白雪峰，劉躍娟，齊 靖，張 建

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)醫(yī)學(xué)信息學(xué)院，黑龍江大慶，163319）

胰腺癌中miRNAs、mRNAs基因表達(dá)譜分析

白雪峰，劉躍娟，齊 靖，張 建

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)醫(yī)學(xué)信息學(xué)院，黑龍江大慶，163319）

本文研究miRNAs、mRNAs在胰腺癌中的調(diào)控機(jī)制。通過對胰腺癌表達(dá)譜進(jìn)行分析，基于生物信息學(xué)方法，建立miRNAs-mRNAs網(wǎng)絡(luò)，通過模塊挖掘獲得5個(gè)功能顯著性模塊，網(wǎng)絡(luò)中結(jié)點(diǎn)度較大的HUB節(jié)點(diǎn)miRNAs，這些結(jié)點(diǎn)與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。對每個(gè)模塊進(jìn)行聚類分析，得到度數(shù)小卻聚集的集合，這些基因也和胰腺癌密切相關(guān)。對這些模塊進(jìn)行功能注釋，多個(gè)模塊注釋到代謝相關(guān)的功能上，表明胰腺癌與代謝密切相關(guān)；另外，多個(gè)模塊中具有多個(gè)相同功能注釋，多個(gè)調(diào)控相反的功能在同一模塊當(dāng)中出現(xiàn)。這表明在組織自身原來就存在著平衡調(diào)控機(jī)制。通過本文的研究得到miRNAs與mRNAs協(xié)同作用的一些結(jié)果，為今后更深入的研究胰腺癌提供指導(dǎo)和借鑒。

胰腺癌；miRNAs；mRNAs；協(xié)同

0 引言

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）因其起病隱匿、早期診斷難、手術(shù)切除困難、放化療不敏感以及預(yù)后差、死亡率高等原因，成為危害最大的惡性腫瘤之一，其中90%以上為胰腺導(dǎo)管腺癌。因此，深入了解胰腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的潛在治療靶點(diǎn)尤為重要［1-2］。

近幾年的研究表明，miRNA的表達(dá)水平與人類重大疾病如癌癥等密切相關(guān)。這使得miRNA可以作為新的生物標(biāo)志物用于癌癥等重大疾病的早期診斷并可作為新的基因藥物作用靶點(diǎn)。

最近，研究發(fā)現(xiàn)miRNA在胰腺癌中存在多個(gè)異常表達(dá)，有的是在胰腺癌癌前病變中研究中發(fā)現(xiàn)的［7-8］；有的是在胰腺癌組織標(biāo)本中研究發(fā)現(xiàn)的；還有的是在胰腺癌病人血清中研究中發(fā)現(xiàn)的［9-10］。因此研究者認(rèn)為這些差異表達(dá)的miRNA或許會為研究胰腺癌提供新的線索。

目前，雖然識別出一些與胰腺癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的miRNAs和mRNAs，但大部分miRNAs和mRNAs在胰腺癌中的作用還是未知的。本研究從miRNA、mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，構(gòu)建胰腺癌疾病網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行失調(diào)網(wǎng)絡(luò)的模塊挖掘，初步探索其作用機(jī)制，為揭示胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中miRNA與mRNAs的關(guān)系和調(diào)控作用機(jī)制提供新的線索，為胰腺癌的生物治療提供理論依據(jù)。

1 miRNA與動脈粥樣硬化

1.1 數(shù)據(jù)準(zhǔn)備

從 NCBI上下載mRNA芯片數(shù)據(jù)（GSE43795）和miRNA芯片數(shù)據(jù)（GSE43796），兩種芯片包括相同的11病人樣本（5 normal/6 PCA），數(shù)據(jù)處理得到30500個(gè)mRNA和1205miRNA。差異基因的選取通過SAM算法獲得，通過R代碼進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，選取差異表達(dá)的mRNA和miRNA（q-value>0.001和q-value>0.05），得到1585mRNAs和106個(gè)miRNAs，這些差異表達(dá)的mRNAs和miRNAs作為胰腺癌的潛在致病因素。miRNAs與mRNA的互作對從HMDD數(shù)據(jù)庫下載，與疾病相關(guān)的miRNAs為117，與胰腺癌miRNA芯片取交集共有miRNAs92個(gè)，這些數(shù)據(jù)將用做以后分析使用。對獲得的疾病表達(dá)譜數(shù)據(jù)為獲得更多關(guān)于胰腺癌生物學(xué)信息，通過以下步驟行處理（圖1）。利用差異表達(dá)的mRNAs和在HMDD數(shù)據(jù)庫miRNA調(diào)控的mRNAs映射到KEGG通路當(dāng)中，通過Subpathway-GM進(jìn)行子通路挖掘，最終形成mRNAs-miRNAs互作網(wǎng)絡(luò)。用Cytoscape插件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行功能模塊挖掘，獲得5個(gè)功能顯著性模塊，最后通過David進(jìn)行基因的功能注釋。

