李海龍，呂雅麗，魚麗娟，吳守振

SGK1調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞分化在高血壓中的作用

李海龍，呂雅麗，魚麗娟，吳守振

目的 探討 SGK1 在高血壓外周血 CD4+T 淋巴細(xì)胞中的表達(dá)，揭示 SGK1 通過調(diào)節(jié) Th17 細(xì)胞的功能在高血壓中的作用。

方法 收集高血壓患者病例，依據(jù)臨床診斷分成 I 級(jí)、II 級(jí)和 III 級(jí)。FCM 檢測(cè) Th17 細(xì)胞在高血壓患者外周血中的比例，ELISA 檢測(cè) IL-17A 在血清中的表達(dá)水平。從高血壓患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中分選 CD4+T 淋巴細(xì)胞，real-time PCR 檢測(cè) SGK1 的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè) RORC 的表達(dá)水平。構(gòu)建高血壓大鼠模型，HE 染色觀察腎組織炎癥變化，免疫組織化學(xué)檢測(cè)腎組織中 SGK1 的水平。

結(jié)果 與健康對(duì)照相比，高血壓患者外周血 Th17 細(xì)胞的比例和血清中 IL-17A 的水平明顯升高，且隨高血壓分級(jí)越高，Th17 細(xì)胞比例和 IL-17A 血清水平越高。SGK1 的表達(dá)在高血壓患者 CD4+T 淋巴細(xì)胞中顯著升高。更為重要的是，SGK1 的表達(dá)與 RORC 和 IL-17A 具有正相關(guān)性。在高鹽誘導(dǎo)的高血壓大鼠模型中，血清 IL-17A 的水平明顯高于正常對(duì)照組。與對(duì)照組比較，高血壓組的腎組織出現(xiàn)了明顯的炎癥變化和浸潤的淋巴細(xì)胞，SGK1 在腎組織中的表達(dá)明顯升高。

結(jié)論 高血壓中 Th17 細(xì)胞的比例明顯升高，SGK1 通過調(diào)節(jié) Th17 細(xì)胞的功能促進(jìn)了高血壓的進(jìn)展。

血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶 1； Th17細(xì)胞； 高血壓； IL-17A

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(5):426-431

在全球，高血壓的發(fā)病率和死亡率逐年升高，流行病學(xué)表明，全球近 10 億人患有高血壓，每年約有 750 萬患者死于高血壓［1］。在我國，高血壓患者已超過 2 億［2］。因此，高血壓已成為心血管最重要的危險(xiǎn)因素之一。臨床上，高血壓分為原發(fā)性高血壓和繼發(fā)性高血壓。其中，原發(fā)性高血壓占 95%以上［3-4］。高血壓發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是遺傳和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，鹽是重要的環(huán)境因素之一［5］。研究表明，鹽敏感人群的高血壓發(fā)病率和病死率均高于鹽抵抗性人群［6-8］。

血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶 1（serum and glucocorticoid-inducible kinase 1，SGK1）是醛固酮和胰島素依賴的集合管上皮鈉通道（ENaC）活性和其在細(xì)胞質(zhì)膜密度的正調(diào)節(jié)因子［9］。由于SGK1 對(duì) ENaC 激活的影響，SGK1 能夠提高腎小管細(xì)胞對(duì)鹽的重吸收［10-11］。因此，提高 SGK1 的活性將會(huì)導(dǎo)致高血壓［12］。近來的研究表明，SGK1能夠誘導(dǎo) Th17 細(xì)胞的分化，促進(jìn)炎癥的發(fā)展［13-14］。本研究，我們探討 SGK1 調(diào)節(jié) Th17 細(xì)胞分化在高血壓中的作用，進(jìn)一步揭示 SGK1 通過調(diào)節(jié) T淋巴細(xì)胞功能促進(jìn)炎癥誘導(dǎo)高血壓的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 2014 年 6 月 - 2015 年 9 月在西安市第九醫(yī)院確診和治療的原發(fā)性高血壓患者 76例，其中，男性 43 例，女性 33 例；年齡43 ～ 71歲，平均（57.63 ± 9.24）歲。依據(jù)高血壓分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為：高血壓 I 級(jí) 33 例，高血壓 II 級(jí)27 例和高血壓 III 級(jí) 16 例。另選取 60 例健康人群作為對(duì)照研究，其中，男性 35 例，女性25 例；年齡 42 ～ 70 歲，平均（55.37 ± 8.43）歲。高血壓組和健康對(duì)照組性別、年齡等資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有高血壓研究對(duì)象均符合原發(fā)性高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重心、肝、腎功能不全者，各種免疫性疾病者及不愿參與研究者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象都簽訂了知情同意書。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）分離液購自天根生物公司；CD4+T 細(xì)胞分選試劑，熒光抗體（IL-17-PE-Cy5、TNF-α-FITC）以及 IL-17A 和IL-6 ELISA 試劑盒均購自美國 e-Bioscience 公司；實(shí)時(shí)定量 PCR 相關(guān)試劑購自 Takara 公司；SGK1 和 β-actin 引物由上海吉瑪公司提供，SGK1引物，上游為 5' CTGTAAAACTTTGACTGCATAG AACA 3'；下游為 5' AGGGCAGTTTTGGAAAGG TT 3'；RORC 引物，上游為 5' GTCCCGAGATGCT GTCAAGT 3'；下游為 5' TGAGGGTATCTGCTCCT TGG 3'；β-actin 內(nèi)參引物，上游為 5' AGAGGGAA ATCGTGCGTGAC 3'；下游為 5' CAATAGTGATGA CCTGGCCGT 3'。FACS 流式細(xì)胞儀為美國 Biorad公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PBMC 分離 沿管壁緩慢向 10 ml 混勻的白膜中加入 10 ml 淋巴細(xì)胞分離液；2000 r/min離心 10 min，收集中間乳白色云霧狀細(xì)胞層，制備人 PBMC。

