王 煒，王劍虹，羅俊杰，陳 琛，歐巧明，葉春雷

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅蘭州 730070； 2.蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系,甘肅蘭州 730070)

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干旱脅迫對小麥花藥培養(yǎng)的影響

王 煒1，王劍虹2，羅俊杰1，陳 琛1，歐巧明1，葉春雷1

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅蘭州 730070； 2.蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系,甘肅蘭州 730070)

為拓寬抗旱春小麥花培育種的親本資源，明確干旱脅迫對小麥花藥培養(yǎng)的影響，對甘肅省主栽的7個抗旱春小麥品種的花藥培養(yǎng)特性進(jìn)行了研究，并對篩選出的兼具較強(qiáng)抗旱性和優(yōu)良花藥培養(yǎng)特性的品種隴春27號及其他三個優(yōu)良花培材料，通過誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加120 mg·L-1的PEG及旱地種植，進(jìn)而進(jìn)行花藥培養(yǎng)。結(jié)果表明，供試的4個小麥基因型材料的愈傷組織誘導(dǎo)均受到抑制，但受抑制的程度不同，其抗旱系數(shù)排序在兩種干旱脅迫處理下高度一致；田間抗旱性鑒定結(jié)果表明，4個基因型材料的抗旱性強(qiáng)弱不同；其愈傷組織的抗旱系數(shù)與抗旱性之間顯著相關(guān)。

小麥；花藥培養(yǎng)；干旱脅迫；抗旱性

小麥?zhǔn)歉珊岛桶敫珊档貐^(qū)的主要作物。近年來由于氣候變暖、環(huán)境惡化等原因?qū)е挛覈珊堤鞖忸l發(fā)，對小麥生產(chǎn)造成巨大損失[1]。選育抗旱品種是應(yīng)對干旱脅迫最為經(jīng)濟(jì)有效的手段[2]。目前小麥抗旱育種多采用常規(guī)雜交方法。小麥花培育種具有快速獲得純系材料、縮短育種周期等優(yōu)點(diǎn)。自1973年成功獲得花藥單倍體植株以來，國內(nèi)外相關(guān)研究者利用該技術(shù)相繼育成了多個小麥品種和一大批種質(zhì)材料，目前已成為常規(guī)育種方法的重要補(bǔ)充[3]。然而，花藥培養(yǎng)技術(shù)在小麥抗旱育種中的應(yīng)用仍然比較欠缺，原因之一在于小麥花藥培養(yǎng)具有顯著的基因型依賴性[4-5]，兼具較強(qiáng)抗旱性和優(yōu)良花藥培養(yǎng)特性的材料較少，配制雜交組合時相對受限，進(jìn)一步限制了該技術(shù)在小麥抗旱育種中的應(yīng)用[6]。

供試材料的生理狀態(tài)也是影響小麥花藥培養(yǎng)效果的重要因素[7-8]。供試材料的生理狀態(tài)主要受溫度、光照、土壤水分等因素影響[5]。目前的研究一般認(rèn)為，未受逆境脅迫條件下種植的供試材料其花藥發(fā)育良好，有利于提高花藥培養(yǎng)效率[9-10]；對于小麥抗旱品種(系)而言，大部分材料的株高較高，若采用與水地材料一樣的常規(guī)田間管理或所受的干旱脅迫程度較輕，則往往因?yàn)橹仓甑狗鼘?dǎo)致花藥發(fā)育不良或取材困難，花藥培養(yǎng)效果反而較差。PEG作為一種滲透脅迫物質(zhì)，廣泛用于模擬水分脅迫進(jìn)行植物萌發(fā)期的抗旱性鑒定，以及離體脅迫誘導(dǎo)和抗旱植株篩選。研究表明，在小麥的花藥培養(yǎng)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入低濃度的PEG溶液能夠顯著提高花藥愈傷組織誘導(dǎo)率，加入高濃度的PEG則具有明顯的抑制作用，且這種低促高抑的作用和幅度與供試材料的抗旱性有關(guān)[11-12]。許多研究表明，在小麥、大麥等作物的離體培養(yǎng)中，組織細(xì)胞對逆境脅迫的反應(yīng)與植株水平上的反應(yīng)往往存在一致性[13-16]。這種一致性為利用離體脅迫培養(yǎng)方法改良作物相關(guān)抗逆性狀提供了理論依據(jù)?；谝陨显?，本研究通過研究甘肅省主栽抗旱春小麥品種的花藥培養(yǎng)特性，以篩選兼具優(yōu)良抗旱性及優(yōu)良花藥培養(yǎng)特性的基因型；同時，以4個抗旱性不同的春小麥基因型為材料，分別研究誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加PEG溶液及田間干旱脅迫種植條件對小麥花藥培養(yǎng)的影響，并進(jìn)一步研究植株水平的抗旱性與小麥花藥培養(yǎng)的反應(yīng)水平之間的相關(guān)性，旨在為促進(jìn)花藥培養(yǎng)方法在抗旱育種中的應(yīng)用以及進(jìn)行抗旱性離體鑒定和篩選提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試材料

