周龍書黃嬋史文靜

子宮內(nèi)膜腺癌組織中Vasohibin-1與MVD的表達(dá)及其相關(guān)關(guān)系的研究*

周龍書①黃嬋①史文靜①

目的：探討血管生成抑制蛋白-1（Vasohibin-1）、微血管密度（micro vessel density，MVD）在子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達(dá)及兩者之間的相關(guān)關(guān)系。方法：應(yīng)用SP法檢測Vasohibin-1在23例正常子宮內(nèi)膜組織、28例子宮內(nèi)膜非典型增生組織及69例子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達(dá)情況；并應(yīng)用CD34抗體標(biāo)記上述組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞，測定MVD值，分析兩者在子宮內(nèi)膜腺癌的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果：Vasohibin-1在子宮內(nèi)膜腺癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于子宮內(nèi)膜不典型增生組織與正常增殖期子宮內(nèi)膜組織（P＜0.05）。子宮內(nèi)膜腺癌組織中MVD測定值顯著高于子宮內(nèi)膜不典型增生與正常增殖期子宮內(nèi)膜（P＜0.01）。Vaoshibin-1在子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達(dá)與手術(shù)病理分期、肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在子宮內(nèi)膜腺癌組織中，Vasohibin-1的表達(dá)與MVD值呈正相關(guān)（r=0.337，P＜0.05）。結(jié)論：在子宮內(nèi)膜腺癌中存在Vasohibin-1、MVD的高表達(dá)，且兩者在子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起協(xié)同作用。

子宮內(nèi)膜腺癌； 血管生成抑制蛋白-1； 微血管密度

First-author's address：The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China

子宮內(nèi)膜腺癌今年的發(fā)病率呈上升趨勢，但其發(fā)病機(jī)制目前尚不十分明確。血管生成抑制因子（Vasohibin）由Watanabe等［1］和Soslow等［2］首次發(fā)現(xiàn)，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)血管生成負(fù)反饋抑制因子，成為腫瘤血管生成機(jī)制研究的新熱點(diǎn)。本研究通過檢測增殖期子宮內(nèi)膜、非典型增生子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜腺癌組織中Vasohibin-1和MVD的表達(dá)情況，探討兩者的相關(guān)關(guān)系和在子宮內(nèi)膜腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究收集2009年1月-2013年12月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的子宮內(nèi)膜腺癌石蠟包埋標(biāo)本69例為研究對象，年齡37～65歲，中位年齡51歲，術(shù)前均未經(jīng)任何放、化療和激素治療等。按2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）的分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期33例，Ⅱ期24例，Ⅲ期10例，Ⅳ期2例；按有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況分為：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例；按腫瘤細(xì)胞分化級別分為G1、G2、G3級，每級分別為23、29、17例；按腫瘤浸潤情況分為：無肌層浸潤10例，浸潤淺肌層（＜1/2為37例，深肌層或漿膜浸潤（≥1/2）22例。隨機(jī)抽取同期存檔的子宮內(nèi)膜非典型增生組織蠟塊28例及因子宮肌瘤、宮頸原位癌切除子宮的增殖期子宮內(nèi)膜組織蠟塊23例作為對照。年齡32～58歲，中位年齡45歲。以上標(biāo)本切片均由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科提供，并由兩位高年資病理醫(yī)師確診。

1.2 試劑 主要試劑：Vasohibin-1兔抗人多克隆IgG抗體，產(chǎn)品編號：bs-1505R（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），CD34兔抗人多克隆IgG抗體，產(chǎn)品編號：BA0912（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），即用型免疫組化UltrasensitiveTMS-P超敏試劑盒（北京中杉會橋生物技術(shù)有限公司），3，3-二氨基聯(lián)苯胺（3，3-diaminobenzidine，DAB）濃縮型試劑盒：ZLI-9032（北京中杉會橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) Vasohibin-1陽性表達(dá)為細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。子宮內(nèi)膜腺癌組織中Vasohibin-1、VEGF陽性結(jié)果均主要表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)。在雙盲條件下，由兩名病理科醫(yī)師對切片進(jìn)行觀察，每張切片均隨機(jī)選5個(gè)高倍視野（×400倍），200個(gè)細(xì)胞/視野，共計(jì)1000個(gè)細(xì)胞，取其平均數(shù)。根據(jù)目前廣泛應(yīng)用的免疫組化計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)，具體如下：（1）染色強(qiáng)度（staining intensity，SI）：無色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分（染色深淺需與背景著色相對比）。（2）陽性細(xì)胞數(shù)（positive percentage，PP）：陰性0分，陽性細(xì)胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，＞80%為4分［3-4］。半定量積分=染色強(qiáng)度評分×陽性細(xì)胞數(shù)評分。