1.2.2 CD4+T 細(xì)胞分選 以 PBS 洗 PBMC 2 次，每次 2000 r/min 離心 8 min；細(xì)胞計(jì)數(shù)，每107個(gè)細(xì)胞加入 40 μl 磁珠洗液，重懸細(xì)胞；加入10 μl 生物素標(biāo)記的 CD4+T 抗體，避光孵育 20 min；加入 2 ml 洗液，重懸，2000 r/min 離心 5 min，棄上清；將 LS 柱固定于磁珠分選架上，以 3 ml洗液平衡柱子 2 次；離心并細(xì)胞計(jì)數(shù)，制備 CD4+T細(xì)胞。

1.2.3 檢測(cè) Thl7 細(xì)胞 調(diào)整 CD4+T 細(xì)胞數(shù)至1 × 106/ml，加入 50 ng/ml 佛波醇肉豆蔻酸酯（phorbol myristate acetate，PMA）和 750 ng/ml 離子霉素；于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 ～ 6 h；收集細(xì)胞，2000 r/min 離心 5 min；以抗人IL-17-PE-Cy5 單克隆抗體，孵育 15 min；固定、破膜，流式細(xì)胞儀檢測(cè) Th17 細(xì)胞的比例。實(shí)驗(yàn)中以同型 IgG 染色細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè) SGK1 和 RORC 的mRNA 提取 CD4+T 細(xì)胞總 RNA，取 2 μg 總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備 cDNA；實(shí)時(shí)定量 PCR，反應(yīng)體系為：44 μl 混合液、1 μl Tag 聚合酶，反應(yīng)終體積為 50 μl。擴(kuò)增條件為：94 ℃ 預(yù)變性 55 s，然后 92 ℃ 40 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，共 40 個(gè)循環(huán)。以 β-actin 進(jìn)行量化。設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。結(jié)果以 2-△Ct表示。

1.2.5 ELISA 實(shí)驗(yàn) 以 ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)血清中 IL-17A 水平。ELISA 板中每孔加入血清 100 μl 或 PBS 對(duì)照；37 ℃ 孵育 2 h；洗板 3 次，每次 2 min；加入 100 μl 工作液，置于 37 ℃，孵育 1 h；洗板 5 次，每次 2 min；加入 90 μl TMB 底物工作液，避光孵育 20 min；加入 50 μl 終止液；在 450 nm 波長處檢測(cè)每孔的光密度值。

1.2.6 高血壓大鼠模型 SD 大鼠，4 周齡，12 只，隨機(jī)分成兩組（正常組和高鹽組）。高鹽組用含 8.0% NaCl 的飼料喂養(yǎng)，正常組用含 0.4% NaCl 的飼料喂養(yǎng)。以無創(chuàng)測(cè)壓裝置每隔一天檢測(cè)SD 大鼠血壓變化，當(dāng)收縮壓 ＞ 120 mmHg 時(shí)則造模成功。