2014年進(jìn)行抗旱春小麥花藥培養(yǎng)特性鑒定試驗(yàn)。供試材料為隴春22號、隴春27號、西旱2號、定西35號、定西38號、定西41號、定西42號，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所、生物技術(shù)研究所以及定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)院等單位提供。這些材料均被以往的研究證明具有較強(qiáng)的抗旱性，且大部分為近年來甘肅省中部干旱和半干旱地區(qū)主栽的抗旱春小麥品種。

2015年進(jìn)行干旱脅迫對小麥花藥培養(yǎng)影響的研究，以及植株水平的抗旱性與小麥花藥培養(yǎng)的反應(yīng)水平之間相關(guān)性的研究。供試材料為隴春27號、隴春31號、4-8、9614。這4份材料均具有優(yōu)良的花藥培養(yǎng)特性，其中，隴春27號為2014年試驗(yàn)中所篩選的材料；隴春31號、4-8、9614為本實(shí)驗(yàn)室使用多年的優(yōu)良花培材料，在以往的田間試驗(yàn)中觀察到這四份材料抗旱性強(qiáng)弱不同。當(dāng)年將上述材料種植于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥細(xì)胞工程育種試驗(yàn)田(蘭州)，5行區(qū)，行長1.2 m，每行均勻點(diǎn)播126粒，行距0.20 m，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。將其分設(shè)為旱地處理和灌水處理(對照)。旱地處理全生育期完全依靠自然降水。甘肅蘭州地區(qū)2015年3月-7月春小麥生育期內(nèi)降水量約為146.1 mm，屬于較為干旱的年份；灌水處理于分蘗期、灌漿期各灌溉1次，共2次。

1.2方 法

挑選每個材料中花藥大小一致且其中絕大多數(shù)小孢子處于單核后期的小麥幼穗，在4 ℃冰箱中低溫處理2 d，接種之前用75%的酒精噴霧進(jìn)行表面消毒，無菌水沖洗3次。取麥穗中部至2/3之間的小穗，將其花藥接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；置培養(yǎng)箱中32 ℃處理7 d后調(diào)至24 ℃進(jìn)行暗培養(yǎng)，待愈傷組織大小約2～3 mm時轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上，置24 ℃、光16 h/暗8 h條件下分化培養(yǎng)。每份材料接種5瓶，每瓶接種60枚花藥，重復(fù)3次。誘導(dǎo)培養(yǎng)基：W14+2,4-D(2.0 mg·L-1)+KT(0.5 mg·L-1)+AGP(400 mg·L-1)+蔗糖(90.0 g·L-1)；分化培養(yǎng)基：MS+ KT(2.0 mg·L-1)+IAA(0.15 mg·L-1)+蔗糖(30.0 g·L-1)。

PEG脅迫試驗(yàn)：取灌水處理下種植材料的花藥進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加PEG(120 mg·L-1)；田間干旱脅迫試驗(yàn)：取旱地處理下種植材料的花藥進(jìn)行培養(yǎng)。兩個試驗(yàn)中所用的對照相同，均取灌水處理下種植材料的花藥進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3統(tǒng)計(jì)指標(biāo)

愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生的愈傷組織塊數(shù)/接種花藥數(shù)×100%

