宋敏艷，韋藝媛，2，Muhammad Zahoor Khan，王　新，俞　英*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室&畜禽育種國家工程實驗室，北京 100193；2.重慶市畜牧技術(shù)推廣總站，重慶 401121； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院，楊凌 712100)

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耐甲氧西林金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)牛乳腺上皮細胞炎癥反應(yīng)的分子標志物研究

宋敏艷1，韋藝媛1，2，Muhammad Zahoor Khan1，王新3，俞英1*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室&畜禽育種國家工程實驗室，北京 100193；2.重慶市畜牧技術(shù)推廣總站，重慶 401121； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院，楊凌 712100)

旨在獲得耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)誘導(dǎo)牛乳腺上皮細胞炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子標志物。本研究以牛乳腺上皮細胞系Mac-T為試驗材料，利用MRSA進行體外感染，通過與普通金葡菌感染組及未感染組進行比較，檢測隱性乳房炎候選基因TRAPPC9、JAK2及炎癥指示因子IL-6基因在MRSA感染不同時間點的基因表達量。結(jié)果顯示，與未感染的對照組相比，MRSA 菌株體外感染Mac-T細胞6 h時，TRAPPC9基因表達量顯著降低(P<0.05)；感染8 h時，JAK2基因表達量顯著降低(P<0.05)；金葡菌菌株感染Mac-T細胞6 h時，TRAPPC9與JAK2基因表達量均顯著降低(P<0.05)。與普通金葡菌相比，經(jīng)MRSA處理6和10 h時，Mac-T細胞的TRAPPC9、JAK2及IL-6基因表達量均較高，且感染6 h時，MRSA處理組TRAPPC9基因表達量顯著高于金葡菌處理組(P<0.05)。結(jié)果表明，MRSA及金葡菌感染Mac-T細胞后，3個基因表達變化規(guī)律基本相似，MRSA菌株感染更不易引起宿主細胞JAK2基因表達量的變化，而TRAPPC9基因則可作為MRSA金葡菌及普通金葡菌感染的首選分子標志物。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；奶牛隱性乳房炎；乳腺上皮細胞；TRAPPC9；JAK2

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)亦稱“超級細菌”，于1961年首次報道，是一種重要的醫(yī)院及社區(qū)感染病原菌，也是家畜臨床病例經(jīng)常分離到的致病菌。由于其具有多重耐藥性和極易造成暴發(fā)流行病等特征，已成為目前人類臨床抗感染治療的一大難題，也是危害最嚴重的一類人畜共患菌[1-3]。

奶牛乳房炎是奶牛乳腺在受到蚊蟲叮咬、物理刺激、病原微生物等環(huán)境刺激時，產(chǎn)生的一系列不同程度的炎癥反應(yīng)[4]。根據(jù)臨床癥狀明顯與否，將其分為臨床乳房炎和隱性乳房炎，其中隱性乳房炎發(fā)病率最高(約占牛群的25%～68%)，造成奶牛場經(jīng)濟損失極為嚴重[5]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，簡稱金葡菌)是引起奶牛隱性乳房炎最主要的病原微生物之一，它不僅能逃逸宿主牛的天然防御系統(tǒng)，還能摧毀宿主的免疫系統(tǒng)[3，5-6]。由金葡菌尤其是MRSA金葡菌引起的奶牛乳房炎具有極強耐藥性，難以診治，一旦發(fā)現(xiàn)只能淘汰[3]。