1.3.2 陰陽性劃分 采用半定量積分對各子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行陰陽性劃分［5-6］。半定量積分0～1分為陰性（-），2～3分為免疫反應(yīng)結(jié)果弱陽性（+），4～6分為中等陽性（++），＞6分為強(qiáng)陽性（+++）。-～+為表達(dá)缺失、低表達(dá)；++～+++為過表達(dá)；+～+++均為陽性。結(jié)果由兩名高年資病理科醫(yī)師統(tǒng)一核準(zhǔn)。

1.3.3 MVD判定標(biāo)準(zhǔn) 由CD34標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞后，其定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿。MVD計(jì)數(shù)參照Maeda等［7-8］，采用雙盲法，由兩名病理科醫(yī)師分別進(jìn)行，再取平均值。先在低倍鏡（×100）下全面觀察整體切片，找出腫瘤內(nèi)血管最密集處，再在高倍鏡（×200）下計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取其平均值，但管腔大于8個(gè)紅細(xì)胞直徑的血管不計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行卡方檢驗(yàn)和Spearman等級相關(guān)分析，多組均數(shù)的比較采用Kruskal Wallis檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Vasohibin-1在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況比較 Vasohibin-1在正常增殖期與非典型增生的陽性表達(dá)率均明顯低于內(nèi)膜樣腺癌（P＜0.05）。正常增殖期與非典型增生陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同子宮內(nèi)膜組織中Vasohibin-1的表達(dá)情況

2.2 在不同子宮內(nèi)膜組織中的MVD計(jì)數(shù)情況比較 在正常增殖期子宮內(nèi)膜組織與非典型增生子宮內(nèi)膜組織中的陽性表達(dá)率均明顯低于子宮內(nèi)膜腺癌（P＜0.001）。正常增殖期子宮內(nèi)膜與非典型增生子宮內(nèi)膜的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同子宮內(nèi)膜組織中MVD計(jì)數(shù)情況（±s）

表2 不同子宮內(nèi)膜組織中MVD計(jì)數(shù)情況（±s）

*與正常增殖期子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜不典型增生比較，P＜0.05；#與子宮內(nèi)膜不典型增生和正常增殖期子宮內(nèi)膜比較，P＜0.001

組織類型MVD（個(gè)/HP）P值正常增殖期（n=23）10.32±5.48不典型增生（n=28）17.44±3.59＜0.05*子宮內(nèi)膜腺癌（n=69）33.63±10.51＜0.001#

2.3 不同子宮內(nèi)膜組織中Vasohibin-1的表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理特征的關(guān)系 Vasohibin-1與子宮內(nèi)膜癌患者年齡、手術(shù)病理分期、肌層浸潤及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P＞0.05），見表3。

2.4 子宮內(nèi)膜腺癌中Vasohibin-1表達(dá)與MVD的相關(guān)關(guān)系 子宮內(nèi)膜腺癌組織中Vasohibin-1表達(dá)陽性者37例，MVD計(jì)數(shù)為（32.89±1.06）個(gè)/HP；陰性者32例，MVD計(jì)數(shù)為（28.83±0.89）個(gè)/HP，提示子宮內(nèi)膜癌中Vasohibin-1與MVD的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.337，P＜0.05）。

表3 Vasohibin-1與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

3.1 血管生成抑制蛋白-1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義 人血管生成抑制蛋白-1（Vasohibin-1）基因位于染色體14q24.3上，其蛋白產(chǎn)物有365個(gè)氨基酸殘基，是一個(gè)非傳統(tǒng)型分泌蛋白［9-10］。有研究表明，Vasohibin-1在體外能有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的移行、增殖及網(wǎng)絡(luò)形成，體內(nèi)能有效抑制腫瘤的新生血管形成，從而抑制腫瘤的生長［11-12］。李姝君等［13］報(bào)道Vasohibin-1的檢出率從增生期到分泌期內(nèi)膜、從高分化至低分化子宮內(nèi)膜癌組織逐漸增高。而文獻(xiàn)［14-15］采用免疫組織化學(xué)法檢測Vasohibin-1在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)明顯低于正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)。

本研究結(jié)果表明：Vasohibin-1在正常增殖期子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜腺癌組織中的陽性表達(dá)率分別為26.1%、32.1%、53.6%，其中子宮內(nèi)膜腺癌組織中Vasohibin-1的表達(dá)率明顯高于子宮內(nèi)膜不典型增生及正常增殖期子宮內(nèi)膜，此結(jié)果與Yoshinaga等［6］研究結(jié)果相似?？紤]在子宮內(nèi)膜腺癌中，雖然Vasohibin-1的陽性表達(dá)率隨著腫瘤的惡性程度升高而逐漸增加，但是Vasohibin-1的表達(dá)上調(diào)并不足以抑制子宮內(nèi)膜腺癌的血管生成，其原因的深入探究尚需后續(xù)研究加以闡明。