1.2.7 HE 染色 常規(guī)脫蠟、水化、漂洗、染色、脫水、封片，光鏡下觀察腎組織炎癥的改變。

1.2.8 免疫組織化學(xué) 常規(guī)方法梯度酒精脫水；以檸檬酸抗原修復(fù)液修復(fù)抗原；PBS 洗 5 min，共3 次；雙氧水滅活過氧化物酶；加試劑 A（10% 山羊血清）于組織切片上，孵育 1 h；加 SGK1 一抗（1：100 稀釋），每張切片 50 μl，4 ℃ 孵育過夜；PBS 洗 5 min，共 3 次；加 HRP 標(biāo)記的二抗，孵育 1 h；PBS 洗 5 min，共 3 次； DAB 顯色，顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。采用Student's t 檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以表示。SGK1 與 IL-17A 的相關(guān)性采用 Pearson 相關(guān)分析，以 P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高血壓患者中 Th17 和 IL-17A 的表達(dá)分析

收集并分析 76 例高血壓患者外周血中 Th17細(xì)胞的比例，結(jié)果表明，與正常健康者比較，高血壓患者中 Th17 細(xì)胞比例明顯升高，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜ 0.05），而且高血壓分級(jí)越高，Th17細(xì)胞占外周血 CD4+T 細(xì)胞的比例越大（圖 1A）。進(jìn)一步，我們分析了高血壓患者中血清 IL-17A 的水平。結(jié)果顯示，高血壓患者中血清 IL-17A 水平明顯高于健康對(duì)照，具有顯著性差異（圖 1B），而且高血壓分級(jí)越高，血清 IL-17A 的水平就越高。

2.2 高血壓患者中 RORC 和 SGK1 的表達(dá)

RORC 是 Th17 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，SGK1 是調(diào)節(jié) Th17 細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)分子。因此，為進(jìn)一步研究 SGK1 能否調(diào)節(jié)高血壓中 Th17 細(xì)胞分化，我們分析了高血壓患者中 CD4+T 細(xì)胞中RORC 和 SGK1 的表達(dá)。實(shí)時(shí)定量 PCR 結(jié)果顯示，RORC（圖 2A）和 SGK1（圖 2B）在高血壓患者 CD4+T 細(xì)胞中高表達(dá)，明顯高于健康對(duì)照，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。更為重要的是，隨著高血壓分級(jí)程度升高，RORC 和 SGK1 在 CD4+T 淋巴細(xì)胞中表達(dá)也明顯升高。

圖1 Th17 細(xì)胞及其細(xì)胞因子在高血壓患者中的表達(dá)（A：Th17 細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果；B：IL-17A 的血清水平）Figure 1 The results of Th17 cells and relative cytokines in patients with hypertension （A： The results of Th17 cells in patients with hypertension； B： The levels of serum IL-17A in patients with hypertension）

圖2 RORC（A）和 SGK1（B）在高血壓患者外周血 CD4+T 細(xì)胞中的表達(dá)Figure 2 The expression of RORC （A） and SGK1 （B） in CD4+T cells from patients with hypertension

2.3 SGK1 與 Th17 細(xì)胞相關(guān)因子相關(guān)性分析

為進(jìn)一步分析 SGK1 調(diào)節(jié) Th17 細(xì)胞分化在高血壓中的作用，我們對(duì)高血壓中 SGK1與 Th17細(xì)胞相關(guān)因子進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果表明，SGK1與 Th17 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子 RORC 具有明顯的相關(guān)性（r2= 0.6213，P ＜ 0.05，圖 3A），而且 SGK1 與血清 IL-17A 也具有明顯的相關(guān)性（r2= 0.5656，P ＜ 0.05，圖 3B）。

2.4 SGK1 在鹽敏感高血壓大鼠中的表達(dá)

為進(jìn)一步研究 SGK1 調(diào)節(jié) Th17 細(xì)胞在高血壓中的作用，我們構(gòu)建了鹽敏感高血壓動(dòng)物模型。如圖 4A 所示，我們成功誘導(dǎo)了鹽敏感的高血壓大鼠，自第 10 天，實(shí)驗(yàn)組大鼠高血壓大于 120 mmHg，與對(duì)照組具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜ 0.05），并且血壓持續(xù)升高。我們分析了外周血 CD4+T 淋巴細(xì)胞中 SGK1 的表達(dá)和血清 IL-17A 的表達(dá)，結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，高血壓組 SGK1 的表達(dá)和 IL-17A 水平明顯升高（圖 4B，4C）。進(jìn)一步，HE 染色顯示高血壓大鼠腎組織中呈現(xiàn)明顯的炎癥（圖 4D）。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，高血壓組腎組織中 SGK1 的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組（圖 4E）。