1.2 表達(dá)譜網(wǎng)絡(luò)分析

利用Subpathwaymine 進(jìn)行子通路重構(gòu)，合并子通路形成miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)，結(jié)點(diǎn)數(shù)731個(gè)，其中包括mRNAs和mRNAs（91/640），3030條邊。點(diǎn)表示基因，邊表示兩個(gè)基因間的聯(lián)系，在網(wǎng)絡(luò)中，度越大的基因連接的邊越多，表明在網(wǎng)絡(luò)中可能起到HUB結(jié)點(diǎn)的作用。另外，還有一些結(jié)點(diǎn)雖然度小，但在結(jié)點(diǎn)間傳輸起到重要作用的橋梁作用，這些結(jié)點(diǎn)的關(guān)系，可能作為PCA中的潛在的致病基因。

圖1 數(shù)據(jù)分析流程圖

1.3 網(wǎng)絡(luò)模塊挖掘

利用Cytoscape中的JActivemodule插件進(jìn)行模塊挖掘。獲得5個(gè)功能性顯著模塊（module1～module5）。用ClusterOne進(jìn)行對模塊進(jìn)行聚類，尋找顯著性miRNA-mRNA互作對（p-value<0.05）。

1.4 Gene ontology（GO）分析

通過David在線平臺完成對模塊中重要結(jié)點(diǎn)進(jìn)行功能分析，篩選出具有診斷意義的顯示miRNA-mRNA關(guān)系對。

miRNAs在許多疾病的發(fā)生與發(fā)展中扮演了重要的角色，有研究證明，在疾病中miRNAs對mRNAs的調(diào)控行使著重要的生物學(xué)功能。通過以上步驟進(jìn)一步對胰腺癌中miRNAs對mRNAs的調(diào)控關(guān)系做出探索。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)miRNAs、mRNAs

對PCA表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到差異表達(dá)的mRNAs、miRNAs數(shù)量分別為1585、106個(gè)。取表達(dá)譜差異的mRNAs、miRNAs前5%做熱圖，結(jié)果如圖2所示。在miRNAs表達(dá)譜的熱圖中，module1中顯著表達(dá)的有mir-320c；module2包括:mir-222、mir-92b、mir-320c；moudule3則有mir-320c、mir-320b、mir-654、mir-92a、mir-92b；module4含有mir-222、mir-320c、mir-92b；module5未出現(xiàn)上述熱圖中的miRNAs。通過比較可知，表達(dá)譜中mir-222在兩個(gè)模塊中出現(xiàn)，mir-92b在三個(gè)模塊中出現(xiàn)，而mir-320c在module1～module4模塊中全部出現(xiàn)。研究表明［11］mir-222通過靶向p57控制癌細(xì)胞的增殖。而mir-92b在胰腺癌的研究中未有文獻(xiàn)報(bào)道，mir-92b在膀胱癌中僅對癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和浸襲起作用，卻不會促使細(xì)胞的增殖［12］。miR-222可能通過MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控［13］。文獻(xiàn)［14］報(bào)道m(xù)ir-320c可能是通過另外一種模式lncRNA-mi RNA-mRNA進(jìn)行調(diào)控。

圖2 mRNAs和miRNAs表達(dá)譜熱圖

在mRNAs表達(dá)譜的熱圖中，module2中顯著表達(dá)的有YWHAH；module3中含有GLS2、YWHAH；module4含有IFNA16；module5出現(xiàn)熱圖中ACADL、YWHAH。通過比較可知，表達(dá)譜中YWHAH在moudule2、moudule3、moudule5中出現(xiàn)。 促血管形成Gremlin 1 通過綁定YWHAH可能發(fā)揮著致癌作用，這一結(jié)果在宮頸癌肺癌、卵巢、腎、乳腺癌、結(jié)腸、胰腺癌中得到證實(shí)，Gremlin 1結(jié)合目標(biāo)蛋白YWHAH可能為人類癌癥的提供新的診斷和治療方案［15］。ACADL顯著表達(dá)與胰腺固狀瘤有關(guān)［16］。而GLS2蛋白質(zhì)對腫瘤的生長有抑制作用［17］。