奶牛群生產(chǎn)管理常用乳汁體細胞數(shù)(Somatic cell count，SCC)作為判斷隱性乳房炎的間接指標，每毫升乳汁SCC小于10萬為乳房健康牛，大于50萬為乳房炎陽性牛，20萬～50萬為隱性乳房炎牛[7]。本課題組X.Wang[8]，董易春[9]和T.Usman[10]等利用全基因組關(guān)聯(lián)分析及候選基因分析等方法發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)運蛋白顆粒復(fù)合體9基因(Trafficking protein particle complex 9，TRAPPC9)和JAK-STAT(Janus kinase and signal transducer and activator of transcription)信號通路上的酪氨酸蛋白激酶2基因(Janus Kinase 2，JAK2)的單核苷酸突變(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)與中國荷斯坦牛的乳汁SCC及血清細胞因子顯著關(guān)聯(lián)，提示兩個基因可作為抗奶牛隱性乳房炎的關(guān)鍵候選基因。TRAPPC9基因位于奶牛14號染色體上，編碼轉(zhuǎn)運蛋白NIBP(NIK and IKKβ-binding protein)，對炎癥信號通路NF-κB(Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)的激活具有調(diào)控作用[11-12]。JAK2基因編碼胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶，通過激活JAK-STAT信號傳導(dǎo)途徑提高機體對細胞因子的敏感度，在炎性疾病治療中具有重要作用[13]。此外，白介素6(Interleukin-6，IL-6)在免疫細胞的成熟、活化、增殖和免疫調(diào)節(jié)等一系列過程中發(fā)揮重要作用，并參與機體的多種生理及病理反應(yīng)，與許多慢性炎癥性疾病密切相關(guān)。研究表明，IL-6濃度與炎癥反應(yīng)程度呈正相關(guān)，可作為判斷炎癥反應(yīng)的靈敏指標[14-15]。

為確定MRSA體外感染牛乳腺上皮細胞的最佳感染時間及關(guān)鍵分子標志物，本研究利用從新鮮牛奶中分離純化的MRSA菌株體外感染牛乳腺上皮細胞系(Mac-T細胞)，并與普通金葡菌感染及無感染的Mac-T細胞進行對比，檢測并比較了隱性乳房炎關(guān)鍵候選基因TRAPPC9、JAK2及促炎因子基因IL-6在Mac-T細胞不同處理組及不同作用時間點的表達變化規(guī)律，進一步為奶牛MRSA金葡菌乳房炎的及早診斷及分子抗病育種提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1細胞系與菌株

所用細胞為牛乳腺上皮細胞系(Mac-T)，由浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所惠贈。該細胞系是一種具有正常乳腺上皮細胞形態(tài)與特征的永生化細胞系，可穩(wěn)定傳代、無外源微生物污染、貼壁生長。

所用菌株為本課題組前期從荷斯坦牛新鮮乳汁中分離、純化所得。其中一株為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，含特異性耐藥基因MecA；另一株為普通金葡菌，含金葡菌特異基因Nuc。

1.2Mac-T細胞培養(yǎng)

復(fù)蘇凍存的Mac-T細胞，于37 ℃，5% CO2條件下用完全培養(yǎng)液(DMEM+10% FBS+1%雙抗)培養(yǎng)。待細胞生長至80%匯合時，吸棄培養(yǎng)液，用無菌PBS清洗細胞兩次；加入0.25% Trypsin-EDTA消化液，37 ℃，5% CO2條件下消化3～5 min，普通光學(xué)倒置顯微鏡下觀察，待細胞變圓脫落時加入培養(yǎng)液終止消化，收集的細胞于1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入PBS進行清洗，反復(fù)吹打混勻細胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入完全培養(yǎng)液混勻細胞，將收集的細胞按1∶2的比例接種于新培養(yǎng)皿中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1 d換液1次，待細胞長至80%匯集時傳代培養(yǎng)。

1.3菌株鑒定

使用細菌基因組DNA純化試劑盒(Promega，Cat.A1120)提取菌株DNA，作為PCR反應(yīng)模板。分別根據(jù)MRSA及金葡菌的特異基因MecA、Nuc序列進行特異性PCR擴增(引物信息見表1)，PCR擴增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增條帶，進而用PCR產(chǎn)物直接測序法鑒定菌株類型。

細菌特異性PCR反應(yīng)體系：模板3 μL，Premix 12.5 μL，正向引物(10 μmol)1 μL，反向引物(10 μmol)1 μL，ddH2O 7.5 μL，采用熱蓋反應(yīng)進行PCR反應(yīng)，具體條件：MRSA特異基因MecA：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s；72 ℃延伸7 mim；4 ℃保存，變性到第一次延伸循環(huán)35次。金葡菌特異基因Nuc：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸7 mim；4 ℃保存，變性到第一次延伸循環(huán)35次。

