梁宏偉，馮　波，2，朱雯宇，王建舫，張　濤，穆　祥*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

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大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)與純化

梁宏偉1，馮波1，2，朱雯宇1，王建舫1，張濤1，穆祥1*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

旨在建立一種簡單易行、獲得細(xì)胞純度較高的體外分離、培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法。取5～7日齡SD大鼠分離外周肺組織，組織植塊法獲得原代大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，采用免疫磁珠法對其進(jìn)行分離純化，并對分離純化后的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光及流式細(xì)胞鑒定，通過MTT比色分析法準(zhǔn)確、安全、可靠地檢測純化后傳代肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示：倒置顯微鏡下觀察單個細(xì)胞呈短梭形或多角形，匯合后呈鋪路石樣，單層貼壁生長，細(xì)胞分離純化后經(jīng)免疫熒光檢測CD31呈陽性，流式細(xì)胞儀檢測淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面特有標(biāo)記VEGFR-3呈陰性(P=0.1，且P<0.5)，且復(fù)蘇后經(jīng)MTT測得傳代細(xì)胞的增殖情況良好。成功建立了一種分離高純度大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法。

大鼠；肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞；體外分離培養(yǎng)；免疫磁珠純化

微血管內(nèi)皮細(xì)胞(microvascular endothelial cells，MVECs)呈單層覆蓋于微血管內(nèi)表面，是構(gòu)成血管內(nèi)外物質(zhì)交換的一道重要屏障，也是循環(huán)血流剪切力和血液中危險因素的主要靶細(xì)胞，因而最易并且最早受到傷害。研究發(fā)現(xiàn)，微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有功能多樣性，它不僅是構(gòu)成血管組織間屏障的重要成分，而且在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能[1]，保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，維持正常生理和免疫功能，以及介導(dǎo)疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸[2]等方面都發(fā)揮重要的作用。當(dāng)前已有研究證明，MVECs是諸多細(xì)菌毒素和病毒(如皰疹病毒[3]、艾滋病毒[4]等)等致病因子攻擊的主要作用細(xì)胞[5-6]。D.Manuela等報道H5N1亞型高致病性禽流感病毒可以在血管內(nèi)皮細(xì)胞系和人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制[7-8]，并且誘導(dǎo)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[9]。所以對于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs)功能和地位的研究越來越受到人們的重視。近年來人們進(jìn)行了大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(rat pulmonary microvascular endothelial cells，RPMVECs)體外培養(yǎng)研究，構(gòu)建實驗?zāi)Ｐ?，對深入研究生理和病理情況下大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因、表型、功能的變化及其調(diào)控機(jī)制具有重要意義。內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)始于1921年[10]，起初培養(yǎng)技術(shù)較落后，直到1963年Y.Maruyama第一次成功培養(yǎng)了人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞后才在技術(shù)上有所突破，成功分離了大血管內(nèi)皮細(xì)胞[11]，對于MVECS來說，由于受到各種條件的限制，發(fā)展相對滯后。直到1980年，P.M.Davison等才成功分離培養(yǎng)了MVECs[12]。雖然國內(nèi)外已有許多關(guān)于RPMVECs體外分離與培養(yǎng)方法的報道，但傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法存在細(xì)胞游離少，生長緩慢，極易受到成纖維細(xì)胞等其他雜細(xì)胞污染[13-15]等問題，并且以往對RPMVECs的原代培養(yǎng)存在純度低，難度大，成功率低，重復(fù)性差，成本高等弊端。本研究是在對原代RPMVECs經(jīng)長期培養(yǎng)后，針對SD品系大鼠的原代PMVECs組織塊培養(yǎng)法中常見問題加以歸納、總結(jié)，細(xì)節(jié)技術(shù)加以改進(jìn)，并對所培養(yǎng)細(xì)胞分離純化和鑒定，旨在提高RPMVECs體外培養(yǎng)方法的可靠性和重復(fù)性，而建立的一套操作簡便且純度高的系統(tǒng)的RPMVECs原代培養(yǎng)方法。

1　材料與方法

1.1試驗時間、地點

試驗于2015年10月至2016年3月在北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室進(jìn)行。

1.2試驗動物

5～7日齡SD大鼠，雌雄均可，購自中國科學(xué)院遺傳所實驗動物中心。

1.3主要儀器和器材

CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO，型號：MCO-17AC)，倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS，型號：IX71-A21PH )，高速低溫離心機(jī)(SIGMA 6-16K)，DG-ò型酶聯(lián)儀(南京電子管廠)，流式細(xì)胞儀(美國 BD 公司，型號：FACSAria Ⅲ 型)，細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司，型號：3516)，超菌工作臺(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司，型號：DL-CF-IND)。