圖3 高血壓中 SGK1 與 RORC 和血清 IL-17A 相關(guān)性分析（A：SGK1 與 RORC 呈正相關(guān)；B：SGK1 與 IL-17A 呈正相關(guān)）Figure 3 The correlation analysis of SGK1 with RORC and serum IL-17A in hypertension （A： The positive correlation between SGK1 and RORC in hypertension； B： The positive correlation between SGK1 and IL-17A in hypertension）

圖4 SGK1 調(diào)節(jié) Th17 細(xì)胞在高血壓大鼠模型中的影響［A：大鼠模型中血壓檢測(cè)；B：大鼠模型中 SGK1 表達(dá)結(jié)果；C：大鼠模型中血清 IL-17A 檢測(cè)結(jié)果；D：HE 染色檢測(cè)炎癥變化（× 100）；E：免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎組織中 SGK1 表達(dá)（× 200）， P ＜ 0.05］Figure 4 The effect of SGK-induced Th17 cells in hypertension model ［A： Blood pressure in hypertension model； B： The expression of SGK1 in hypertension model； C： The levels of serum IL-17A in hypertension model； D： The results of HE staining （× 100）； E： The analysis of SGK1 in kidney from hypertension model by IHC （× 200）， P ＜ 0.05］

3 討論

高血壓是一種進(jìn)行性的“心血管綜合征”，表現(xiàn)為動(dòng)脈血壓持續(xù)升高［15］，并伴有多種靶器官損害以及心、腎、腦和視網(wǎng)膜等器官功能性或器質(zhì)性改變。隨著我國老齡化社會(huì)進(jìn)程的加快、人們生活方式和飲食習(xí)慣的改變，在我國，高血壓患者不斷增加，給社會(huì)和家庭帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。高血壓作為當(dāng)前社會(huì)的主要衛(wèi)生問題之一，備受人們關(guān)注。但是，高血壓發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，受遺傳和環(huán)境等方面的多因素影響。盡管人們對(duì)高血壓的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量深入的研究，但是這些研究大都集中在腎素血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)［16］。近年來的研究表明，高血壓伴有局部和系統(tǒng)性的炎癥反應(yīng)，與免疫炎癥相關(guān)的淋巴細(xì)胞及其細(xì)胞因子參與了高血壓的發(fā)生與發(fā)展［17-18］。研究表明，抑制高血壓 T 淋巴細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)，就能夠減輕血壓升高及其導(dǎo)致的靶器官損害［19］。

Th17 細(xì)胞是 T 淋巴細(xì)胞亞群的重要組成，是促進(jìn)炎癥主要的 T 細(xì)胞亞群。Th17 細(xì)胞在轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）β、IL-6和 IL-1 的介導(dǎo)下成熟，主要表達(dá) IL-17A、IL-17F和 IL-21 等細(xì)胞因子［20］。Th17 細(xì)胞參與了許多自身免疫性疾病和炎癥反應(yīng)性疾病的發(fā)病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、多發(fā)性硬化癥、哮喘、炎癥性腸病和牙周疾病等［21］。近來的研究表明 Thl7 細(xì)胞在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、急性冠狀動(dòng)脈綜合征等心血管疾病中也發(fā)揮著重要作用。我們檢測(cè)了 Th17 細(xì)胞及其相關(guān)的細(xì)胞因子 IL-17A 在高血壓患者外周血中的比例和水平。結(jié)果表明，Th17 細(xì)胞和IL-17A 在高血壓中明顯升高。更為重要的是，隨著高血壓臨床等級(jí)的升高，Th17 細(xì)胞和 IL-17A的水平也明顯升高。這些結(jié)果提示，Th17 細(xì)胞及其細(xì)胞因子 IL-17A 在高血壓中具有重要的功能，與高血壓進(jìn)展密切相關(guān)。RORC 是 Th17 細(xì)胞重要的轉(zhuǎn)錄因子，為進(jìn)一步研究 Th17 細(xì)胞在高血壓中的作用，我們檢測(cè)了 CD4+T 細(xì)胞中 RORC 的表達(dá)，結(jié)果表明，RORC 在高血壓中高表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了 Th17 細(xì)胞在高血壓中的作用。