1.4細菌懸液制備

將凍存的菌株從-80 ℃冰柜取出，室溫溶解，接種到TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r·min-1震蕩培養(yǎng)18～24 h。使用稀釋平板計數(shù)法，取100 μL稀釋后的菌液均勻涂布于新鮮的PCA固體培養(yǎng)基中，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后計數(shù)平板上的菌落。將收集到的細菌沉淀重懸于DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，調(diào)整菌株濃度為1×108cfu·mL-1，4 ℃短暫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5菌株感染試驗

傳代培養(yǎng)3代的Mac-T細胞于37 ℃，5% CO2條件下細胞生長到80%匯合時，棄掉培養(yǎng)液，用無菌PBS洗2遍，添加DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，然后用濃度為1×108cfu·mL-1的MRSA菌株和金葡菌菌株懸液，以MOI=10∶1的比例分別侵染細胞3、6、8、10 h；陰性對照組細胞用無菌DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)；每組3個重復(fù)。感染之后的細胞用無菌PBS洗3遍，加入1 mL Trizol將細胞從瓶壁上裂解下來，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6細胞總RNA提取及基因表達量檢測

使用Trizol法抽提處理后細胞的總RNA，利用NANODROP2000紫外分光光度計與凝膠電泳檢測總RNA濃度及提取質(zhì)量，用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，再通過熒光定量RT-PCR檢測菌株不同處理時間后TRAPPC9、JAK2及IL6基因的mRNA表達量，各基因引物見表1。以內(nèi)參基因GAPDH對目的基因表達量進行標準化，并利用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量，用t-檢驗比較感染組與對照組間的基因表達差異。

2　結(jié)　果

2.1普通金葡菌菌株與MRSA菌株特異性分子鑒定

Nuc基因與MecA基因分別是金葡菌菌株和MRSA菌株的特異性基因。特異性PCR鑒定結(jié)果顯示，從荷斯坦牛乳汁中分離純化的菌株，分別擴增到特定片段大小的單一目的條帶(Nuc及MecA基因擴增片段分別為279和310 bp，圖1)。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果也表明，兩條擴增產(chǎn)物分別為Nuc與MecA基因，確定了本研究使用的兩株菌株分別為金葡菌菌株(圖1A)及MRSA菌株(圖1B)。2.2Mac-T細胞培養(yǎng)狀態(tài)

復(fù)蘇后培養(yǎng)的牛乳腺上皮細胞(Mac-T)呈典型的上皮細胞形態(tài)：培養(yǎng)至24 h，可見許多分散生長的鵝卵石樣的單個細胞(圖2A)；培養(yǎng)至36 h時，這些鵝卵石樣細胞開始聚集生長(圖2B)；繼續(xù)培養(yǎng)至48 h時，細胞在瓶底已達80%匯集，細胞呈均勻的多角形和鵝卵石樣混合生長(圖2C)；此時的Mac-T細胞再培養(yǎng)兩代即可用于后續(xù)感染試驗。

表1PCR擴增基因引物信息

Table 1The information of gene primer by PCR

基因Gene序列(5'-3')Sequence產(chǎn)物長度/bpProduct退火溫度/℃Tm文獻ReferenceNucF:GCGATTGATGGTGATACGGTTR:AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC27959[16]MecAF:GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAAR:CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA31058[16]TRAPPC9F:CTGCTCCGCTCGGTGAATGACR:GCTTTACCGCCAGTTCCACCA10460[9]JAK2F:TGAAGACCGAGACCCTACACR:CTGCAAGGATTTAAGGATTTC21260[10]IL-6F:GAACGAGTATGAGGGAAATCR:TCTCAAGGTTTCTCAGGATG13860GAPDHF:GGCGTGAACCACGAGAAGTATAAR:CCCTCCACGATGCCAAAGT11960[10]

