程子龍吳海波于濤岳瑞超劉思當(dāng)*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東泰安271018

2.山東大寶養(yǎng)殖加工有限責(zé)任公司，山東泰安271000

3.新泰市新甫街道獸醫(yī)站，山東泰安271200

近期泰安周邊地區(qū)鴨病毒性肝炎流行情況調(diào)查

程子龍1，吳海波2，于濤3，岳瑞超1，劉思當(dāng)1*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東泰安271018

2.山東大寶養(yǎng)殖加工有限責(zé)任公司，山東泰安271000

3.新泰市新甫街道獸醫(yī)站，山東泰安271200

為探究泰安周邊地區(qū)接種鴨病毒性肝炎疫苗或打了卵黃抗體的鴨群仍然發(fā)生病毒性肝炎的真正原因，我們對2014年4～8月份送檢的10份疑似鴨病毒性肝炎病例進(jìn)行了剖檢診斷、組織病理學(xué)觀察及RT-PCR檢測，并進(jìn)行遺傳進(jìn)化及同源性分析。結(jié)果顯示，10份病例在臨床癥狀及病理學(xué)變化上均符合鴨病毒性肝炎的特征，但只有7份病例PCR診斷為DHV陽性，3份為陰性。這7份病毒的VPO基因同源性在98.6%～100%，與DHV-A、DHV-B處于不同分支，同源性均不足76%，與中國分離株JS2010、C-YCW處于較小的分支上，同源性在98.3%～98.9%，親緣關(guān)系最近，但為不同小分支，表明我們檢測到的鴨病毒性肝炎毒株為DHV-C型，但與中國分離株JS2010、C-YCW存在一定差異性。以上結(jié)果表明，DHV-C已成為魯中地區(qū)當(dāng)前流行的優(yōu)勢毒株，注射針對DHV-A的疫苗或卵黃抗體無效現(xiàn)象的發(fā)生可能與此有關(guān)。

鴨病毒性肝炎；流行；新型

鴨病毒性肝炎（DVH）是由鴨病毒性肝炎病毒（DHV）引起的以雛鴨肝臟出血為特征的高致死率接觸性傳染病?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為有三種不同的病毒與該病有關(guān)，分別是1型、2型和3型［1］。Kim報道了他們分離的5株DHV-1的全基因組序列，建議將其劃分為小RNA病毒科的一個新成員［2］。2005年，在“國際病毒分類委員會的第八次報告”中，已將2型DHV歸入星狀病毒科星狀病毒屬，命名為1型鴨星狀病毒［3］。Todd等通過對RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析和同源性比較后發(fā)現(xiàn)，3型DHV也是一種星狀病毒［4］；但它有別于1型鴨星狀病毒，與2型火雞星狀病毒關(guān)系更為密切。1型和3型DHV之間沒有任何抗原相關(guān)性［5］。

其中，1型鴨病毒性肝炎呈世界性分布，流行于美國、英國、韓國、加拿大等國家［5，6］；而2、3型鴨病毒性肝炎病毒感染則具有明顯的地域性，2型感染僅見于英格蘭的東英地區(qū)，且自20世紀(jì)80年代中期暴發(fā)后，該地區(qū)也再未發(fā)生過［5，7］。至今，3型鴨病毒性肝炎主要在美國發(fā)生［5，8，9］。近年來，國內(nèi)各地不斷出現(xiàn)免疫了DHV-1疫苗或者打了鴨病毒性肝炎卵黃抗體之后仍然發(fā)病的報道，人們懷疑可能是DHV-1變異株和新的血清型DHV感染所致。這些新型DHV目前被分為臺灣新型和韓國新型DHV［12］。不同血清型的DHV的基因分析結(jié)果表明，DHV-1和新型（臺灣新型和韓國新型）DHV位于小RNA病毒科中不同分支上。Wang等建議將血清1型、臺灣新型和韓國新型分為DHVA、B和C三種基因型。

