沈　慧,陶寧萍,趙林敏,梅夢瑤

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

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辣木葉中多酚提取的工藝研究

沈慧,陶寧萍*,趙林敏,梅夢瑤

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

本論文采用熱浸提法,以食用酒精為溶劑,考察酒精度數(shù)、液料比、D-異抗壞血酸鈉用量、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)辣木葉多酚提取率的影響,并在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析,優(yōu)化了辣木葉多酚的提取工藝。結(jié)果表明,辣木葉多酚的最優(yōu)提取工藝條件:食用酒精度數(shù)為64%vol,液料比為20∶1(mL·g-1),D-異抗壞血酸鈉添加量為0.15‰,提取溫度為64 ℃,提取時(shí)間為115 min,在此條件下多酚的得率為3.39%。

辣木葉,多酚,酒精,提取

辣木(Moringaoleifera),分類學(xué)屬為植物界(Plantage),種子植物門(Spermatophyta),雙子葉植物綱(Dicotyledoneae),白花菜目(Brassicales),辣木科(Moringaceae),辣木屬(MoringaAdans),喬木種(Arbor)。辣木原產(chǎn)于印度,由于辣木的葉、籽、根和花均能食用,主要用于增進(jìn)營養(yǎng)與食療保健,因而被譽(yù)為“神奇之樹”[1]。我國于20世紀(jì)60年代引入,2012年11月我國衛(wèi)生部發(fā)布公告批準(zhǔn)辣木葉為新食品原料,這使得辣木葉在國內(nèi)具有一定的發(fā)展前景[2]。

辣木葉富含各類維生素和礦物質(zhì)成分,K含量很高,遠(yuǎn)高于Na的含量,適合高血壓患者食用。除此以外,辣木葉還有許多醫(yī)學(xué)效用,如消炎抑菌、降血糖、降血壓、抗腫瘤、抗氧化等,其主要功效成分是多酚,并且辣木葉中多酚含量較高,具有很好的利用價(jià)值[3-4]。

目前,國內(nèi)對(duì)于辣木葉的研究主要集中在蛋白質(zhì)、多糖和黃酮的研究,對(duì)多酚提取的研究較少,并且已有的提取多采用工業(yè)乙醇、甲醇等有機(jī)試劑作為提取溶劑,提取后的提取液不可用于相關(guān)食品的生產(chǎn)[2]。本研究以辣木葉為原料,以食用酒精為載體,采用熱浸提方法,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳工藝條件,以期為工業(yè)化提取辣木葉多酚提供適宜的工藝參數(shù),得到的辣木葉酒精提取液可用于辣木酒的相關(guān)研究。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

辣木葉粉云南辣木葉粉(水分含量10.91 g/100 g濕樣),由上海中福集團(tuán)有限公司提供;沒食子酸、福林酚試劑、碳酸鈉國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;95%食用酒精等級(jí)為GB10343-2008中的優(yōu)級(jí),上海銓澤實(shí)業(yè)有限公司;D-異抗壞血酸鈉食品添加劑,江西省德興市百勤異VC鈉有限公司;蒸餾水等。

HWS24型電熱恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司;UV2300紫外分光光度計(jì)麥儀科學(xué)儀器(上海)有限公司;TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱量10 mg沒食子酸,用蒸餾水定容至100 mL,配置成0.1 mg/mL的沒食子酸水溶液。

具體操作根據(jù)文獻(xiàn)[5-6]做適當(dāng)?shù)男薷?精確吸取0.1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分別置于20 mL的比色管中,加蒸餾水至1 mL,再加1.5 mL福林酚試劑,3 mL 75 g/L碳酸鈉試劑,加水定容至10 mL后放置反應(yīng)2 h。

用樣品管在600～900 nm范圍內(nèi)掃描波長,得到掃描曲線,確定多酚的測定波長為752 nm。

以0管作空白,在752 nm處測定吸光值,以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),得到多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=99.357x-0.01538,相關(guān)系數(shù)R2=0.9992,其線性關(guān)系良好。

1.2.2辣木葉多酚的提取、測定及得率的計(jì)算準(zhǔn)確稱取一定量的辣木葉粉,以食用酒精于一定溫度下進(jìn)行浸提,提取后離心,得到綠色浸提液。

精確量取0.02 mL提取液于20 mL的比色管中,加蒸餾水至1 mL,再加1.5 mL福林酚試劑,3 mL 75 g/L碳酸鈉試劑,加水定容至10 mL后放置反應(yīng)2 h后,于752 nm處用紫外-可見分光光度計(jì)測定其吸光值。