3.2 微血管密度與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系 微血管密度（MVD）是一種反映腫瘤血管形成的指標(biāo)，隨著腫瘤MVD的增加，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等惡性潛能也明顯增加。因此，MVD被認(rèn)為是預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)標(biāo)［16-17］。文獻(xiàn)［18-19］的研究顯示在子宮內(nèi)膜癌組織中的MVD計(jì)數(shù)明顯高于子宮內(nèi)膜不典型增生及正常子宮內(nèi)膜對照組。本研究采用CD34單克隆抗體對子宮內(nèi)膜腺癌、子宮內(nèi)膜不典型增生及增殖期子宮內(nèi)膜各組織血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行特殊染色，然后測量各組織的MVD值分別為（33.63±10.51）、（17.44±3.59）、（10.32±5.48）個(gè)/HP。子宮內(nèi)膜腺癌組織的MVD值與后兩者比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明MVD的表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

3.3 Vasohibin-1、MVD在子宮內(nèi)膜腺癌中表達(dá)的相關(guān)關(guān)系 眾所周知，子宮內(nèi)膜癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是影響患者生存期的最主要因素，而高密度血管形成在腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的開始及結(jié)束階段都是必須的。Vasohibin-1作為血管生成抑制因子， 在體內(nèi)能有效抑制腫瘤的新生血管形成，從而抑制腫瘤的生長，MVD是衡量腫瘤血管生成常用的客觀定量指標(biāo)。在本研究中，子宮內(nèi)膜腺癌組織中Vasohibin-1的陽性表達(dá)率增高，MVD的表達(dá)也增強(qiáng)，且兩者間具有正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。由此考慮，一方面隨著腫瘤的進(jìn)展，機(jī)體需要反饋性地增加Vasohibin-1的表達(dá)來抑制新生血管生成，從而出現(xiàn)子宮內(nèi)膜腺癌組織中Vasohibin-1的高表達(dá)，但可能在某階段存在Vasohibin-1的表達(dá)上調(diào)并不足以抑制血管生成的情況；另一方面，正常子宮內(nèi)膜組織中，促血管生成因子和抑制血管生成因子之間存在著平衡，而子宮內(nèi)膜腺癌中上述兩者間出現(xiàn)了失衡狀態(tài)，從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌中血管異常增生［20］。

綜上所述，Vasohibin-1作為一種新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性血管生成負(fù)反饋調(diào)劑因子，在子宮內(nèi)膜腺癌中存在高表達(dá)，并可能與高表達(dá)的MVD在子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起協(xié)同作用。雖然上述機(jī)制有待進(jìn)一步闡明，但隨著研究的不斷深入，Vasohibin-1有望在抗腫瘤血管生成及婦科腫瘤治療中發(fā)揮重要的作用。

［1］ Watanabe K，Hasegawa Y，Yamashita H，et al.Vasohibin as an endothelium-derived negative feedback regulator of angiogenesis［J］.J Clin Invest，2004，114（7）：898-907.

［2］ Soslow R A，Dannenberg A J，Rush D，et al.Cox-2 is expressed in human pulmonary colonic and mammary tumors［J］.Cancer，2000，89（12）：2637-2645.

［3］ Maeda K，Chung Y S，Ogawa Y，et al.Prognostic vaiue of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma［J］.Cancer，1996，77（77）：858-863.

［4］仲肖靜，顏麗麗.子宮內(nèi)膜腺癌中MMP-2、MMP-9表達(dá)的免疫組化研究［J］.中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（9）：48-50.

［5］ Shinizu K，Watanabe K，Yamashita H，et al.Gene regulation of a novel angiogenesis inhibitor， vasohibin，in endothelial cell［J］. Biochem Biophys Res Conmun，2005，327（3）：700-706.

［6］ Yoshinaga K，Ito K，Moriya t，et al.Expression of vasohibin as a novel endothelium-derived angiogenesis inhibitor in endometrial cancer［J］. Cancer Sci，2008，99（5）：914-919.

［7］王珺，王欣彥，王敏.VEGF、HIF-1α、Vasohibin在子宮內(nèi)膜腺癌血管生成中的作用及與預(yù)后的關(guān)系［J］.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2010，19（1）：44-48.

