董 慧， 王力東， 王春琳， 宋微微， 母昌考， 李榮華

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211)

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曼氏無針烏賊墨汁黑色素對(duì)免疫低下模型小鼠的調(diào)節(jié)作用

董 慧， 王力東， 王春琳， 宋微微， 母昌考， 李榮華

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211)

探究曼氏無針烏賊墨汁黑色素(Melanin fromSepiellaMaindroniInk,MSMI)對(duì)免疫低下小鼠的調(diào)節(jié)作用。SPF級(jí)ICR小鼠60只，隨機(jī)平均分為6組，其中5組(模型組，陽性對(duì)照組，墨汁黑色素低、中，高劑量組)用氫化可的松造免疫低下模型，另外一組為空白對(duì)照組。連續(xù)灌胃不同劑量的黑色素10 d，從免疫學(xué)水平評(píng)價(jià)曼氏無針烏賊墨汁黑色素的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。結(jié)果表明，曼氏無針烏賊墨汁黑色素(MSMI)能顯著提高免疫低下小鼠的肝、脾指數(shù)(P<0.01,P<0.01)，而且不同灌胃劑量的黑色素對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬能力的提高也有顯著差異(P<0.05,P<0.01)，曼氏無針烏賊墨汁黑色素(MSMI)也能夠通過調(diào)節(jié)抗氧化體系的穩(wěn)態(tài)增強(qiáng)機(jī)體免疫力。可見曼氏無針烏賊墨汁黑色素(MSMI)可以增強(qiáng)免疫器官的調(diào)節(jié)能力，尤以高劑量組最為顯著。

曼氏無針烏賊墨汁；黑色素；巨噬細(xì)胞；免疫調(diào)節(jié)

自然界中的黑色素分為褐色素和真黑色素兩大類，即由苯并噻嗪和苯丙噻唑聚合形成褐色素，而上述兩種物質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元(5,6-二羥基吲哚和5,6-二羥基-2-吲哚羧酸)形成真黑色素[1]。其中烏賊墨汁、烏骨雞和烏骨綿羊中的黑色素都屬于真黑色素，黑色素對(duì)光的吸收具有廣譜性，所以能夠吸收可見光和紫外光輻射的活性物質(zhì)。近年在陸生動(dòng)、植物和工程菌、粒毛盤菌，以及其他新型菌株(AspergillusbridgeriICTF-201)提取物黑色素的研究中發(fā)現(xiàn)黑色素還具有重要的生理功能，如氧化還原性、電導(dǎo)性、螯合金屬離子、清除體內(nèi)自由基的抗氧化功能，以及抗菌和抗病毒活性等功能[2-7]，但目前從海洋生物中提取天然黑色素并對(duì)其生理活性的研究還鮮有報(bào)道。

曼氏無針烏賊(Sepiellamaindroni，Rochebrune)隸屬軟體動(dòng)物門、頭足綱、十腕目、烏賊科、無針烏賊屬，近海廣布性種，俗名墨魚、海貓等[8]。烏賊墨是用來防御敵害由其墨囊噴出的，在加工過程中，墨囊多作為加工廢棄物處理，容易污染環(huán)境，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)烏賊墨汁是由黑色顆粒構(gòu)成的懸濁液。在對(duì)烏賊墨研究過程中發(fā)現(xiàn)，主要發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗菌、抗病毒、促進(jìn)機(jī)體造血、凝血和抗腫瘤功能的主要活性物質(zhì)是多糖[9-13]。關(guān)于烏賊墨汁黑色素的研究多為結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)，它的生物學(xué)活性卻鮮被報(bào)道。

實(shí)驗(yàn)室前期用曼氏無針烏賊墨汁黑色素(MSMI)對(duì)D-半乳糖所致的衰老模型起到很好的抗氧化作用[14]。本文以頸背部皮下注射氫化可的松造成的免疫低下小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，灌胃不同劑量的MSMI，分別測(cè)定與免疫相關(guān)的臟器指數(shù)、氧化酶活性和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力[15-16]，評(píng)價(jià)MSMI免疫調(diào)節(jié)作用，為開發(fā)烏賊墨汁黑色素藥用價(jià)值奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物曼氏無針烏賊(Sepiellamaindroni,Rochebrune)墨囊，由浙江省舟山市海水養(yǎng)殖廠提供，-20℃凍藏，使用時(shí)于0℃解凍。60只ICR小鼠，雌雄各半，由寧波大學(xué)動(dòng)物房提供(合格證號(hào)0023472)。