辣木葉多酚的得率按以下公式計(jì)算:

其中:c:提取液中多酚的含量,mg/mL;v:提取液體積,mL;m:稱取的辣木葉粉量,mg。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)采用1.2.2中方法提取辣木葉多酚,提取條件為:固定反應(yīng)條件為1 g辣木葉粉,按液料比10∶1(mL·g-1),常溫(20～26 ℃)浸提30 min,期間每隔10 min振搖1 min,考察不同酒精度(55%、60%、65%、70%、75%vol)對(duì)多酚得率的影響[7-8];固定反應(yīng)條件為1 g辣木葉粉,加入65%vol的酒精溶液,常溫(20～26 ℃)浸提30 min,期間每隔10 min振搖1 min,考察不同液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL·g-1)對(duì)多酚得率的影響[9];固定反應(yīng)條件為1 g辣木葉粉,按液料比20∶1(mL·g-1)加入65% vol的酒精溶液,常溫(20～26 ℃)浸提30 min,期間每隔10 min振搖1 min,根據(jù)GB 2760-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[10],D-異抗壞血酸鈉的最大添加量為0.15‰,進(jìn)行添加量的篩選,考察不同添加量(0.03‰、0.06‰、0.09‰、0.12‰、0.15‰、0.18‰)對(duì)辣木葉多酚得率的影響,并進(jìn)一步測定多酚穩(wěn)定性;固定反應(yīng)條件為1 g辣木葉粉,按液料比20∶1(mL·g-1)加入65%vol的酒精溶液,D-異抗壞血酸鈉的添加量為0.15‰,浸提30 min,期間每隔10 min振搖1 min,考察提取溫度(35、45、55、65、75 ℃)對(duì)多酚得率的影響[11];固定反應(yīng)條件為1 g辣木葉粉,按液料比20∶1(mL·g-1)加入65%vol的酒精溶液,D-異抗壞血酸鈉的添加量為0.15‰于65 ℃浸提,期間每隔10 min振搖1 min,考察提取時(shí)間(30、60、90、120、150 min)對(duì)辣木葉多酚得率的影響。

1.2.4Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取影響較大的四個(gè)因素,每個(gè)因素選取三個(gè)對(duì)多酚得率影響較大的水平,建立四因素三水平的Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn),以多酚得率為響應(yīng)值,各因素的三個(gè)水平采用-1、0、1進(jìn)行編碼,如表1。

表1　響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平和編碼

1.3數(shù)據(jù)處理

利用Design-Expert 8.0.6Trial軟件繪制曲線,用Excel 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,并用SPSS2.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素對(duì)多酚得率的影響

2.1.1酒精度數(shù)對(duì)多酚得率的影響由圖1可知,辣木葉多酚得率隨著酒精度數(shù)的增大呈先增大再減小的趨勢。這是由于多酚是多種化合物的混合物,包括各類苷類物質(zhì)等,這些物質(zhì)的極性和化學(xué)結(jié)構(gòu)不同,在不同酒精度中的溶解度也不同。因此,確定提取辣木多酚的最佳酒精度數(shù)為65% vol。這與陳瑞嬌等[8]對(duì)辣木葉總黃酮提取確定的70%的乙醇溶液相類似。

圖1　酒精度數(shù)對(duì)辣木葉多酚得率的影響Fig.1　Influence of concentration of alcohol on yield of Moringa leaf polyphenols注:字母不同代表存在顯著性差異(p<0.05),圖2～圖6同。

2.1.2液料比對(duì)多酚得率的影響圖2顯示多酚得率隨液料比的增加先增大再減少。溶劑用量太少,導(dǎo)致多酚提取不完全,得率低;而用量過多會(huì)增加成本,對(duì)后續(xù)步驟帶來不便,并且會(huì)由于辣木葉粉中一些其他物質(zhì)如多糖溶出,影響了多酚的提取分離,導(dǎo)致多酚得率減少。在液料比為20∶1(mL·g-1)時(shí)多酚的得率最高,因此選擇液料比20∶1(mL·g-1)。

圖2　液料比對(duì)辣木葉多酚得率的影響Fig.2　Influence of ratio of solution of alcoholto Moringa leaves on yield of Moringa leaf polyphenols