近年來，隨著山東畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，鴨的養(yǎng)殖量越來越多，而鴨病也變得異常復(fù)雜。在山東地區(qū)，許多鴨場在用了鴨病毒性肝炎疫苗或卵黃抗體以后依舊發(fā)病，而且傷亡嚴(yán)重，給養(yǎng)殖場/戶造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為了進(jìn)一步了解近期鴨病毒性肝炎的流行情況、發(fā)病特點、發(fā)病原因及病原特征，制定相應(yīng)的防治措施，我們對2014年4～8月份以來送診的疑似鴨病毒性肝炎臨床病例進(jìn)行了流行病學(xué)、病理學(xué)、病毒學(xué)等系列化調(diào)查研究。

1　材料與方法

1.1實驗材料

鴨病毒性肝炎臨床疑似病例主要來自山東泰安及其周邊地區(qū)的發(fā)病肉鴨養(yǎng)殖場；病理組織學(xué)切片及染色在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動科院生物切片室進(jìn)行；DL5000 DNA Marker、無RNase雙蒸水，EasyPureTMViral DNA/RNA Kit購自北京全式金生物科技有限公司；EasyScriptTMOne-Step RT-PCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1病料采集對送診的疑似鴨病毒性肝炎病例進(jìn)行病理學(xué)剖檢，對符合鴨病毒性肝炎病變的疑似病例，詳細(xì)記錄病死鴨信息，并進(jìn)行編號。取腦、肝、脾、心臟等器官組織，分成兩份，一份用10%的福爾馬林溶液固定；另一份貯存于-80℃冰箱。

1.2.2組織病理學(xué)觀察將在10%福爾馬林溶液中固定好的組織經(jīng)修塊、水沖、酒精梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切片流程制作常規(guī)石蠟切片，然后進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織學(xué)病變。

1.2.3RNA提取及PCR鑒定取-80℃冰箱中保存的疑似鴨病毒性肝炎的病鴨組織，將各組織用勻漿機(jī)進(jìn)行混合研磨，4000 rpm離心5 min，棄掉沉淀，取上層液體作為提取的樣本，并做相應(yīng)的編號。按照EasyPureTMViral DNA/RNA Kit說明書的步驟進(jìn)行RNA提取。參考張臣偉根據(jù)1型鴨病毒性肝炎VP0基因設(shè)計的引物：F：GCTCCAGACTAGTTCCTGAGG；R：CGGAGATCCAAGATGGCATA進(jìn)行RT-PCR檢測，目的片段684 bp。20 μL體系組成如下：EasyScript One-Step Enzyme Mix 0.3 μL，2×One-Step Reaction Mix 10 μL，RNase-free Water 4.7 μL，上游引物F（10 μM）1 μL，下游引物R（10 μM）1 μL，模板3 μL，RT-PCR反應(yīng)條件如下：42℃反轉(zhuǎn)錄25 min，95℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入30個循環(huán)（95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s），最后72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.4序列測定及分析將鴨病毒性肝炎的陽性PCR產(chǎn)物送去華大基因進(jìn)行測序，測序結(jié)果在DNAstar上與1型參考株（A、B、C型）進(jìn)行比對，繪制遺傳進(jìn)化樹及遺傳距離圖。

2　結(jié)果

2.1疑似病例癥狀表現(xiàn)及剖檢病變

病鴨精神沉郁，采食量減少，運(yùn)動失調(diào)，死時呈角弓反張姿勢。病死鴨主要表現(xiàn)肝腫大，顏色變淺，表面有斑點狀出血。膽囊腫大，充滿墨綠色膽汁。腎腫大，充血呈鮮紅色，切面隆起，邊緣外翻。有些病例胰腺有局灶性壞死。有的病例還見心內(nèi)外膜條紋狀出血病變。