1.1.2試劑與儀器2%紅細(xì)胞懸液；堿性蛋白酶(solarbia公司)；氫化可的松(Hydrocortisone HC)；鹽酸左旋咪唑；考馬斯亮藍(lán)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)、微量丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)，以上生化指標(biāo)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。SPECTRA max190酶標(biāo)儀(Molecular Decices公司)；XSP-2C型生物顯微鏡(上海恒勤儀器設(shè)備有限公司)；T-18Basic 內(nèi)切式勻漿機(jī)(IKA公司)；FreeZone4.5臺(tái)式冷凍干燥機(jī)(Labconco公司)。

1.2方法

1.2.1 2%紅細(xì)胞懸液的制備 無菌條件下抽取動(dòng)物心臟血，在EP管中加入5倍體積的血液抗凝劑，1000 r/min,10 min離心至上清液透亮，用生理鹽水洗滌3次，棄去細(xì)胞表面層，制得哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞。等體積加入生理鹽水，配成體積比為2%的紅細(xì)胞懸液備用。

1.2.2曼氏無針烏賊墨汁黑色素的制備 參考酶法提取黑色素實(shí)驗(yàn)[17]以及優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)室已有的方案[18]，采用酶解法提純所得高濃度MSMI，主要的工藝流程如下：擠壓沖洗100只烏賊墨囊獲得墨汁，三層紗布過濾防止混入破碎組織，重復(fù)2次離心(8000 r/min，10 min)，冷凍干燥得黑色素粗品，用堿性蛋白酶精提黑色素，2%的粗品黑色素和1.5%的堿性蛋白酶在堿性(pH 10～10.5)，溫度為50℃酶解4～5 h，獲得的酶解產(chǎn)物離心6次(6000 r/min，10 min)，冷凍干燥，獲得高純度曼氏無針烏賊墨汁黑色素(MSMI)，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3小鼠免疫低下模型的建立和MSMI的灌胃

60只ICR品系小鼠，分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽性對(duì)照組，曼氏無針烏賊墨汁黑色素(MSMI)低、中組，高劑量組，每組10 只，雌雄各半。除空白對(duì)照組頸部皮下注射生理鹽水外，其余組注射等量的HC[ 30 mg/(kg·d)]，一天一次，連續(xù)3 d，建立小鼠免疫低下模型。陽性對(duì)照組小鼠灌胃鹽酸左旋咪唑[20 mg/(kg·d)]，低、中、高3組分別灌胃25 mg/(kg·d)、50 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d) 的MSMI，一天一次，連續(xù)10 d。實(shí)驗(yàn)過程中小鼠按照日常飼養(yǎng)管理，并保證每日給藥時(shí)間相同。

1.2.4小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的測(cè)定 最后一次給藥后，供食停止，水正常提供12 h，每只小鼠進(jìn)行腹腔注射自制的2%紅細(xì)胞懸液，30 min后脫臼處死小鼠，收集腹腔巨噬細(xì)胞，用丙酮和甲醛(1∶1)固定，Giemsa-磷酸緩沖液染色，油鏡計(jì)數(shù)，計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)[15]。

1.2.5小鼠脾、肝/體重比測(cè)定 同1.2.4處死的同一批小鼠，仔細(xì)剝離脾、肝，稱重，計(jì)算脾、肝/體重。

1.2.6小鼠免疫器官相關(guān)免疫生化指標(biāo)的測(cè)定稱肝、脾重量，按重量(g)∶體積(mL)為1∶9的比例生理鹽水，冰上勻漿，離心(2500 r/min,10 min)，取上清液備用。參照各試劑說明書測(cè)定勻漿上清液過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)的含量。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)處理。組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，P<0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 曼氏無針烏賊墨汁黑色素(MSMI)對(duì)免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

曼氏無針烏賊墨汁黑色素(MSMI)能顯著促進(jìn)免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力(表1)。結(jié)果表明：與正常組相比，模型組的吞噬率和吞噬指數(shù)顯著降低(P<0.01,P<0.01)，與模型組相比，MSMI 3個(gè)劑量組吞噬率分別提高了43.31%、29.75%和16.71%；吞噬指數(shù)也有顯著提升，以高劑量組效果最顯著(P<0.01,P<0.01)。

2.2 曼氏無針烏賊墨汁黑色素(MSMI)對(duì)小鼠肝、脾指數(shù)的影響

由表2可見，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肝、脾/體重比值顯著下降(P<0.01，P<0.01)；與模型對(duì)照組相比，各劑量組小鼠肝、脾臟/體重比值均有顯著提高(P<0.01,P<0.01)，其中高劑量組在肝、脾器官中均表現(xiàn)為極顯著差異(P<0.01,P<0.01)。