2.1.3D-異抗壞血酸鈉用量對(duì)多酚得率的影響酚類物質(zhì)由于含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的酚羥基,因而極易被氧化。D-異抗壞血酸鈉屬于還原劑,能夠?qū)⒍喾友趸钢械腃u2+還原成Cu+,還可將多酚氧化酶反應(yīng)中生成的醌還原成酚,阻止醌的進(jìn)一步氧化。因此,可以通過添加D-異抗壞血酸鈉保護(hù)多酚。由圖3可以看出,當(dāng)抗氧劑添加量為0.15‰時(shí),效果較好。

圖3　D-異抗壞血酸鈉添加量對(duì)辣木葉多酚得率的影響Fig.3　Influence of the amount of D-sodium erythorbate on yield of Moringa leaf polyphenols

進(jìn)一步測定多酚的穩(wěn)定性,結(jié)果如圖4所示:

圖4　多酚穩(wěn)定性的研究Fig.4　The stability of Moringa leaf polyphenols

由圖4可知,未加入抗氧化劑時(shí)隨著時(shí)間延長多酚得率會(huì)出現(xiàn)顯著性下降,而加入0.15‰的D-異抗壞血酸鈉后多酚穩(wěn)定性增強(qiáng)。

2.1.4提取溫度對(duì)多酚得率的影響當(dāng)提取溫度小于65 ℃時(shí),辣木多酚的得率隨溫度的升高而增加;當(dāng)溫度大于65 ℃時(shí),辣木多酚的得率隨溫度的升高而降低。升溫加強(qiáng)了辣木多酚的溶解擴(kuò)散作用,加快了其溶出的速度,但溫度過高一方面會(huì)對(duì)辣木多酚產(chǎn)生氧化破壞,另一方面酒精揮發(fā)導(dǎo)致酒精度數(shù)降低,降低了多酚的得率,因而在65 ℃以后得率逐漸減少。因此,確定最佳的提取溫度為65 ℃。

圖5　提取溫度對(duì)辣木葉多酚得率的影響Fig.5　Influence of extraction temperature on yield of Moringa leaf polyphenols

2.1.5提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響提取時(shí)間對(duì)多酚得率有較大的影響。提取時(shí)間過短,導(dǎo)致多酚未能被完全溶解出來,提取不徹底。因此,延長提取時(shí)間可以大大提高多酚的得率。然而,提取時(shí)間過長,會(huì)造成辣木中的其它物質(zhì)在熱效應(yīng)的作用下也被提取出來,影響提取液中多酚的含量,并且長時(shí)間受熱會(huì)加速酚類物質(zhì)與氧氣反應(yīng)不利于提取。

圖6　提取時(shí)間對(duì)辣木葉多酚得率的影響Fig.6　Influence of extraction time on yield of Moringa leaf polyphenols

由圖6可知,當(dāng)提取時(shí)間小于120 min時(shí),多酚得率隨時(shí)間的延長提高;當(dāng)提取時(shí)間超過120 min時(shí),多酚得率減少。因此,辣木多酚的最佳提取時(shí)間為120 min。

2.2辣木葉多酚提取工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素各實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用Box-Benhnken進(jìn)行實(shí)驗(yàn)因素設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示:

表2　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

表3　響應(yīng)面回歸方程的方差分析

注:“-”表示不顯著(p>0.05);“**”表示極顯著(p<0.01)。

對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸分析得到各個(gè)因素與響應(yīng)值的回歸方程:

Y=3.37-0.086A+0.083B-0.12C-0.14D+0.062AB-0.023AC-0.033AD-0.030BC+0.005BD-0.17CD-0.12A2-0.52B2-0.44C2-0.38D2

回歸模型的R2=0.9996,為進(jìn)一步驗(yàn)證回歸模型的準(zhǔn)確性,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和方程進(jìn)行方差分析,其分析結(jié)果如表3所示,從表3可知模型對(duì)多酚得率值的影響顯著(F=2834.69,p<0.0001<0.05)即實(shí)驗(yàn)所采用的二次模型是合理的,在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是有意義的。而方程的失擬項(xiàng)小,差異性不顯著(p=0.0990>0.05)表明回歸模型與實(shí)驗(yàn)擬合程度好,有利于模型,因此可以利用該模型預(yù)測多酚得率代替實(shí)際實(shí)驗(yàn)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行結(jié)果分析。由表3可知,酒精度數(shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間四種因素均對(duì)響應(yīng)值多酚得率的影響極顯著(p<0.01),AB、AC、AD、BC、CD的p值均小于0.05,而BD的p值為0.3176大于0.05,說明酒精度數(shù)與液料比、酒精度數(shù)與溫度、酒精度數(shù)與時(shí)間、液料比與溫度、溫度與時(shí)間之間對(duì)響應(yīng)值交互作用極顯著(p<0.01),而料液比和時(shí)間對(duì)響應(yīng)值交互作用不顯著(p>0.05)。