A：1.DNA相對分子質(zhì)量標準；2.Nuc基因特異PCR產(chǎn)物；B：1.DNA相對分子質(zhì)量標準；2.MecA基因特異PCR產(chǎn)物A：1.DL600 DNA marker；2.The specific PCR product of Nuc gene；B：1.DL600 DNA marker；2.The specific PCR product of MecA gene圖1　特異性PCR鑒定Nuc與MecA基因Fig.1　The identification of Nuc and MecA genes by specific PCR

2.3菌株感染不同時間點牛TRAPPC9、JAK2及IL-6基因表達變化規(guī)律

為確定MRSA感染牛乳腺上皮細胞Mac-T后候選基因的表達變化規(guī)律，針對感染時間為3、6、8 以及10 h的MRSA處理組和金葡菌處理組Mac-T細胞，與無感染的對照組細胞進行對比，進行隱性乳房炎抗性候選基因TRAPPC9、JAK2及促炎因子基因IL-6的實時熒光定量RT-PCR(圖3)。

針對TRAPPC9基因，比較MRSA菌株感染組與陰性對照組發(fā)現(xiàn)，其表達量在感染組細胞中隨感染時間的延長呈下降趨勢。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果表明，與對照組相比，MRSA感染6 與10 h時TRAPPC9表達量顯著下降(P<0.05，圖3A)。對于JAK2基因，也發(fā)現(xiàn)其表達量隨MRSA感染時間而下降，其中感染8與10 h時基因表達量顯著低于對照組(P<0.05，圖3B)。

金葡菌菌株感染與MRSA菌株感染結(jié)果相似，感染組Mac-T細胞的TRAPPC9、JAK2基因表達量均低于對照組，且當感染6、8 和10 h時，TRAP-PC9基因表達量極顯著低于對照組(P<0.01，圖3A)；當感染6 和10 h時，JAK2基因表達量顯著低于對照組(P<0.05，圖3B)。與對照組相比，無論MRSA菌株感染組還是金葡菌菌株感染組，IL-6基因表達量均差異不顯著，但可看出感染6 h時表達量較大(圖3C)。

結(jié)果表明，MRSA菌株感染Mac-T細胞后，TRAPPC9與JAK2基因表達量均低于對照組，僅發(fā)現(xiàn)IL-6基因表達量略高于對照組，但差異不顯著。金葡菌菌株感染后基因表達變化規(guī)律與MRSA相似。

2.4MRSA與普通金葡菌菌株感染Mac-T細胞的基因表達差異

為進一步確定MRSA菌株與金葡菌菌株感染細胞后的差異，將MRSA菌株與金葡菌菌株在6、8和10 h 3個具有顯著性差異時間點的基因表達量進行比較(圖4)。從圖中可以看出，除了8 h時JAK2基因表達量在金葡菌處理組高于MRSA處理組，其余情況下3個基因的表達量均是MRSA處理組高于金葡菌處理組，且感染6 h時TRAPPC9基因表達量在兩組間存在顯著差異(P<0.05，圖4A)。結(jié)合基因表達變化規(guī)律，即兩株菌感染后TRAPPC9與JAK2基因表達量均低于未感染的對照組，提示MRSA感染后可能更不易被宿主細胞發(fā)現(xiàn)。

A.分散生長的鵝卵石狀Mac-T細胞；B.聚集生長的鵝卵石狀Mac-T細胞；C.多角形和鵝卵石狀混合生長的Mac-T細胞A.The scattering growth of paving stone like Mac-T cells；B.The congregating growth of paving stone like Mac-T cells；C.The mixing growth of paving stone like and polygonous Mac-T cells圖2　牛乳腺上皮細胞系Mac-T細胞形態(tài) 100×Fig.2　The morphology of bovine mammary epithelial cell lines (Mac-T cell) 100×

