于實驗前12 h禁食，自由飲水。Vitexin組于術(shù)前6 h腹腔注射10 mg/kg牡荊素。Sham組與I/R組給予等量生理鹽水腹腔注射。所有小鼠稱重后均腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取仰臥位固定。I/R組和Vitexin組于腹部正中切口打開腹腔，暴露臟器，分離肝左葉和肝中葉。用血管夾夾閉肝左葉和中葉脈管總干，使70%肝臟缺血。阻斷成功后，暫時關(guān)閉腹腔，保護腹部切口，1 h后松開血管夾，關(guān)閉腹腔。再灌注時間為12 h。Sham組僅進行開腹、游離第一肝門及關(guān)腹等操作，不夾閉脈管。

1.4 血生化指標分析 ：實驗完成后經(jīng)下腔靜脈取血1 ml，4℃ 3 000 rpm離心15 min后取血清，在天津市第一中心醫(yī)院檢驗科檢測血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平。

1.5 病理檢測：將各組小鼠肝組織固定于10%甲醛水溶液中，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯浸泡，制成肝組織石蠟塊，冰凍切片后進行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察肝組織病理變化。

1.6 TUNEL法檢測肝細胞凋亡情況：將肝組織石蠟切片脫蠟和再水化，經(jīng)蛋白酶K消化處理后，滴加TUNEL反應(yīng)混合液，在37℃濕盒內(nèi)避光孵育1 h。滴加4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液后于熒光顯微鏡下觀察肝細胞凋亡情況。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗（Western Blot）檢測肝組織目的蛋白表達水平：取肝組織樣本加入組織蛋白酶裂解液后勻漿，4℃ 12 000 rpm離心15 min，取上清后用BCA法測定蛋白濃度。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）、轉(zhuǎn)膜、封閉，加一抗（兔抗鼠Beclin1、Bcl-2、LC3、caspase-3、β-actin，1：1 000稀釋）后于4℃孵育過夜。洗膜，用HPR標記的羊抗兔二抗（1：2 500稀釋）室溫孵育1 h，洗膜，混合等體積的超敏發(fā)光液與聚偏二氟乙烯（PVDF）膜反應(yīng)，在暗室中X線片曝光、顯影和定影。

2 結(jié) 果

2.1 血清ALT和AST水平（表1）：I/R組血清中ALT和AST水平明顯高于Sham組；而與I/R組相比較，Vitexin組ALT、AST水平明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 各組小鼠血清ALT、AST水平變化（±s）

表1 各組小鼠血清ALT、AST水平變化（±s）

注：與I/R組相比較，aP＜0.01，bP＜0.001；Sham組為假手術(shù)組；I/R組為缺血/再灌注組；Vitexin組為牡荊素組

血清轉(zhuǎn)氨酶含量（U/L）ALT AST Sham 組 6 82.25±21.41b 124.12±829.71b I/R 組 6 444.31±92.61 623.54±112.05 Vitexin 組 6 201.57±77.12b 311.72±90.91a組別 動物數(shù)（只）

2.2 各組小鼠肝臟病理學(xué)變化（圖1）：小鼠經(jīng)I/R處理后，肝細胞水腫，氣球樣變，肝竇狹窄淤血，出現(xiàn)點灶狀壞死，中性粒細胞大量浸潤；而Vitexin組肝細胞損傷程度明顯減輕，僅部分肝細胞見輕度水腫，中性粒細胞浸潤也明顯減少。

圖1 各組小鼠肝臟病理學(xué)變化（HE×200）

2.3 TUNEL染色結(jié)果（圖2）：Sham組TUNEL標記的凋亡細胞數(shù)量較少；I/R組見大量凋亡的肝細胞；Vitexin組的凋亡細胞明顯減少，各組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 TUNEL染色觀察肝細胞凋亡情況（×200）