(1)

綠苗分化率=分化綠苗數(shù)/轉(zhuǎn)分化愈傷數(shù)×100%

(2)

綠苗生產(chǎn)率=分化綠苗數(shù)/接種花藥數(shù)×100%

(3)

抗旱系數(shù)：PI=Xs/Xr

(4)

(5)

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2003和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。方差齊性檢驗(yàn)用Duncan法檢測，非齊性檢驗(yàn)用Tamhane’s T2法檢測[5]。

2　結(jié)果與分析

2.1抗旱春小麥品種的花藥培養(yǎng)特性

7個抗旱春小麥品種花藥培養(yǎng)的結(jié)果表明，除定西35號外，其余6個品種均可誘導(dǎo)出愈傷組織，其中隴春27號的誘導(dǎo)率最高，其余依次分別為隴春22號、定西42號、定西38號、定西41號和西旱2號。在分化培養(yǎng)中，3個品種分化出綠苗，其中隴春22號的綠苗分化率最高，其次為隴春27號，但兩者沒有顯著性差異；定西42號最低。綠苗生產(chǎn)率是反映花藥培養(yǎng)效率的重要指標(biāo)，隴春27號依然最高(9.11%)，并與隴春22號和定西42號之間具有顯著性差異(P<0.05)。趙林姝等[17]在小麥花藥培養(yǎng)研究中將同時在愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗分化率和綠苗生產(chǎn)率上分別達(dá)到12%、21%及8%以上的材料認(rèn)為具有高花藥培養(yǎng)力。以此作為參考標(biāo)準(zhǔn)，可以看出，在供試的7個品種中，僅有隴春27號達(dá)到這一標(biāo)準(zhǔn)。

表1　抗旱春小麥品種的花藥培養(yǎng)特性Table 1　Anther cultural characteristics of spring wheat varieties with drought resistance

數(shù)值后的不同字母表示品種間存在顯著差異(P<0.05)。下同

Different letters mean significant difference among varieties at 0.05 level.The same as below

2.2干旱脅迫對春小麥花藥培養(yǎng)的影響

由表2可見，在正常種植環(huán)境下，4份供試材料的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率從高到低依次分別為隴春31號、9614、4-8和隴春27號，且相互之間具有顯著差異，這進(jìn)一步證明了小麥花藥培養(yǎng)的基因型依賴性。無論是在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加120 mg·L-1的PEG，還是采集旱地條件下供試材料的花藥進(jìn)行培養(yǎng)，其愈傷組織誘導(dǎo)率較對照均有不同程度的下降，并且在后一種條件下降的整體幅度更大。本試驗(yàn)中這兩種環(huán)境均達(dá)到了適度干旱脅迫的目的，也顯示出不同基因型對干旱脅迫的花藥培養(yǎng)反應(yīng)水平亦不相同。在兩種干旱脅迫條件下，4個基因型材料愈傷組織抗旱系數(shù)排序完全一致，由高到低均依次分別為隴春27號、4-8、隴春31號和9614。

2.3春小麥品種(系)的田間抗旱性

抗旱系數(shù)和抗旱指數(shù)被公認(rèn)為是小麥抗旱性鑒定最重要的指標(biāo)。本研究對4個春小麥品種(系)的抗旱性鑒定結(jié)果(表3)表明，供試材料的產(chǎn)量抗旱系數(shù)與抗旱指數(shù)排序一致，以隴春27號的抗旱性最強(qiáng)，其次為4-8，隴春31號再次之，9614最弱。這與多年田間觀察的表現(xiàn)基本一致。

2.4春小麥品種(系)的田間抗旱性與花藥培養(yǎng)特性的相關(guān)性

結(jié)合表2和表3可以看出，4個供試品種(系)的愈傷組織抗旱系數(shù)與產(chǎn)量抗旱指數(shù)或抗旱系數(shù)的排序高度一致。相關(guān)分析結(jié)果(表4)表明，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入120 mg·L-1PEG脅迫下愈傷組織抗旱系數(shù)與產(chǎn)量抗旱系數(shù)呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，與產(chǎn)量抗旱指數(shù)呈顯著相關(guān)(P<0.05)；而在旱地處理下愈傷組織抗旱指數(shù)與產(chǎn)量抗旱系數(shù)和抗旱指數(shù)均呈顯著相關(guān)(P<0.05)。這說明在本試驗(yàn)小麥花藥培養(yǎng)中對干旱脅迫的反應(yīng)水平可以較準(zhǔn)確地反映供試材料的抗旱性。