*.P<0.05；**.P<0.01圖3　TRAPPC9、JAK2及IL-6基因在MRSA感染與金葡菌Mac-T細胞不同時間點的表達量Fig.3　The expression levels of TRAPPC9，JAK2 and IL-6 genes at different time points in Mac-T cells post-infected by MRSA and S.aureus

*.P<0.05圖4　TRAPPC9、JAK2及IL-6基因在MRSA與金葡菌感染Mac-T細胞6(A)、8(B)和10 h(C)的表達量Fig.4　The expressions of TRAPPC9，JAK2 and IL-6 genes at 6 (A)，8 (B) and 10 h(C) in Mac-T cells post-infected by MRSA and S.aureus

3　討　論

奶牛乳腺上皮細胞既是泌乳細胞，又是重要的免疫調(diào)節(jié)和免疫效應(yīng)細胞，在乳腺防御病原微生物感染中發(fā)揮重要作用[17]。本研究針對“超級菌”耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染引起的奶牛乳腺上皮細胞(Mac-T)炎癥反應(yīng)，通過與普通金葡菌感染的Mac-T細胞進行平行對比，檢測并分析了課題組前期在中國荷斯坦牛群發(fā)現(xiàn)的奶牛隱性乳房炎抗性候選基因TRAPPC9[8]、JAK2[10]以及炎癥指示因子IL-6[13]基因的表達情況，獲得了MRSA菌株體外感染牛乳腺上皮細胞的關(guān)鍵分子標志物。

MRSA及普通金葡菌引起的奶牛乳房炎通常為不易發(fā)現(xiàn)、不易診治的隱性乳房炎，尤其是MRSA菌因其較強耐藥性，即使在人類醫(yī)學(xué)中也難以攻克其引起的院內(nèi)及社區(qū)感染[18]。據(jù)人們對中國北方地區(qū)6個省市9個奶牛場1 000余頭中國荷斯坦牛乳汁中的細菌分離、純化及分子鑒定發(fā)現(xiàn)，MRSA菌在其中一個牛場乳房炎牛中的檢出率達7.2%[19]，必須嚴加重視以防止其成為人畜交叉?zhèn)魅驹?。本研究利用其中一株MRSA 菌株體外感染Mac-T細胞，當感染6 h時，隱性乳房炎候選基因TRAPPC9表達量顯著降低(P<0.05)；感染8 h時，JAK2基因表達量顯著降低(P<0.05)，說明MRSA感染Mac-T細胞所引起的基因表達差異存在感染時間點的不同。此外，本研究用一株普通金葡菌感染Mac-T細胞，與MRSA感染不同的是，感染6 h時即引起JAK2表達量顯著降低(P<0.05)，提示MRSA菌感染更不易引起宿主細胞JAK2基因表達量的變化。

值得注意的是，TRAPPC9基因表達量在MRSA及金葡菌菌株感染6 h均呈現(xiàn)顯著降低(P<0.05)，提示該基因針對兩種菌株感染的反應(yīng)均較為及時且明顯。TRAPPC9基因位于奶牛14號染色體上，編碼轉(zhuǎn)運蛋白顆粒復(fù)合體9蛋白(NIBP)，即NIK及IKKβ結(jié)合蛋白，NIBP對NF-κB信號通路的激活具有調(diào)控作用[20]。NF-κB信號通路最早于1986年提出，其在乳房炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用[21]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，TRAPPC9基因不僅是荷斯坦牛隱性乳房炎的重要候選基因[8]，且在金葡菌陽性牛外周血中的表達量也顯著低于健康牛[22]。中國北方地區(qū)荷斯坦牛金葡菌感染率較高，所檢測牛群金葡菌感染率達11.7%，其中臨床乳房炎牛為10.8%，生產(chǎn)群泌乳牛更高為12.4%，須嚴加防范[19]。本研究檢測到的TRAPPC9基因無論在奶牛乳腺上皮細胞，還是外周血中均呈現(xiàn)顯著的基因表達量變化[22]，可作為MRSA及金葡菌感染奶牛的關(guān)鍵分子標志物加以推廣應(yīng)用。