1.4試劑

D-Hank’s(GIBCO，批號：H2387)，胎牛血清(FBS，PAA Laboratories Gmbh，批號：A04105-1121)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Sigma，批號：1136551)，胰蛋白酶(1∶250，Gibco，批號：2750018)，L-谷氨酰胺(Sigma，批號：03126)，兔抗大鼠CD 31單克隆抗體(Origene，批號：TA504773)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(Abcam，批號：ab6785)，DAPI染色液 (北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：C-0033)，ECGS (Millipore，批號：02-102)，肝素鈉(萬通藥業(yè)，批號：H32022088)，MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(Sigma，批號：C0009)，CELLECTION PAN MOUSE IGG KIT(Invitrogen，批號：11531D)，血管內(nèi)皮生長因子受體3(VEGFR-3，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-2202R-FITC)。

1.5RPMVECs的原代培養(yǎng)

取5只5～7日齡SD大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡消毒，無菌取出肺，冷D-Hank’s清洗3次，在干濾紙上剪取肺邊緣組織(3 mm左右)，緩慢滾動去除臟層胸膜后，置于少量胎牛血清中，并剪成小于1 mm×1 mm×1 mm大小的，近于糊狀的組織塊。然后采用組織塊植塊法，用移液槍均勻涂于6孔培養(yǎng)板底部。將培養(yǎng)板倒置于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，使組織塊貼壁 30 min后緩慢滴加20% DMEM培養(yǎng)基(20% FBS，2% L-谷氨酰胺、青霉素1×104U·mL-1、鏈霉素1×104U·mL-1、ECGS 15 μg·mL-1、1.5%肝素鈉)，以剛好浸沒組織塊為宜。于37 ℃、5% CO2恒濕恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液，90 h棄組織塊，待細(xì)胞匯合成團(tuán)消化傳代[9]。

1.6RPMVECs的傳代培養(yǎng)

選取生長至完全匯合狀態(tài)的培養(yǎng)孔，吸棄原培養(yǎng)基，用37 ℃預(yù)熱的D-Hank’s清洗3次后每孔加入0.5 mL 0.05%胰蛋白酶(含0.005% EDTA)，顯微鏡下觀察，待細(xì)胞間連接疏松，且大部分細(xì)胞收縮變圓變亮?xí)r立即終止消化，以1 000 r·min-1室溫離心5 min后棄上清，加培養(yǎng)基混勻，按1∶2比例接種于細(xì)胞培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)[17]。待RPMVECs傳至第2～3代時分離純化，培養(yǎng)至第5代左右，細(xì)胞狀態(tài)最佳時用于試驗研究。

1.7RPMVECs的免疫磁珠分離純化

待細(xì)胞傳到第2～3代時采用免疫磁珠純化法[16]直接分離純化得到RPMVECs。向盛有預(yù)洗過磁珠的離心管中加入一抗，室溫下孵育30 min，磁力震動后棄去上清，重復(fù)操作一次，加入細(xì)胞懸液并混懸，2～8 ℃ 孵育20 min，用200 μL緩沖液3懸浮磁珠并重復(fù)操作一次。

1.8RPMVECs的鑒定

1.8.1抗CD 31抗體免疫熒光染色將經(jīng)免疫磁珠純化分離得到的RPMVECs接種在于預(yù)置有細(xì)胞培養(yǎng)專用圓形蓋玻片的培養(yǎng)板，于培養(yǎng)箱中靜置24 h，用預(yù)熱的(37 ℃) PBS漂洗3次，加入預(yù)冷的(4 ℃)4%多聚甲醛溶液固定20 min，加入一抗兔抗大鼠CD 31抗體，4 ℃孵育過夜，陰性對照組PBS代替一抗。與FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG 37 ℃ 孵育45 min，DAPI作用10 min。最后用超純水沖洗甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8.2流式細(xì)胞儀檢測血管內(nèi)皮生長因子受體3(vascular endothelial growth factor-3，VEGFR-3)的表達(dá)取純化后的RPMVECs，常規(guī)法消化，2 000 r·min-1離心7 min，棄上清，PBS洗1次后重懸，制成大于1×109L-1的單細(xì)胞懸液，分至每個待測的流式管，0.1 mL·管-1，分別加入熒光標(biāo)記的抗體及其相應(yīng)的同型對照抗體，室溫避光孵育15 min，2 000 r·min-1離心7 min后300 μL PBS重懸后上機(jī)[16]。