2.4 Western Blot結(jié)果（圖3）：I/R組小鼠肝組織caspase-3蛋白表達水平明顯高于Sham組，Bcl-2蛋白表達水平則明顯降低，自噬標記蛋白Beclin1和LC3Ⅱ的表達水平也明顯高于假手術(shù)組（均P＜0.05）。與I/R組相比較，Vitexin組小鼠肝組織caspase-3蛋白表達水平顯著下降，而Bcl-2蛋白表達水平則明顯升高，自噬標記蛋白Beclin1和LC3Ⅱ的表達水平明顯下降（均P＜0.05）。

圖3 各組小鼠肝組織目的蛋白的表達

3 討 論

肝移植是目前終末期肝病最有效的治療手段，隨著外科手術(shù)技巧、早期診斷及相關(guān)臨床輔助技術(shù)的不斷提高，肝移植患者的生存率明顯提高[13-14]。但術(shù)后早期移植物功能恢復(fù)延遲甚至原發(fā)性移植物無功能的發(fā)生率仍較高，成為影響肝移植預(yù)后的主要原因之一，其與供HIRI關(guān)系最為密切[15]。肝臟移植過程中的HIRI是難以避免的，產(chǎn)生的具體機制也尚不明確。因此，如何保護供肝減輕HIRI是目前肝移植研究領(lǐng)域的熱點之一。自噬廣泛存在于真核生物中，在進化上是具有高度保守性的生物學(xué)行為，細胞依賴溶酶體途徑對自身蛋白質(zhì)和細胞器進行降解，清除變性或錯誤折疊的蛋白質(zhì)、損傷或衰老的細胞器，以維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。自噬機制被破壞將導(dǎo)致細胞異常甚至死亡[16]。自噬性細胞死亡又被稱為Ⅱ型細胞凋亡，其與傳統(tǒng)意義的細胞凋亡既有區(qū)別又有聯(lián)系，二者通過復(fù)雜的分子機制相互影響，共同調(diào)控細胞的生存或死亡。越來越多的研究顯示，自噬在肝臟疾病中具有重要作用，如在肝臟缺血時自噬能夠使細胞適應(yīng)環(huán)境的變化，增強細胞生存能力；但再灌注時，過強的自噬則直接導(dǎo)致細胞的程序性死亡，加重肝細胞損傷[17]。牡荊素是從山楂葉中提取的黃酮類有效成分，具有抗炎、抗氧化、降壓和抗癌作用。有研究顯示[18-19]，牡荊素對大鼠腦和心肌IRI具有良好的保護作用，但對HIRI保護作用的相關(guān)研究較少。

基于此背景下，本文就牡荊素對小鼠HIRI的作用以及對自噬的影響進行探究，為認識牡荊素調(diào)控自噬減輕HIRI的作用提供依據(jù)。研究結(jié)果顯示，經(jīng)I/R處理后，小鼠肝組織自噬標記物Beclin1與LC3Ⅱ蛋白的表達水平增加，說明I/R能夠誘導(dǎo)小鼠肝細胞的自噬活性增強；此時，肝細胞出現(xiàn)水腫、壞死，肝竇狹窄，中性粒細胞浸潤，血清中ALT、AST水平明顯升高，說明IRI了肝功能；同時，肝細胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達水平增加，而抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達水平下降，TUNEL染色標記的凋亡細胞數(shù)量亦明顯增加，表明I/R加重了肝損傷。相比之下，Vitexin組小鼠肝組織水腫減輕，中性粒細胞浸潤減少，血清ALT、AST水平明顯降低，表明牡荊素預(yù)處理能夠減輕小鼠HIRI；通過比較分析自噬標記物水平與肝細胞凋亡之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Vitexin組小鼠肝細胞Beclin1、LC3蛋白表達減少，caspase-3蛋白表達水平也明顯下降，而Bcl-2蛋白的表達明顯增加，同時凋亡的肝細胞數(shù)量明顯減少。

綜上所述，牡荊素能夠減輕小鼠HIRI，其機制可能是牡荊素抑制了再灌注時肝細胞自噬的信號通路，進而抑制了自噬性細胞死亡。我們認為牡荊素調(diào)控自噬在HIRI中發(fā)揮重要作用，減少肝移植過程中IRI的發(fā)生，為保護缺血的肝細胞提供依據(jù)，并為臨床更好地保護供肝提供新思路。