MRSA金葡菌及普通金葡菌具有免疫抑制及逃逸宿主免疫的特性，即抑制宿主免疫相關(guān)基因的表達或逃逸免疫細胞的識別，使宿主不能及時應(yīng)對和抵抗菌體的感染[6，23]。研究發(fā)現(xiàn)，約40%的金葡菌感染隱性乳房炎奶牛其乳汁體細胞數(shù)低于20 萬·mL-1[24]，而小于20萬·mL-1的體細胞數(shù)是目前廣泛采用的健康牛標準[7]。本研究結(jié)果顯示，MRSA菌株與普通金葡菌菌株感染Mac-T細胞6、8 及10 h后，TRAPPC9與JAK2基因表達量均明顯低于對照組，提示TRAPPC9和JAK2可能與兩株菌誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細胞的炎癥反應(yīng)有關(guān)。但牛乳腺上皮細胞炎性反應(yīng)受到MRSA菌株與普通金葡菌感染抑制的分子機理，除本研究的TRAPPC9、JAK2、IL-6基因外，還需對更多炎癥相關(guān)基因的表達變化規(guī)律進行研究。

IL-6在免疫細胞的成熟、活化、增殖和免疫調(diào)節(jié)等一系列過程中均發(fā)揮重要作用，其中血液中IL-6濃度與患者炎癥反應(yīng)的程度呈正相關(guān)，可作為判斷病情嚴重程度的靈敏指標[14-15]。然而在本研究中，未發(fā)現(xiàn)IL-6基因表達量與金葡菌感染有直接聯(lián)系(圖3C)。盡管當MRSA及普通金葡菌感染Mac-T細胞6 h時，IL-6基因表達量呈現(xiàn)升高趨勢(未達統(tǒng)計學(xué)顯著，P>0.05)，但當感染8 h后，其表達量降低并與未感染細胞相近。究其原因，可能是IL-6主要由活化的單核/巨噬細胞產(chǎn)生，奶牛乳腺上皮細胞中的IL-6針對MRSA及金葡菌感染反應(yīng)不敏感，不宜作為兩種菌感染奶牛乳腺上皮細胞的分子標志物。

綜上，本研究利用體外MRSA型金葡菌與普通金葡菌感染的牛乳腺上皮細胞模型，通過比較不同感染時間，獲得TRAPPC9、JAK2和IL-6基因的表達變化規(guī)律，并從基因表達水平確定了MRSA菌感染牛乳腺上皮細胞的首選分子標志物是TRAPPC9基因，其次是JAK2基因。有關(guān)奶牛乳腺上皮細胞及免疫細胞先天性抵抗MRSA菌感染的分子機制，還有待針對兩個基因進行深入的功能驗證。

[1]BARBER M.Methicillin-resistantStaphylococci[J].JClinPathol，1961，14：385-393.

[2]FRANCIS J S，DOHERTY M C，LOPATIN U，et al.Severe community-onset pneumonia in healthy adults caused by methicillin-resistantStaphylococcusaureuscarrying the Panton-Valentine leukocidin genes[J].ClinInfectDis，2005，40(1)：100-107.

[3]FERNANDES DOS SANTOS F，MENDONCA L C，REIS D R，et al.Presence of mecA-positive multidrug-resistantStaphylococcusepidermidisin bovine milk samples in Brazil[J].JDairySci，2015，99(2)：1374-1382.

[4]GUNAWARDANA S，THILAKARATHNE D，ABEGUNAWARDANA I S，et al.Risk factors for bovine mastitis in the Central Province of Sri Lanka[J].TropAnimHealthProd，2014，46(7)：1105-1112.

[5]WANG X，WANG X，WANG Y，et al.Antimicrobial resistance and toxin gene profiles ofStaphylococcusaureusstrains from Holstein milk[J].LettApplMicrobiol，2014，58(6)：527-534.

[6]VILASACK T，DOMINIQUE M，OLAF S.Staphylococcusaureusdegrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death[J].Science，2013，342(6160)：863-866.