1.9MTT比色分析法檢測傳代RPMVECs的增殖情況

取純化鑒定后對數(shù)生長期的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，采用常規(guī)方法將細(xì)胞凍存[17]。一段時間后，復(fù)蘇[17]細(xì)胞，MTT比色法[18]測定貼壁細(xì)胞增殖活性。選取復(fù)蘇后經(jīng)傳代培養(yǎng)生長為單層的 RPMVECs，常規(guī)方法消化后，接種入 96 孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1×104mL-1，同時設(shè)不含細(xì)胞的空白對照孔，每組設(shè)4個重復(fù)。37 ℃、5% CO2靜置培養(yǎng)，分別于RPMVECs傳代后0、24、48、72、96 h時加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，加入Formazan溶解液，吹打至紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定 570 nm 波長處的光吸收度OD值，比色時用空白孔調(diào)零，計算平均值，以時間為橫坐標(biāo)，平均光吸收度為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線[19]。

2　結(jié)　果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

倒置顯微鏡下觀察肺組織塊貼于培養(yǎng)板后(圖1A)，24 h 開始逐漸有細(xì)胞游出(圖1B)，觀察并記錄下48 h 細(xì)胞的生長狀態(tài)(圖1C)，90 h 左右棄組織塊，觀察并記錄下棄組織塊前后、及棄后24 h 細(xì)胞的生長狀態(tài)(圖1D～F)，原代細(xì)胞生長5～7 d后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞多呈梭形或三角形，細(xì)胞質(zhì)豐富、胞核清晰呈卵圓形，且由原來的分散集落逐漸融合形成細(xì)胞單層，呈鵝卵石鑲嵌狀排列，具有微血管內(nèi)皮細(xì)胞典型的鋪路石樣形態(tài)，如若過度融合生長會因細(xì)胞過于緊密而呈現(xiàn)進(jìn)行性細(xì)長紡錘形。此時可將原代細(xì)胞傳代，隨著傳代培養(yǎng)次數(shù)的增加細(xì)胞變?yōu)殚L梭形，并逐漸呈漩渦樣生長或聚集生長。若傳代次數(shù)過多將會導(dǎo)致原代RPMVECs貼壁率下降，純度降低，則不再適宜試驗研究。因此，本試驗根據(jù)細(xì)胞的生長情況，當(dāng)細(xì)胞傳至第2～3代時采用免疫磁珠純化法直接分離純化，并對純化后的細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)抗原的鑒定，以保證細(xì)胞的純度。

2.2RPMVECs經(jīng)免疫磁珠分離純化的結(jié)果

通過磁珠純化系統(tǒng)純化細(xì)胞，用CD 31因子抗原進(jìn)行篩選。光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄RPMVECs在免疫磁珠分離純化前、后經(jīng)0、24、72 h細(xì)胞的對比形態(tài)(圖2)。純化前的細(xì)胞中混有雜細(xì)胞，經(jīng)CD31免疫磁珠篩選，以確保培養(yǎng)出純度高、大小均一，狀態(tài)良好的RPMVECs。

2.3CD31抗原鑒定結(jié)果

CD31免疫熒光染色結(jié)果呈陽性(圖3)，在倒置熒光顯微鏡下RPMVECs的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜呈典型的黃綠色熒光，如圖3L，而細(xì)胞核不著色。細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核間界限明顯，細(xì)胞整體呈梭形或多邊形。但經(jīng)DAPI染色后細(xì)胞核呈典型的藍(lán)紫色熒光，如圖3M，熒光染色圖片疊加后結(jié)果如圖3N所示。

A.肺組織塊貼于培養(yǎng)板；B.24 h 細(xì)胞游出；C.48 h 所游出細(xì)胞的生長狀態(tài)；D.90 h棄組織塊前細(xì)胞的生長狀態(tài)；E.棄掉組織塊后細(xì)胞的狀態(tài)；F.棄組織塊后24 h細(xì)胞的生長狀態(tài)A.Lung tissue blocks attached to culture plate；B.24 h cells swim out；C.The growth state of the 48 h cells；D.The growth state of cells in abandoned tissues；E.The state of cells after abandoning tissues；F.The growth state of the cells after 24 hours of abandoned tissues圖1　原代培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)Fig.1　The cell morphology of primary culture