2.2組織病理學(xué)病變

肝細(xì)胞普遍腫脹，呈空泡變性及脂肪變性病變，常見嚴(yán)重的出血性壞死，壞死肝細(xì)胞核碎裂、崩解，肝細(xì)胞溶解成均質(zhì)紅染的顆粒狀物質(zhì)，其中散在多少不等的紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和異嗜性粒細(xì)胞。個別病例可見膽管上皮細(xì)胞、卵圓細(xì)胞、間質(zhì)結(jié)締組織增生。脾臟、胰腺實質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)不同程度的變性、壞死。腎小管上皮細(xì)胞普遍發(fā)生顆粒變性、水泡變性，并見不同程度的壞死，有的見許多異嗜性粒細(xì)胞浸潤。大部分病鴨可見輕度的病毒性腦炎病變，只有個別病例出現(xiàn)典型的袖套現(xiàn)象、小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)狀增生。

2.3PCR鑒定結(jié)果

2.3.1檢測結(jié)果對臨床上具有明顯的神經(jīng)癥狀、剖檢肝臟出血的病例進(jìn)行了PCR檢測。結(jié)果見表1，

10份病例中有7份為陽性，3份為陰性。

表1　DHV-1型鴨病毒性肝炎檢測結(jié)果Table 1 The test results of DHV-1

2.3.2PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果10份PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有7份PCR產(chǎn)物在684 bp處有一條很亮的條帶，與預(yù)期的目的片段大小一致，為陽性；有3份PCR產(chǎn)物呈陰性（圖1）。

2.4VP0基因的遺傳進(jìn)化分析

將7株DHV-1陽性PCR產(chǎn)物測序，與DHV-1經(jīng)典代表株C80、A66，B型參考株04G、90D，C型參考株AP-03337、AP-04009、AP-04114、C-YCW、C-YCZ、C-YDF以及1型變異株1v等參考株進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)我們所獲得的7株分離株與韓國C型處在同一大的分支，親緣關(guān)系較近，從圖中可以看到，分離株與中國JS2010、C-YCW分離株處于較小的分支上，親緣關(guān)系最近，但為不同小分支，表明這些新型分離株與中國分離株JS2010、C-YCW存在一定差異性，與DHV-B、DHV-A處于不同的分支（圖2）。分離株的VP0基因序列表明，7株流行株（1、3、4、5、7、8、10號）之間的同源性在98.6%～100%（圖3），與韓國C型的同源性在95.4%～95.9%，與中國分離株C-YCW的同源性98.3%～98.9%，與臺灣型的同源性在74.8%～75.6%，與傳統(tǒng)1型A66的同源性僅為73.3%～73.8%。所以，分離的7株流行株均為DHV-C。

圖2　分離株與參考株的遺傳進(jìn)化分析Fig.2 Evolutionary analysis on isolated and check strains

圖3　分離株與參考株的同源性分析Fig.3 Homologous analysis on isolates and check strains

3　討論

（1）新型鴨病毒性肝炎的臨床癥狀、剖檢病變以及組織病理學(xué)變化與經(jīng)典的DVH基本相似，很難從這些方面對DHV的血清型進(jìn)行鑒別診斷。

（2）從發(fā)病日齡上看，有的鴨群在27、30日齡時發(fā)病，與以往的經(jīng)典鴨病毒性肝炎相比，發(fā)病日齡不僅僅局限在3～21日齡，有延遲的趨勢。

（3）10份具有肝臟出血、死后角弓反張癥狀的病例中，有3份為陰性，可能與黃曲霉素中毒或坦布蘇病毒感染有關(guān)，因為進(jìn)一步檢測有些鴨飼料黃曲霉毒素嚴(yán)重超標(biāo)，并檢測到鴨坦布蘇病毒感染。