2.2 miRNAs-mRNAs網(wǎng)絡(luò)模塊

癌癥屬于復(fù)雜疾病，對建立的疾病網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)證明顯現(xiàn)冪律分布［18］，從網(wǎng)絡(luò)分析來看，網(wǎng)絡(luò)中結(jié)點(diǎn)度越大的點(diǎn)，表明可能會影響更多的鄰居結(jié)點(diǎn)，因此，這些點(diǎn)被考慮扮演hubs結(jié)點(diǎn)的角色。圖3顯示miRNAs-mRNAs網(wǎng)絡(luò)結(jié)點(diǎn)的度分布是冪律分布。通過模塊挖掘來研究miRNAs、mRNAs在癌癥當(dāng)中的共調(diào)控方式、以及基于局部策略來分析miRNAs的在胰腺癌中的功能。

圖3 網(wǎng)絡(luò)度分布

根據(jù)得到的5個(gè)功能模塊當(dāng)中（圖4），大部分miRNAs具有較大的度（表1），如:mir-615、mir-222、mir-93-5p、mir-415-3p、mir-877等。在各個(gè)模塊中有些結(jié)點(diǎn)的度較大，mir-93-5p在5個(gè)模塊中度分別為:19、19、23、26、20；mir-222在模塊二、四、五的度數(shù)為:15、12、15；mir-24在模塊二、三、四、五分別為:18、19、18、13；mir-98在模塊四、五都為45。mir-615-3p在模塊一、二結(jié)點(diǎn)度為61、和65。有意思的是，研究證明hsa-miR-615-5p其異常表達(dá)可能與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)，mir-615-5p對胰腺癌有抑制作用［19］，而在前面表達(dá)譜數(shù)據(jù)中mir-615-5p是下調(diào)的，mir-615-3p是上調(diào)的；mir-615-5p、mir-615-3p分別通過不同的方式來調(diào)節(jié)mRNAs表達(dá)。

表1 模塊中的邊和點(diǎn)

在五個(gè)模塊中，對模塊進(jìn)一步分析，通過clusterone插件對模塊進(jìn)行挖掘，通過挖掘每個(gè)模塊中重要節(jié)點(diǎn)用紅色標(biāo)出，這表明除了度大的點(diǎn)起到了HUB結(jié)點(diǎn)的作用，在網(wǎng)絡(luò)中還有一些結(jié)點(diǎn)度雖然小，在局部聯(lián)系較為緊密，成為一個(gè)團(tuán)隊(duì)發(fā)揮著作用，這些合作的結(jié)點(diǎn)可能在疾病發(fā)生過程中起到作用。在模塊一中RPL32、mir-186-5p、RPL27、RPL29、mir-652-3p聚在一個(gè)集合中，在這個(gè)小集合中，在狗身上檢測到RPL32在各組織上表達(dá)都是穩(wěn)定的［20］，在胰腺癌中mir-186 -5p影響細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［21］，mir-652與ZEB1結(jié)合抑制胰腺癌腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)（EMT）的酸性微環(huán)境，酸性/ mir-655/ZEB1/EMT可能是腫瘤發(fā)生的新機(jī)制［22］。模塊二中YWHAH、FOXO3、CDC25C、YWHAB、YWHAZ構(gòu)成的集合中，YWHAH、FOXO3、CDC25C與胰腺癌密切相關(guān)［15］［23］［24］。從模塊二中還可以看到Y(jié)WHAH和mir-186直接相連，F(xiàn)OXO3和mir-615-3p直接相連，mir-615-3p在模塊中起到了HUB結(jié)點(diǎn)的作用。另外mir-744、RAN、EIF4G1作為一組聯(lián)系緊密的集合被發(fā)現(xiàn)，miR-744 發(fā)現(xiàn)成為新的預(yù)后標(biāo)記物［25］，而RAN通過AR和CXCR4調(diào)控胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移［26］。RAN也與mir-615-3p直接相連。模塊三中mir-10a、mir-320c、LDHA、MT-CO3被聚在一起，DNMT3A綁定HK1和LDHA，而這兩個(gè)基因作為代謝開關(guān)，動物實(shí)驗(yàn)表明敲降這兩個(gè)基因會引起dnmt3a缺失，進(jìn)一步證明了DNA甲基化與胰腺β細(xì)胞的功能直接作用關(guān)系［27］。MT-CO3與糖尿病有關(guān)［28］。過表達(dá)mir-10a會抑制HOXA1并引起胰腺癌局部侵襲［29］。通過研究表明，mir-320c通過SMARCC1在治療胰腺癌中對藥物吉西他賓（gemcitabine） 產(chǎn)生抗藥性［30］。模塊四當(dāng)中發(fā)現(xiàn)新的集合mir-122-5p、EGLN3、EPAS1，其中mir-122與多個(gè)miRNAs篩選作胰腺癌血液中的標(biāo)記物［31］；EGLN3與胰腺癌腫瘤細(xì)胞的分化、增殖有關(guān)［32］；干擾EPAS1用作治療胰腺癌疾?。?3］。模塊五中YWHAH、FOXO3、CDC25C、YWHAB、YWHAZ與模塊二中的集合相同，mir-125a-5p、TCEB2、EPAS1單獨(dú)聚在一起，降低mir-125a-5p的表達(dá)，會抑制胰腺腫瘤的增殖和細(xì)胞周期，并促進(jìn)早期癌細(xì)胞的凋亡［34］。TCEB2m則可能用于卵巢癌的治療［35］。