[7]馬裴裴，俞英，張沅，等.中國荷斯坦牛SCC變化規(guī)律及其與產(chǎn)奶性狀之間的關(guān)系[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2010，41(12)：1529-1535.

MA P P，YU Y，ZHANG Y，et al.The distribution of SCC and its correlation with milk production traits in Chinese Holsteins[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2010，41(12)：1529-1535.(in Chinese)

[8]WANG X，MA P P，LIU J F，et al.Genome-wide association study in Chinese Holstein cows reveal two candidate genes for somatic cell score as an indicator for mastitis susceptibility[J].BMCGenet，2015，16(111)：1-9.

[9]董易春，劉超，王曉，等.基于GWAS后分析策略研究TRAPPC9基因?qū)δ膛．a(chǎn)奶性狀的遺傳效應(yīng)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2015，46(1)：60-68.

DONG Y C，LIU C，WANG X，et al.Confirmaing the genetic effects of bovineTRAPPC9 on milk production traits based on post-GWAS strategies[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2015，46(1)：60-68.(in Chinese)

[10]USMAN T，YU Y，LIU C，et al.Genetic effects of single nucleotide polymorphisms in JAK2 and STAT5A genes on susceptibility of Chinese Holsteins to mastitis[J].MolBiolRep，2014，41(12)：8293-8301.

[11]HU W H，PENDERGAST J S，MO X M，et al.NIBP，a novel NIK and IKKβ-binding protein that enhances NF-κB activation[J].JGenVirol，2005，280(32)：29233-29241.

[12]KARIN M，GRETEN F R.NF-kappaB：linking inflammation and immunity to cancer development and progression[J].NatRevImmunol，2005，5(10)：749-759.

[13]JAMES C，UGO V，CASADEVALL N，et al.A JAK2 mutation in myeloproliferative disorders：Pathogenesis and therapeutic and scientific prospects[J].TrendsMolMed，2005，11(12)：546-554.

[14]YUDKIN J S，KUMARI M，HUMPHFIES S E，et al.Inflammation，obesity，stress and coronary heart disease：is interleukin-6 the link?[J].Atherosclerosis，2000，148(2)：209-214.

[15]ROBERTO P F，LINDHOLM B，AXELSSON J，et al.Update on interleukin 6 and its role in chronic renal failure[J].NephrolDialTransplant，2003，18(6)：1042-1045.

[16]ZHANG K，SPARLING J，CHOW B L，et al.New quadriplex PCR assay for detection of methicillin and mupirocin resistance and simultaneous discrimination ofStaphylococcusaureusfrom coagulase-negative staphylococci[J].JClinMicrobiol，2004，42(11)：4947-4955.

[17]FOURNIER B，PHILPOTT D J.Recognition ofStaphylococcusaureusby the innate immune system[J].ClinMicrobiolRev，2005，18(3)：521-540.

[18]KATAYAMA Y，ITO T，HIRAMATSU K.A new class of genetic element，Staphylococcus cassette chromosome mec，encodes methicillin resistance inStaphylococcusaureus[J].AntimicrobAgentsChemother，2000，44(6)：1549-1555.

[19]王曉，俞英.中國北方奶牛金葡菌乳房炎感染現(xiàn)狀及耐藥性和流行類型研究進展[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2015，46(9)：1477-1488.

WANG X，YU Y.Infectious status of mastitis in dairy cattle induced byStaphylococcusaureusand its advances on epidemiological patterns and antimicrobial resistance in Northern China[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2015，46(9)：1477-1488.(in Chinese)

[20]SACHER M，KIM Y G，LAVIE A，et al.The TRAPP complex：insights into its architecture and function[J].Traffic，2008，9(12)：2032-2042.

[21]王曉鑠，俞英.表觀遺傳對炎癥的調(diào)控機制及其在奶牛乳房炎抗病育種中的應(yīng)用前景[J].遺傳，2010，32(7)：663-669.