2.3 曼氏無針烏賊墨汁黑色素(MSMI)對(duì)免疫低下小鼠免疫器官相關(guān)免疫指標(biāo)的影響

2.3.1 曼氏無針烏賊墨汁黑色素(MSMI)對(duì)小鼠肝、脾SOD、GSH-Px含量的影響結(jié)果表明(表3)，模型組小鼠與正常組相比，肝、脾中SOD、GSH-Px值降低。黑色素組與模型組相比，黑色素3個(gè)劑量組小鼠肝臟SOD含量分別升高了35.75%、20.02%和19.84%，脾臟中SOD含量分別升高了42.30%、29.14%、18.59%；模型組小鼠的肝、脾GSH-Px值與正常組比較， GSH-Px值降低了13.07%、17.25%；灌胃3個(gè)不同劑量黑色素組與模型組相比，黑色素組小鼠肝臟GSH-Px的含量分別升高了21.27%、16.55%和11.9%，脾臟GSH-Px的含量分別升高了21.77%、17.06%和18.32%。

表1 曼氏無針烏賊墨汁黑色素對(duì)免疫低下模型 小鼠單核-巨噬墨汁細(xì)胞吞噬能力的影響Table 1 Effects of melon on mononuclear macrophages′ function in hypoimmune mice

#：P<0.05，##：P<0.01，與正常對(duì)照組相比；*：P<0.05，**：P<0.01，與模型對(duì)照組相比。下同

表2 曼氏無針烏賊墨汁黑色素對(duì)免疫低下模型 小鼠肝/體重、脾/體重比值影響Table 2 The effect of MSMI on organ index in hypoimmune mice ±s)

2.3.2 曼氏無針烏賊墨汁黑色素對(duì)小鼠體內(nèi)CAT、MDA含量的影響表4顯示模型組小鼠肝、脾CAT值與正常組相比，CAT值升高(P<0.01,P<0.01)；而灌胃3個(gè)不同劑量的黑色素組與模型組相比，低劑量組肝中CAT顯著升高(P<0.05)，脾中無顯著差異，而高、中劑量組肝、脾中CAT極顯著升高(P<0.01,P<0.01)。免疫低下模型組肝、脾MDA值與正常組相比，均顯著升高(P<0.01,P<0.01)；灌胃黑色素低劑量組的MDA含量與模型組相比，肝組織中顯著降低(P<0.05)，脾中MDA表現(xiàn)不顯著，而高、中劑量組小鼠肝、脾中MDA的含量差異極顯著(P<0.01,P<0.01)。

表3 曼氏無針烏賊墨汁黑色素對(duì)免疫低下模型小鼠肝、脾組織相關(guān)生化酶活性SOD、GSH-PX的影響Table 3 Effects of Me-I on liver and spleen SOD and GSH-PX in hypoimmune mice

表4 曼氏無針烏賊墨汁黑色素對(duì)免疫低下模型小鼠肝、脾相關(guān)生化酶活性CAT、MDA的影響Table 4 Effects of Me-I on liver and spleen CAT and MDA in hypoimmune mice

3 討論

脾臟和肝臟是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的器官，肝、脾/體重比值也是用來衡量機(jī)體免疫能力的指標(biāo)[19]。在非特異性免疫中，單核巨噬細(xì)胞可迅速將進(jìn)入體內(nèi)的細(xì)菌、異物等抗原性物質(zhì)清除，因而巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)的大小可以反映其吞噬功能的強(qiáng)弱[20-22]。本實(shí)驗(yàn)中，免疫低下模型組與正常組相比，小鼠肝、脾/體重比值、巨噬細(xì)胞的吞噬能力都顯著下降，這些結(jié)果與以前研究報(bào)道的一致[23-24]，說明小鼠免疫低下模型建立成功。陽性對(duì)照組(鹽酸左旋咪唑)與模型組相比，小鼠肝、脾臟器指數(shù)、巨噬細(xì)胞的吞噬能力都顯著升高，說明鹽酸左旋咪唑有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，適合作為陽性對(duì)照。3組不同劑量黑色素組與模型組相比，小鼠肝、脾臟器指數(shù)、巨噬細(xì)胞的吞噬能力都顯著升高且和黑色素劑量有成正比的趨勢(shì)，表明MSMI能對(duì)抗氫化可的松引起的脾、肝萎縮，因而肝、脾/體重比值顯著升高，相對(duì)表明黑色素能增強(qiáng)機(jī)體免疫力。另外，MSMI能對(duì)抗氫化可的松引起的小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力降低，說明MSMI還能促進(jìn)小鼠非特異性免疫。