表2　干旱脅迫對春小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 2　Effects of drought stress on the anther callus induction in spring wheat

表3　春小麥品種(系)的產(chǎn)量及田間抗旱性Table 3　Grain yield and drought reisitance in spring wheat varieties(lines)

表4　春小麥抗旱性與花藥培養(yǎng)特性的相關(guān)性Table 4　Correlation between drought resistance and callus drought resistance coefficient in spring wheat

*表示顯著相關(guān)(P<0.05)；**表示極顯著相關(guān)(P<0.01)

* means the correlation is significant at 0.05 level; ** means the correlation is significant at 0.01 level

3　討 論

3.1優(yōu)良花藥培養(yǎng)特性抗旱春小麥種質(zhì)的鑒定

國內(nèi)外的研究普遍認(rèn)為，小麥的花培育種中親本的選配是獲得成功的關(guān)鍵因素之一；雙親或親本之一需要具備優(yōu)良的花藥培養(yǎng)特性[6,18]。因此，鑒定和篩選優(yōu)良花藥培養(yǎng)特性的基因型是小麥花培育種中的基礎(chǔ)性工作。目前，盡管相關(guān)研究者已鑒選出一大批具備優(yōu)良花藥培養(yǎng)特性的基因型材料[19-21]，然而其中抗旱性較強(qiáng)的材料為數(shù)甚少。本研究對近年來甘肅省中部干旱和半干旱地區(qū)主栽的7個抗旱春小麥品種(系)的花藥培養(yǎng)特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明這些材料總體花藥培養(yǎng)效果較差，愈傷組織誘導(dǎo)率最高為12.89%，而且其中4份材料的愈傷組織均未分化出綠苗。倪勝利等[22]研究結(jié)果表明，14份抗旱小麥中，愈傷組織誘導(dǎo)率最高的也僅為8.12%。由此可見，綜合性狀優(yōu)良且兼具抗旱性強(qiáng)和花藥培養(yǎng)特性優(yōu)良的材料是較為稀缺的。本研究篩選出的隴春27號具有優(yōu)良的花藥培養(yǎng)特性，該品種綜合性狀優(yōu)良、抗旱性強(qiáng)，是目前西北地區(qū)最具潛力的旱地春小麥接班換代品種[23]，因此可作為重要的親本材料在今后的抗旱小麥花培育種及構(gòu)建抗旱DH永久作圖群體中應(yīng)用。

3.2干旱脅迫對小麥花藥培養(yǎng)的影響

利用培養(yǎng)基中的滲透脅迫模擬干旱脅迫是離體篩選抗旱材料的一種常用方法，在體細(xì)胞無性系變異及小麥花藥培養(yǎng)中均有應(yīng)用[24-25]。本研究結(jié)果表明，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加120 mg·L-1的PEG在不同程度上抑制了4個基因型材料愈傷組織的產(chǎn)生，這與劉桂茹等[11]、楊 雪等[12]的研究結(jié)果并不十分一致，在他們的研究中該濃度下的PEG仍然可以促進(jìn)部分材料愈傷組織的產(chǎn)生。其原因可能在于供試材料的基因型及培養(yǎng)條件的差異所致。本研究還表明，在旱地處理(雨養(yǎng))種植條件下，所有材料的愈傷組織誘導(dǎo)均受到抑制，不同基因型受抑制的程度不同，這說明本研究中的種植環(huán)境對小麥花藥培養(yǎng)而言已構(gòu)成了一定程度的干旱脅迫。