G.RPMVECs分離純化前的生長狀態(tài)；H.RPMVECs分離純化后0 h的生長狀態(tài)；I.RPMVECs分離純化后24 h的生長狀態(tài)；J.RPMVECs分離純化后72 h的生長狀態(tài)G.The growth state of RPMVECs before separation and purification；H.The growth state of RPMVECs after 0 h was isolated and purified；I.The growth state of RPMVECs after 24 h was isolated and purified；J.The growth state of RPMVECs after 72 h was isolated and purified圖2　RPMVECs分離純化前、后的結(jié)果Fig.2　The growth state of RPMVECs before and after purification

2.4細(xì)胞免疫表型的測定

由于對肺部血管內(nèi)皮細(xì)胞篩選時最可能混有淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，且淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特有的表面標(biāo)記物為VEGFR-3抗體，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)結(jié)果呈陰性(P=0.1，且P<0.5)，則說明分離純化后的細(xì)胞無淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞混雜，見圖4。

K.倒置熒光顯微鏡明場下RPMVECs的生長狀態(tài)；L.RPMVECs細(xì)胞膜上的CD31 抗原熒光染色的結(jié)果；M.RPMVECs細(xì)胞核經(jīng)DAPI熒光染色的結(jié)果；N.倒置熒光顯微鏡熒光激發(fā)下RPMVECs的生長狀態(tài)K.Inverted fluorescence microscope RPMVECs off-court growth state；L.Results of RPMVECs membrane CD31 antigen fluorescence staining；M.Results of RPMVECs nuclei by DAPI fluorescence staining；N. Inverted fluorescence microscope fluorescence inspired RPMVECs growth state圖3　CD31抗體鑒定結(jié)果Fig.3　Cell identification for CD31 antigen

圖4　VEGFR-3表達(dá)結(jié)果呈陽性的細(xì)胞占所分選細(xì)胞的比例Fig.4　The proportion of VEGFR-3 positive cells in selected cells

2.5分離純化后RPMVECs的凍存和復(fù)蘇

待RPMVECs培養(yǎng)至對數(shù)生長期時(圖5O)，采用常規(guī)方法消化細(xì)胞后嚴(yán)格按照梯度凍存法[22]步驟要求將細(xì)胞凍存，將凍存管迅速移入液氮容器罐內(nèi)儲存。為檢測分離純化后細(xì)胞的狀態(tài)，取出凍存管，將細(xì)胞復(fù)蘇，接種于6孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日觀察(圖5P)細(xì)胞形態(tài)一致，呈卵圓形，大小均一，說明分離純化所得細(xì)胞狀態(tài)好，抗凍存能力強(qiáng)，換液后繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

2.6MTT法檢測純化后傳代RPMVECs的增殖情況

MTT法測定復(fù)蘇后傳代RPMVECs生長曲線，檢測共用4 d，最后以培養(yǎng)時間為橫軸，每日測得的細(xì)胞平均吸光度值為縱軸，單點標(biāo)示出細(xì)胞每日平均吸光度值，連接各點即成生長曲線圖(圖6)。由圖6可知，前3 d OD值與時間呈正相關(guān)，如圖中0～72 h段所示，第3天細(xì)胞量經(jīng)對數(shù)期達(dá)到最大值，而后OD值稍有降低，即第四天后細(xì)胞生長進(jìn)入平臺期，增殖速率放緩，如圖中72～96 h段所示。

O.凍存前RPMVECs細(xì)胞形態(tài)；P.復(fù)蘇后RPMVECs細(xì)胞形態(tài)O.Cell morphology of RPMVECs before cryopreservation；P.Cellular morphology of RPMVECs after resuscitation圖5　分離純化后RPMVECs的抗凍存能力Fig.5　Ability of RPMVECs against cryopreservation ofter isolation and purification

圖6　MTT作用時間對RPMVECs增殖反應(yīng)的影響Fig.6　Affection of MTT effect time on RPMVECs proliferation response