（4）2002年，蘇敬良等從北京發(fā)病的北京雛鴨和廣西櫻桃谷病死鴨中分離到2株與1型鴨病毒性肝炎病毒無血清學(xué)相關(guān)性的病毒，將其暫定為新型鴨病毒性肝炎病毒（N-DHV）［10］。2006年，劉建等從北京、河北、山東和廣西等地送檢并具有明顯的肝臟出血病變特征的雛鴨肝臟中分離到9株病毒株，通過對其進(jìn)行血清學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)其中7株為新型鴨病毒性肝炎病毒，2株為1型鴨病毒性肝炎病毒［11］。本次的調(diào)查結(jié)果表明，山東省大多數(shù)地區(qū)由以前流行的經(jīng)典DHV-A已經(jīng)轉(zhuǎn)變成DHV-C，而多數(shù)疫苗或卵黃抗體是針對過去廣泛流行的DHV-A（如A66、C80等），這也解釋了用傳統(tǒng)的鴨病毒性肝炎弱毒疫苗或卵黃抗體無法預(yù)防該病的主要原因。

（5）雖然本次檢測到的鴨病毒性肝炎毒株均為DHV-C，但是并不代表山東省只存在該型鴨病毒性肝炎病毒，也可能存在經(jīng)典鴨病毒性肝炎病毒。因為大多數(shù)肉鴨養(yǎng)殖場都使用A型鴨病毒性肝炎弱毒苗或者卵黃抗體，經(jīng)典毒株已得到基本控制，DHV-C已成為優(yōu)勢流行毒株。

（6）2008年，朱明霞等曾對淄博市8個區(qū)縣的218例鴨病毒性肝炎病例進(jìn)行調(diào)查分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鴨群病毒性肝炎病占鴨發(fā)病數(shù)的42.5%，發(fā)病率為15.7%～22.7%，死亡率為11%～14%［13］；2012年，朱俊平等對濰坊地區(qū)22個鴨病毒性肝炎的鴨群進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病率3%～70.7%，病死率為8.6%～70.3%［14］。由上可見，目前，鴨病毒性肝炎仍然是危害鴨群的最主要疫病，經(jīng)濟(jì)損失慘重，應(yīng)該予以重視。

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The Recent Investigation forthe Prevalence of DuckVirus Hepatitis in Peripheral Regions ofTai'an City

CHENG Zi-long1，WU Hai-bo2，YU Tao3，YUE Rui-chao1，LIU Si-dang1*
1.College of Animal Science and Technology/Shandong Agriculture University，Tai'an 271000，China
2.Shandong Dabao Breeding and Processing Co.ltd，Tai'an 271200，China
3.Veterinary Station of Xinpu Street in Xin'tai City，Xin'tai 271200，China

In the present study we investigated the prevalence and molecular characterization of Duck hepatitis virus in and around Tai'an area.From the suspected duck population we collected about 10 samples during the period of April to August 2014.Initially these samples were evaluated by necrscopsy，histopathological observation and RT-PCR findings.For further confirmatory studies these samples were subjected to genetic evaluation and homology analysis.The clinical symptoms and histopathological changes revealed that all the samples showed the presence of duck virus hepatitis.Out of the total samples seven were conformed for the presence of viral RNA by RT-PCR.The genetic evaluation and homology analysis of the positive sample on VP0 gene was 98.6%～100%，showed close similarities with previously reported Chinese isolates JS2010 and C-YCW homologies，98.3%-98.9%.Although these isolates having close phylogenetic relationship but still having some variation in the small branches，which suggested that the present isolates having certain difference from the previous isolates. It is clear that DHV isolate from all the positive samples having less than 76%similarity with DHV-A and DHV-B.Taken together，results suggest that DHV isolated from Shandong province of china is different from the early isolated DHV-A and DHV-B type and is conceder as a new DHV type（DHV-C）.Thus for the better control of this economically important disease in Shandong province，it is necessary to use the newly isolated strain for Vaccine preparation.

DVH；prevalence；new type

S858.32

A

1000-2324（2016）05-0674-04

2015-03-19

2015-04-08

山東省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目：肉鴨重大疫病綜合監(jiān)控技術(shù)集成與示范（20123082）

程子龍（1991-），男，山東聊城人，在讀碩士，研究方向為動物臨床病理學(xué).E-mail：chengzilong2014@126.com

Author for correspondence.E-mail：liusid@sdau.edu.cn