SGK1 為 SGK 家族的主要成員之一，受多種外部因素刺激調(diào)節(jié)［22］。研究表明，SGK1 能夠誘導(dǎo)致病性的、分泌 IL-17 的 Th17 細(xì)胞的產(chǎn)生，在炎癥性疾病發(fā)展中起著重要的作用［14］。本研究，我們檢測(cè)了 SGK1 在高血壓患者外周血 CD4+T 細(xì)胞中的表達(dá)。研究結(jié)果表明，SGK1 在高血壓患者外周血 CD4+T 細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，且隨著高血壓臨床分級(jí)的升高，SGK1 表達(dá)也升高，提示 SGK1 是高血壓進(jìn)展重要的調(diào)節(jié)分子。為進(jìn)一步研究 SGK1是否調(diào)節(jié) Th17 細(xì)胞促進(jìn)高血壓進(jìn)展。我們對(duì)SGK1 與 Th17 細(xì)胞相關(guān)因子進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果表明，高血壓患者中，SGK1 分別與 RORC 和IL-17A 呈正相關(guān)。在體內(nèi)，我們以高鹽誘導(dǎo)了高血壓大鼠模型，結(jié)果表明高血壓組 SGK1 的表達(dá)和 IL-17A 水平明顯升高，腎組織呈現(xiàn)明顯的炎癥。SGK1 在高血壓組腎組織中的表達(dá)明顯升高。這些結(jié)果表明，SGK1 通過調(diào)節(jié) Th17 細(xì)胞促進(jìn)炎癥發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)了高血壓的發(fā)展。

綜上，通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)高血壓中 SGK1表達(dá)升高，并且與 Th17 細(xì)胞相關(guān)因子（RORC 和IL-17A）具有相關(guān)性，提示 SGK1 通過調(diào)節(jié) Th17細(xì)胞分化促進(jìn)了高血壓炎癥過程。

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Objective To study the expression of SGK1 in CD4+T from peripheral blood mononuclear cells （PBMC） of hypertension patients，and to explore the function of SGK1 in hypertension by regulating Th17 cells differentiation.

Methods The patients with hypertension were recruited and divided into hypertension I， hypertension II and hypertension III according to clinical diagnosis of hypertension. The percentage of Th17 cells were analyzed by FCM. ELISA was using to analyze the level of IL-17A in patients' serum with hypertension. The CD4+T cells were prepared from PBMC of hypertension patients by using magnetic beads. The expression of SGK1 and RORC were detected by real-time PCR. The hypertension animal models were constructed by high salt diet. The inflammation form kidney was observed by HE staining， and SGK1 expression in kidney was detected by IHC.

Results Compared with the healthy control， the percentage of Th17 cells and the level of IL-17A in serum were increased significantly in patients with hypertension. Importantly， the levels were higher along with the development of hypertension. SGK1 expression was up-regulated remarkably in CD4+T cells from patients with hypertension. What's more， SGK1 expression has positive correlation with RORC and IL-17A. In the hypertension animal models， compare with control， the levels of serum IL-17A was increased， the inflammation were observed in hypertension animal models and the expression of SGK1 in kidney was increased significantly.

Conclusion The percentage of Th17 cells were increased in patients with hypertension， and SGK1 promoted the progress of hypertension by regulating the differentiated of Th17 cells.

Author Affiliations： Department of Geratology， Ninth People's Hospital， 710054 Shaanxi， China （LI Hai-long， Lü Ya-li）；Department of Laboratory （YU Li-juan）， Institute of Pediatric Diseases of Shannxi， Shannxi Engineering Research Center for Translational Medicine of Diagnosis & Therapy of Pediatric Diseases （WU Shou-zhen）， Xi'an Children's Hospital， 71003 Shaanxi，China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2016, 11(5):426-431

The function of SGK1 in hypertension by regulating Th17 differentiation

LI Hai-long， Lü Ya-li， YU Li-juan， WU Shou-zhen

Serum and glucocorticoid-inducible kinase 1； Th17 cells； Hypertension； IL-17A

WU Shou-zhen， Email： wushouzhen@qq.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.05.007

710054 西安市第九醫(yī)院老年病科（李海龍、呂雅麗）；710003西安市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科（魚麗娟），兒科疾病研究所陜西省兒科疾病診治轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)工程研究中心（吳守振）

吳守振，Email：wushouzhen@qq.com

2016-08-17