3　討　論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是覆蓋于血管內(nèi)膜表面呈單層扁平或多角形的細(xì)胞，具有多種生物學(xué)功能：參與血管活性物質(zhì)代謝；參與調(diào)節(jié)凝血、抗凝與纖溶；參與維持血管壁完整[20]。不同部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、表型和功能等方面均有所不同。肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞在物質(zhì)轉(zhuǎn)運、急性肺損傷等過程中發(fā)揮重要作用，可見該細(xì)胞的體外培養(yǎng)成功與否，直接決定著體外研究流感病毒和內(nèi)皮細(xì)胞間相互作用的關(guān)鍵。出于對這些生理功能及病理作用的研究，國內(nèi)外開展肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)已近20年，目前國際上對該細(xì)胞體外培養(yǎng)方法多為酶消化法[21-22]及組織植塊法[23]，本試驗在原代細(xì)胞培養(yǎng)過程中對以往的組織植塊法加以改進(jìn)。

在原代RPMVECs培養(yǎng)過程中，大鼠外周肺組織的正確取材是成功的前提，嚴(yán)格剪取外周肺組織可以減少大血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的污染[14]。既往的研究對外周肺組織取材的厚度并未作出明確界定，本研究參考多名學(xué)者以往的培養(yǎng)方法[24]，將取材范圍嚴(yán)格控制在肺葉邊緣3 mm左右。以往關(guān)于原代PMVECs分離培養(yǎng)的文獻(xiàn)中所介紹[20]，多數(shù)是將所取肺組織剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，60 h后去除組織塊。但經(jīng)多次試驗，摸索發(fā)現(xiàn)若將組織塊剪的更小，甚至接近于糊狀時，縮短 PMVECs 爬出時游離的距離。眾所周知組織塊法培養(yǎng)原代內(nèi)皮細(xì)胞是根據(jù)細(xì)胞遷移能力的差異而分離出RPMVECs的，但分離過程中仍有可能混有雜細(xì)胞，所以要嚴(yán)格把控去除組織塊的時間，肺組織貼壁培養(yǎng)24 h 后血細(xì)胞開始游出，48 h后伴有PMVECs游出，72 h后開始游出的則是成纖維細(xì)胞，所以此前文獻(xiàn)多報道在組織塊貼壁培養(yǎng)60 h后將其去除[13-16]，理論上若此時去除組織塊，則培養(yǎng)板中只剩下血細(xì)胞和PMVECs，其中血細(xì)胞可通過換液和傳代的過程去除，但是此方法很難保證完全無成纖維細(xì)胞的混雜，況且貼壁培養(yǎng)60 h即棄掉組織塊，此時游出來的PMVECs數(shù)量較少，且增殖緩慢，不利于細(xì)胞生長。綜合以上因素，本試驗將棄組織塊的時間調(diào)整到貼壁培養(yǎng)90 h 后，因為此時游出的PMVECs數(shù)量已遠(yuǎn)超于成纖維細(xì)胞的量，PMVECs已占明顯優(yōu)勢，成纖維細(xì)胞的生長將明顯受到抑制，而后對那些不具備典型鋪路石樣的細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械刮除。同時本試驗對原代細(xì)胞的培養(yǎng)基加以改進(jìn)，添加了促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長因子ECGS 15 μg·mL-1和1.5%肝素鈉，該種培養(yǎng)基在促進(jìn)PMVECs 生長的同時還可較好地抑制成纖維細(xì)胞的生長。運用改良后的組織植塊法大大提高了所分離原代RPMVECs的純度和數(shù)量，降低了雜細(xì)胞的污染程度，為進(jìn)一步做細(xì)胞純化提供了有力的前提條件。

如何對培養(yǎng)出的貼壁內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分離純化，目前缺乏公認(rèn)的特異性方法和標(biāo)志。“鵝卵石”或“鋪路石”樣形態(tài)被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞的特征性細(xì)胞形態(tài)，但是文獻(xiàn)[24]報道及本試驗結(jié)果顯示，傳代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)可發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為梭形或多角形。因此，培養(yǎng)細(xì)胞除進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察判斷外，必須對已得到的原代RPMVECs進(jìn)行分離純化。目前，國際上已形成的PMVECs純化的方法主要有生物特性選擇法、物理剖除法、局部消化法、差速黏附法及免疫磁珠法[16，24]。本試驗中，作者采用免疫磁珠法分離純化原代RPMVECs，該法具有分離速度快、效率高、重復(fù)性強(qiáng)、操作簡單且不影響被分離細(xì)胞的生物學(xué)性狀和功能的特性，符合實驗室所用研究方法的要求。