WANG X S，YU Y.Regulation mechanisms of epigenetics on inflammation and its perspective on breeding for mastitis resistance in dairy cattle[J].Hereditas(Beijing)，2010，32(7)：663-669.(in Chinese)

[22]馮文，董易春，王曉，等.TRAPPC9基因?qū)δ膛＝鹌暇榉垦卓剐孕誀畹倪z傳效應(yīng)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2016，47(2)：276-283.

FENG W，DONG Y C，WANG X，et al.The genetic effect ofTRAPPC9 on mastitis resistance toS.aureusin Dairy cows[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2016，47(2)：276-283.(in Chinese)

[23]ROGHMANN M，TAYLOR K L，GUPTE A，et al.Epidemiology of capsular and surface polysaccharide in Staphylococcus aureus infections complicated by bacteraemia[J].JHospInfect，2005，59(1)：27-32.

[24]JONES G M，PEARSON R E，CLABAUGH G A，et al.Relationships between somatic cell counts and milk production[J].JDairySci， 1984，67(8)：1823-1831.

(編輯郭云雁)

Molecular Marker Study of Inflammatory Reaction in Bovine Mammary Epithelium Cell Line Induced by Methicillin-ResistantStaphylococcusaureus

SONG Min-yan1，WEI Yi-yuan1，2，Muhammad Zahoor Khan1，WANG Xin3，YU Ying1*

(1.KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproduction，MinistryofAgriculture&NationalEngineeringLaboratoryforAnimalBreeding，CollegeofAnimalScienceandTechnology，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China；2.ChongqingAnimalHusbandryTechniquesExtensionCenter，Chongqing401121，China；3.CollegeofFoodScienceandEngineering，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

The aim of this study was to acquire key molecular marker related to inflammatory reaction of bovine mammary epithelium cells induced by Methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA).In this study，bovine mammary epithelium cell line (Mac-T) was infected with MRSAinvitroby compared with the cells treated byS.aureusas well the untreated cells.The expression levels of two candidate genes associated with subclinical mastitis ((trafficking protein particle complex 9(TRAPPC9)，Janus Kinase 2(JAK2)) and one pro-inflammatory gene (interleukin 6，IL-6) were detected and compared among infected groups and non-infected group at different time points.Comparing with the untreated cells，the results showed that the mRNA expression level ofTRAPPC9 significantly decreased (P<0.05) in the Mac-T cells at 6 h post stimulation by MRSA，while that ofJAK2 significantly decreased (P<0.05) at 8 h；And the expression levels ofTRAPPC9 andJAK2 in the cells significantly decreased (P<0.05) at 6 h post infection byS.aureus.Compared withS.aureusstimuli，the expression levels ofTRAPPC9，JAK2 andIL-6 in the Mac-T cells were moderately higher at 6 and 10 h post infection by MRSA.Especially，the expression level ofTRAPPC9 was significantly higher in MRSA treated cells (P<0.05) compared toS.aureustreated cells at 6 h post infection.These results suggest that the genes expression changes in the Mac-T cells were similar after the infection of MRSA andS.aureus，while the gene expression changes ofJAK2 in the cells was delayed from MRSA infection compared toS.aureus.TRAPPC9 can be used as the preferred molecular marker for detecting MRSA andS.aureusinfection in bovine mammary epithelium cells.

Methicillin-resistantStaphylococcusaureus；bovine subclinical mastitis；mammary epithelium cell lines；TRAPPC9；JAK2

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.007

2016-01-07

國家自然科學(xué)基金(31272420)；國家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項資金(CARS-37-04B)；“十二五”國家科技支撐項目(2011BAD28B02)；教育部基本科研項目(2011JS006；Z109021306)；長江學(xué)者與創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃(IRT1191)

宋敏艷(1986-)，女，陜西咸陽人，博士生，主要從事奶牛表觀遺傳調(diào)控與抗病機理研究，E-mail：songminyanjiandan@163.com

俞英，博士生導(dǎo)師，主要從事動物健康性狀改良及表觀遺傳調(diào)控機制研究，E-mail：yuying@cau.edu.cn

S823;S813.3

A

0366-6964(2016)10-1995-08