一套完整的抗氧化防御體系，使機(jī)體內(nèi)自由基持續(xù)維持一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[25-26]，是維持機(jī)體正常的必要條件。但當(dāng)抗氧化系統(tǒng)遭到破壞時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生過量的脂質(zhì)過氧化物，脂質(zhì)過氧化物含量能夠反映出體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，另一方面它能夠間接地反映出細(xì)胞受損傷的程度。作為抗氧化防御體系之一的SOD與其他抗氧化酶如CAT、GSH-Px聯(lián)合作用能起到清除超氧陰離子自由基和修復(fù)體內(nèi)氧化性損傷作用的功能[26]。在本實(shí)驗(yàn)中，腹腔注射氫化可的松后，小鼠體內(nèi)的自由基平衡狀態(tài)被打破，即SOD、CAT、GSH-Px的活性降低，從而導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生過量的MDA等脂質(zhì)過氧化物，灌胃3個(gè)不同劑量的黑色素后小鼠脾、肝中MDA含量顯著下降，而SOD、GSH-Px、CAT活性都有所上升，這與先前報(bào)道的抗氧化防御機(jī)制清除體內(nèi)過量自由基報(bào)道一致[14,27-28]，也與我們建立的陽性對(duì)照組的結(jié)果相一致。說明，曼氏無針烏賊墨汁黑色素(MSMI)對(duì)免疫低下機(jī)體產(chǎn)生的氧化損傷有一定的修復(fù)作用且黑色素劑量越大免疫調(diào)節(jié)能力越強(qiáng)。

綜上所述，曼氏無針烏賊墨汁黑色素能夠顯著改善免疫低下模型小鼠的免疫功能，提高免疫器官肝臟、脾臟器官指數(shù)，加強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率，同時(shí)顯著增強(qiáng)了肝臟等器官中各種免疫生化相關(guān)酶的活性，無論是在特異性免疫還是非特異性免疫機(jī)制方面都有一定的調(diào)節(jié)作用。因此，本研究為進(jìn)一步探究曼氏無針烏賊墨汁黑色素藥用價(jià)值提供了理論依據(jù)。

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Immunomodulatory effects of melanin from Sepiella Maindroni ink on hypoimmune mice

DONG Hui, WANG Li-dong, WANG Chun-lin, SONG Wei-wei, MU Chang-kao, LI Rong-hua

( School of Marine Science， Ningbo University Ningbo University, Ningbo 315211, China)

In this study, the immunomodulatory effects of MSMI (melanin fromSepiellamaindroniink) on hypoimmune mice induced by Hydrocortisone(HYD) was investigated . ICR mice were selected as animal mode, which were randomly divided into six groups, including control groups, hypoimmune mice, positive control groups(Levamisole Hydrochloride), and MSMI treated groups of low, medium and high dosage. Except for the control group, all the other groups were treated with Hydrocortisone by subcutaneous injection. After a trial period of 10 days, the liver and spleen indexes and phagocytic capacity of macrophages were analyzed, and which were found to be significantly enhanced in the treated groups(P<0.01，P<0.01),(P<0.05,P<0.01) as compared to that in the control group. Antioxidant enzyme activities were also measured and they significantly increased compared to the hypoimmune mice group. However, lipid peroxidation assayed as melondialdehyde (MDA) reduced significantly in the treated groups compared to that in the control. It is suggested that MSMI can promote immune function of immune-depressed mice.

SepiellaMaindroniInk; Melanin; macrophages; immune-depressed mice

2015-12-10；

2016-01-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41206114，41176124)；教育部博士點(diǎn)基金(20103305110003);浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LQ12C19002)；浙江省教育廳項(xiàng)目(Y201224605)；浙江省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(Z3110482)；浙江省公益性項(xiàng)目(ZX2013000403)；大學(xué)生創(chuàng)新孵化項(xiàng)目(2016R405096)

董慧，碩士研究生，主要從事海洋生物學(xué)研究，E-mail:18766566035@163.com

宋微微，講師，主要從事曼氏無針烏賊養(yǎng)殖及其副產(chǎn)品開發(fā), E-mail: songweiwei@nbu.edu.cn

Q959.9； R285.5

A

2095-1736(2016)05-0027-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.027