為了獲得純度更高，更具有保種意義的原代RPMVECs，作者對分離純化后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，鑒定方法多為免疫組化染色Ⅷ因子、CD31相關(guān)抗原[14-16]和流式細(xì)胞儀對細(xì)胞表面受體的檢測。此前對Ⅷ因子、CD31相關(guān)抗原表達(dá)的檢測一直被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定的經(jīng)典指標(biāo)。但在徐順貴等[13]的研究中PMVECs Ⅷ因子相關(guān)抗原的表達(dá)為陰性。所以本試驗采用免疫組化法對CD31相關(guān)抗原進(jìn)行鑒定，而由于內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記CD31的高表達(dá)僅限于1～3代[24]，所以作者選擇第2～3代細(xì)胞經(jīng)免疫磁珠分離純化后鑒定，免疫熒光檢測CD31呈陽性。E.Kukk等[25]于1996年利用受體親和色譜法從前列腺癌細(xì)胞的胞外基質(zhì)中提純出了血管內(nèi)皮生長因子C DNA，血管內(nèi)皮生長因子C是近年來發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮生長因子家族新成員，并且可特異性地與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGFR-3結(jié)合，是目前所知唯一具有淋巴管生成作用的因子。分離純化肺部血管內(nèi)皮細(xì)胞的過程中最可能混有淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，且其表面特有標(biāo)記為VEGFR-3抗體，所以將經(jīng)CD31免疫磁珠純化后的細(xì)胞再經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測VEGFR-3抗體表達(dá)呈陰性，說明純化所得的RPMVECs無淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的混雜。

復(fù)蘇分離純化后的RPMVECs，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)反映其較強(qiáng)的抗凍存能力，繼續(xù)傳代培養(yǎng)并采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。經(jīng)典MTT法簡便、迅速、準(zhǔn)確、安全、價廉，已在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等許多研究領(lǐng)域中用于對細(xì)胞活性、細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的檢測，但對于測定分離純化后傳代RPMVECs增殖情況的報道較少。其基本原理是活細(xì)胞的琥珀脫氫酶能還原MTT，形成不溶于水的藍(lán)紫色甲臜(formazam)結(jié)晶，加入有機(jī)溶劑結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀測定的吸光度值便可準(zhǔn)確直觀地反映活細(xì)胞的量。

4　結(jié)　論

成功建立了分離純度高、生長快的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，且本改良方法簡便易行、可重復(fù)性強(qiáng)。

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(編輯白永平)

Cultivation and Purification of Rat Pulmonary Microvascular Endothelial Cellsinvitro

LIANG Hong-wei1，F(xiàn)ENG Bo1，2，ZHU Wen-yu1，WANG Jian-fang1，ZHANG Tao1，MU Xiang1*

(1.BeijingKeyLaboratoryofTraditionalChineseVeterinaryMedicine，BeijingUniversistyofAgriculture，Beijing102206，China；2.VeterinaryMedicineinChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China)

This study aims at establishing a simple method of obtaining the high-purity rat pulmonary microvascular endothelial cells isolated and culturedinvitro.Peripheral lung tissues were separated from 5 to 7 days of SD rat under sterile condition.Rat pulmonary microvascular endothelial cells was acquired by taking the tissue graft block method，digested with trypsin and then maintained at 37 ℃ in a 5% CO2humidified atmosphere.The cells were purificated using the method of immune magnetic beads，subsequently identified by the immunofluorescence and flow cytometry，and then determined by MTT colorimetric analysis to detect the original generation of pulmonary endothelial cell growth curve.Rat lung microvascular endothelial cells was successfully obtained by taking the tissue graft block method and individual cells under inverted microscope showed short fusiform or polygon and a typical paying stone appearance with single-layer adherent growth after confluence.The cells were strongly positive for CD31 factor and negative(P=0.1，andP<0.5) for lymphatic endothelial cell specific surface marker VEGFR-3 detected by immunofluorescence staining and flow cytometry respectively.In our study，a method of higher purity of rat lung microvascular endothelial cells cultureinvitrowas successfully established.

rats；pulmonary microvascular endothelial cells；isolation and cultivation in vitro；immune magnetic beads purification

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.024

2016-06-15

國家自然科學(xué)基金(31272144)

梁宏偉(1990-)，女，河北承德人，碩士生，主要從事中獸醫(yī)藥及疾病防控方面研究，E-mail: 1581926010@ qq. com

穆祥(1960-)，男，江蘇啟東人，教授，碩士，主要從事中獸醫(yī)藥及疾病防控研究

S852.21

A

0366-6964(2016)10-2143-08