供試的4個基因型材料的愈傷組織抗旱系數(shù)盡管在兩種干旱脅迫環(huán)境下的排序高度一致，然而應(yīng)當(dāng)屬于不同水平對干旱脅迫的反應(yīng)。PEG脅迫試驗(yàn)中，小麥花藥愈傷組織的形成與花藥中小孢子細(xì)胞對干旱脅迫的耐受力相關(guān)；而田間干旱脅迫試驗(yàn)中，愈傷組織的形成則與孕穗期花藥組織對干旱脅迫的耐受力相關(guān)。對旱地處理(雨養(yǎng))條件下采集的麥穗和花藥形態(tài)觀察初步表明(結(jié)果未列出)，與對照(灌溉)相比，總體供試材料的小穗數(shù)減少、花藥變小，花藥發(fā)育階段提前。因此可以推測，田間干旱脅迫導(dǎo)致的花藥發(fā)育不良是該環(huán)境下愈傷組織誘導(dǎo)率降低的主要原因之一?；ㄋ幣囵B(yǎng)對不同干旱脅迫環(huán)境的響應(yīng)的一致性原因或許是兩種干旱脅迫對供試材料花藥培養(yǎng)的影響程度較為吻合。

3.3愈傷組織抗旱系數(shù)與春小麥抗旱性的相關(guān)性

作物的抗旱性是一種復(fù)雜的數(shù)量性狀，可以在多個階段和多個層面表現(xiàn)出來，而在最終產(chǎn)量中得到綜合體現(xiàn)。本研究結(jié)果表明，在兩種干旱脅迫環(huán)境下，不同基因型小麥材料在花藥愈傷組織水平上對干旱脅迫的耐受力存在明顯差異，而這種耐受力可以通過愈傷組織抗旱系數(shù)得到體現(xiàn)。相關(guān)分析表明，供試基因型材料的愈傷組織抗旱系數(shù)與其抗旱性之間顯著相關(guān)。這與劉桂茹等[11]在小麥上的研究及張艷敏等[26]在水稻上的研究結(jié)果相似。由于本研究中田間干旱脅迫反映的是供試基因型孕穗期的抗旱性，而籽粒產(chǎn)量的抗旱指數(shù)和抗旱系數(shù)反映的是全生育期的抗旱性[27]，因而本研究結(jié)果進(jìn)一步表明小孢子細(xì)胞對干旱脅迫的培養(yǎng)反應(yīng)與供試基因型孕穗期及全生育期的抗旱能力相關(guān)。其確切的機(jī)理，還需要從生理生化及分子水平上深入研究。

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Effect of Drought Stress on Wheat Anther Culture

WANG Wei1,WANG Jianhong2,LUO Junjie1,CHEN Chen1,OU Qiaoming1,YE Chunlei1

(1.Bio-technology Institute,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou,Gansu 730070,China;2.Bioengineering Department of Lanzhou Vocational Technology College,Lanzhou,Gansu 730070,China)

In order to broaden the genotypes of crossing parents potentially used in the anther culture breeding spring wheat with drought resistance and expore the effects of drought stress on wheat anther culture,the anther culture characteristics of seven wheat varieties cultivated in Gansu were evaluated and the one (Longchun 27) with both strong drought reisistance and elite anther characteristics was selected and then with simulating the drought stress by adding 120 mg·L-1PEG into the induction medium and the donor materials (Longchun 27 and other three elite anther culture materials) growing in the condition of drought stress in the field,the anthers were cultured and the effects of drought stress on anther culture were studied.The result showed that the callus induction inhibited in all of the four donor genotypes,but the extent of inhibition was not identical in these genotypes. The rank of callus drought resistance coefficient in the two drought stress conditions was highly consistent. Drought resistance of the four genotypes was evaluated in the field and it was not identical for each of these materials. Correlation analysis of callus drought resistance coefficient and drought resistance showed significant correlation between them.

Wheat; Anther culture; Drought stress; Drought resistance

時間：2016-05-10

2015-11-10

2015-12-08

甘肅省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2013GAAS27)；甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項(xiàng)目(GNSW-2014-15)；甘肅省農(nóng)科院科技創(chuàng)新工程學(xué)科團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2014GAAS06；2015GAAS02)

E-mail：haploidbreeding@163.com

葉春雷(E-mail:ycl_81@sina.com)

S512.1；S311

A

1009-1041(2016)05-0641-06

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