圖7　提取條件對(duì)辣木葉多酚得率的響應(yīng)面圖Fig.7　Response surface of extraction conditions yield of Moringa leaf polyphenols evaluation

根據(jù)擬合函數(shù)的預(yù)測值可做出任意兩個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值影響的三維響應(yīng)面圖,從模型的三維響應(yīng)面圖可以直觀的反應(yīng)因素對(duì)響應(yīng)值的影響。圖7a～f分別為酒精度數(shù)和液料比對(duì)多酚得率的影響、酒精度數(shù)和提取溫度對(duì)多酚得率的影響、酒精度數(shù)和提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響、液料比和提取溫度對(duì)多酚得率的影響以及提取溫度和提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響,從圖7a～f可知當(dāng)其他因素濃度在0水平,其中一個(gè)因素濃度在一定水平時(shí),多酚得率隨著另外一個(gè)因素濃度的增加先上升后下降。圖7e反應(yīng)的是液料比和提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響。結(jié)合各響應(yīng)面的等高線分析可以說明酒精度數(shù)和液料比之間交互作用顯著,酒精度數(shù)和提取溫度之間交互作用顯著,酒精度數(shù)和提取時(shí)間之間交互作用顯著,液料比和提取溫度之間交互作用顯著,提取溫度和提取時(shí)間之間交互作用顯著,而液料比和提取時(shí)間之間交互作用較弱,這與表3中的分析相一致。

通過對(duì)響應(yīng)面分析和對(duì)回歸方程求導(dǎo),可得到酒精度數(shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間的最佳條件為:酒精度數(shù)63.63% vol、液料比20.20∶1(mL·g-1)、提取溫度63.64 ℃、提取時(shí)間115.20 min,在此條件下模型的預(yù)測響應(yīng)值(多酚得率)為:3.41%。鑒于實(shí)驗(yàn)操作可行性選擇酒精度數(shù)64%vol,液料比20∶1(mL·g-1),提取溫度64 ℃,提取時(shí)間115 min進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

在最佳修正條件下進(jìn)行3組平行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn),所得辣木提取液的多酚得率為3.39%±0.04%。說明該模型能夠較好地預(yù)測實(shí)際多酚的得率。

3　結(jié)論

通過研究發(fā)現(xiàn),食用酒精浸提辣木葉多酚切實(shí)有效。酒精度數(shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)辣木葉多酚的提取都有不同程度的影響。通過響應(yīng)面優(yōu)化并調(diào)整辣木葉多酚的最佳提取工藝條件為:酒精度數(shù)64% vol,液料比20∶1(mL·g-1),D-異抗壞血酸鈉添加量0.15‰,提取溫度64 ℃,提取時(shí)間115 min,在此條件下多酚的得率為3.39%;所制得的辣木提取液可進(jìn)一步用于辣木酒的研發(fā)。

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Extraction technology of polyphenol fromMoringaoleiferaleaves

SHEN Hui,TAO Ning-ping*,ZHAO Lin-min,MEI Meng-yao

(College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

In order to study the extraction technology of polyphenol fromMoringaleave,alcohol was used as the solvent,effects of the extraction conditions,namely alcohol concentration,alcohol solution/Moringaleaves ratio,extraction temperature,extraction time and amount of D-sodium erythorbate on the extraction rate of polyphenol were investigated. And then the first 4 factors were chosen for optimization of the extraction conditions by means of response surface methodology combined with Box-Behnken experimental design based on the single factor experiments. The results showed that the optimal extraction conditions were as follows:the concentration of alcohol was 64%vol,alcohol solution/theMoringaleaves ratio was 20∶1(mL·g-1),the dosage of D-sodium erythorbate was 0.15‰,the extraction temperature was 64 ℃,the extraction time was 115 min. The yield of polyphenol was 3.39%.

Moringaoleiferaleaves;polyphenol;alcohol;ectraction

2016-02-23

沈慧(1992-),女,碩士研究生,研究方向:辣木多酚的研究,E-mail:514833410@qq.com。

陶寧萍(1968-),女,教授,研究方向:食品營養(yǎng)與品質(zhì)評(píng)價(jià),E-mail:nptao@shou.edu.cn。

國家科技支撐計(jì)劃(2015BAD17B01)。

TS202.1

B

1002-0306(2016)18-0287-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.046