2.3 模塊功能分析

五個(gè)模塊分別進(jìn)行GO功能注釋（圖5），以上五個(gè)模塊注釋來看，在多個(gè)模塊或同一模塊當(dāng)中多次出現(xiàn)注釋到一對相反的功能上，如:positive regulation of biological process和process、negative regulation of biological process；positive regulation of metabolic process、 negative regulation of metabolic process等，這表明在組織自身原來就存在著平衡調(diào)控機(jī)制，這些功能的失衡可能會引起疾病發(fā)生。多個(gè)模塊注釋到代謝相關(guān)的功能上，從功能上說明疾病也與代謝密切相關(guān)。另外除了細(xì)胞周期的功能之外，還有甲基化功能也被注釋。通過功能注釋表明多個(gè)基因通過協(xié)同在多個(gè)模塊中來行使某一功能，而多個(gè)相同的功能可能通過多個(gè)基因在不同的途徑下實(shí)現(xiàn)。

圖4 miRNAs-mRNAs模塊圖

圖5 模塊功能注釋

3 結(jié)語

為了明確胰腺癌中miRNAs與mRNAs如何行使調(diào)控作用，通過對胰腺癌芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到miRNA-mRNAs網(wǎng)絡(luò)，對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊挖掘獲得5個(gè)顯著性模塊，對模塊進(jìn)行分析，mir-615-3p、mir-222、mir-93-5p、mir-415-3p、mir-877在網(wǎng)絡(luò)中起到了HUB節(jié)點(diǎn)的作用，其中mir-222在表達(dá)譜中差異表達(dá)。在模塊當(dāng)中還有一些節(jié)點(diǎn)度雖然比較小，通過聚類方式發(fā)現(xiàn)這些結(jié)點(diǎn)以“團(tuán)隊(duì)”合作的方式行使功能，如:YWHAH、FOXO3、CDC25C、YWHAB、YWHAZ，通過文獻(xiàn)也發(fā)現(xiàn)這些成員與胰腺癌的發(fā)生都有密切關(guān)系。從功能上多個(gè)模塊中出現(xiàn)相反的功能注釋，如:positive regulation of cellular process、negative regulation of cellular process。一方面表明這些模塊中存在著的行使相同功能的基因，另一方面也表明，在同一模塊當(dāng)中一些基因在平衡著這些功能起到重要作用。從功能注釋到甲基化，說明癌癥的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，是多階段、多因素復(fù)雜作用的結(jié)果。

最后，通過本文的研究，發(fā)現(xiàn)miRNAs與mRNAs協(xié)同作用的一些結(jié)果，為今后更深入的研究胰腺癌提供指導(dǎo)和借鑒。

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miRNAs and mRNAs gene expression profile analysis in pancreatic cancer

BAI Xue-feng， LIU Yue-juan， QI jing， ZHANG jian
（Department of Medical Informatics， Harbin Medical University， Daqing， 163319， China）

In this paper，we study miRNAs-mRNAs regulatory mechanism about pancreatic cancer。Application of bioinformatics method，we set up the miRNAs-mRNA disease network by the pancreatic cancer expression profile，and obtain five significance functional module by mining module of plugins .The larger degree nodes of miRNAs play a role HUB node in this network，while these are closely related to the initial and development of pancreatic cancer. whereafter use of clustering method to each module. the small degree nodes are gathered a collection，of these are more closely related to pancreatic cancer. The GO annotation of genes showed that pancreatic cancer was closely correlated to the metabolism function； moreover，many of same functional annotation appear in multiple modules，while many contrary of functional annotation appear in the single module. This suggests that there is a balance in its original regulatory mechanism.In this paper，achieved some synergy results about of miRNAs-mRNAs，these results may provide reference and help for future disease research on pancreatic cancer。

Pancreatic cancer；mRNAs；mRNAs；Synergy

黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題（編號:2013116）

白雪峰，男，講師，主要研究方向生物信息學(xué)。