［8］王珺，王欣彥，王敏.子宮內(nèi)膜腺癌組織vasohibin的異常表達(dá)及其生物學(xué)意義［J］.中化腫瘤防治雜志，2011，18（17）：1338-1341.

［9］ Vuletic M S，Jancic S A，Ilic M B，et al.Expression of vascular endothelial growth factor and microvascular density assessment in different histotypes of basal cell carcinoma［J］.J Buon，2014，19（3）： 780-786.

［10］ Erdem O，Erdem M，Erdem A，et al.Expression of vascular endothelial growth factor endoglin in proliferative endometrium，endometrium hyperplasia， and endometrial carcinoma［J］.Int J Gynecol Cancer，2007， 17（6）：1327-1332.

［11］王珺，劉政操，馬志紅，等.VEGF、HIF-1α、Vasohibin在子宮內(nèi)膜腺癌血管生成中的作用及與預(yù)后的關(guān)系［J］.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2010，19（1）：43-48.

［12］陳金龍，劉乃富.癌組織中EpCAM、CD44 v6的表達(dá)與早期低危子宮內(nèi)膜腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系［J］.山東醫(yī)藥，2015，7（43）：64-66.

［13］李姝君，沈湘，楊志雄，等.MMP2過表達(dá)在子宮內(nèi)膜腺癌的臨床意義［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，11（3）：423-425.

［14］郭瑞霞，范麗君，李艷敏，等.子宮內(nèi)膜腺癌組織中IGFBP-rP1基因的甲基化狀態(tài)及其 mR-NA、蛋白表達(dá)水平的檢測［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2015，21（6）：785-789.

［15］張曉勇，魏琳琳.腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因KAI1/CD82和整合素β1在子宮內(nèi)膜腺癌中表達(dá)及臨床意義［J］.中國老年學(xué)雜志，2015，23（13）：3534-3536.

［16］王麗君.人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系的建立［J］.山東醫(yī)藥，2010，50（26）：6-7.

［17］李李，周龍書，史文靜，等.Vasohibin-1、VEGF及HIF-1α在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)及意義［J］.河北醫(yī)藥，2016，36（5）：662-666.

［18］周龍書，李李，史文靜，等.Vasohibin-1、VEGF在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)及意義［J］.中國婦幼保健，2015，30（3）：350-352.

［19］李榮，吳裕中，吳強(qiáng)，等.Vasohibin-1重組腺病毒對人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖的影響［J］.腫瘤學(xué)雜志，2014，20（1）：1-5.

［20］王珺，王欣彥，王敏，等.子宮內(nèi)膜腺癌組織Vasohibin的異常表達(dá)及其生物學(xué)意義［J］.中華腫瘤防治雜志，2011，18（17）：1338-1341.

R esearch of E xpression and Its Correlation of V asohibin-1 and MV D in E ndometrial Adenocarcinoma Tissue

ZHOU L ong-shu，HUANG Chan，SHI Wen-jing.//Medical Innovation of China，2016，13（27）：006-009

Objective：To probe the expression of endometrial adenocarcinoma and the relationship between them in angiogenesis inhibitor protein-1（Vasohibin-1） and microvessel density（vessel density micro，MVD）.Method：The expression situation of Vasohibin-1 in 23 cases of normal endometrium，28 cases of atypical endometrial hyperplasia and 69 cases of endometrial adenocarcinoma were detected by SP method.CD34 antibody was used to label the vascular endothelial cells in the tissue，and MVD value was determined.Then，the correlation between endometrial adenocarcinoma between two objects were analyzed.Result：The positive expression rate of Vasohibin-1 in endometrial adenocarcinoma was significantly higher than that in endometrial atypical hyperplasia tissue and normal proliferative phase of endometrial tissue（P＜0.05）.The value of MVD in endometrial adenocarcinoma was significantly higher than that in the endometrial atypical hyperplasia and normal proliferative phase endometrium（P＜0.01）.There was no statistical significance in the expression of Vaoshibin-1 in endometrial adenocarcinoma and the surgical pathologic stage，muscle invasion，lymph node metastasis，age（P＞0.05）.There was positively correlated in the expression of Vasohibin-1 and the MVD values in the endometrial adenocarcinoma tissue（r=0.337，P＜0.05）.Conclusion：There is high expression of MVD and Vasohibin-1 in endometrial adenocarcinoma，and they may be played a synergistic role in the occurrence and development of endometrial adenocarcinoma.

Endometrial adenocarcinoma； Angiogenesis inhibitor protein-1； Microvessel density

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.27.002

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012B031800436）

①廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 廣東 廣州 510260

史文靜

（2016-06-27） （本文編輯：程旭然）