王耀光，曽又佳，周慧杰

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193，2.深圳市中醫(yī)院，深圳 5180333；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

LX-2與HK-2細胞共培養(yǎng)模型的建立及對其細胞轉(zhuǎn)分化的影響*

王耀光1，曽又佳2，周慧杰3

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193，2.深圳市中醫(yī)院，深圳 5180333；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

［目的］建立人肝星狀細胞（LX-2）與人腎小管上皮細胞（HK-2）共培養(yǎng)體系的理論模型，研究LX-2對HK-2轉(zhuǎn)分化的影響。［方法］以Transwell小室建立體外LX-2細胞和HK-2細胞間接共培養(yǎng)體系。應(yīng)用細胞免疫組織化學(xué)法檢測HK-2細胞平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達；用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測各組細胞培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）的含量；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR法）檢測HK-2細胞TβRⅠmRNA、TβRⅡmRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA、Smad7 mRNA的表達。［結(jié)果］除了空白組，形態(tài)學(xué)上其他兩組均可看到HK-2細胞胞漿染棕黃色，不同數(shù)量細胞由立方鋪路石樣轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮伍L條狀，細胞肥大；HK-2細胞高表達α-SMA（P＜0.01）；HK-2細胞上清液中TGF-β1含量明顯高于空白組（P＜0.01）；HK-2細胞TβRⅠ、Smad2、Smad3基因表達明顯上調(diào)，而TβRⅡ、Smad7基因表達明顯下調(diào)。［結(jié)論］Transwell共培養(yǎng)法可誘導(dǎo)HK-2細胞轉(zhuǎn)分化，其機制可能與TGF-β1/ Smad信號通路有關(guān)。

腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化；Transwell小室；LX-2細胞；HK-2細胞；細胞共培養(yǎng)

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2016.05.09

腎小管上皮細胞間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化（TEMT）是腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生和發(fā)展的重要機制［1］，多種生長因子、細胞因子和細胞外因素等可以通過不同的方式參與腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的調(diào)節(jié)［2-5］。在各種針對終末期腎臟病的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究中，以轉(zhuǎn)化生長因子β/Smad通路最為關(guān)注［6］，而且TEMT也主要與TGF-β/Smad有關(guān)［7］。一種器官纖維化發(fā)生機制的研究結(jié)果，可能也適用于其他器官纖維化［8-9］；對一種器官纖維化的有效治療方法，對阻止其他器官纖維化也可能是有益的［10］。基于臨床觀察的乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎患者同時存在肝、腎纖維化（硬化）的病理改變［11-12］和“肝腎同源”理論，提出“肝腎纖維化共同通路”假說，并建立人肝星狀細胞（LX-2）與人腎小管上皮細胞（HK-2）共培養(yǎng)體系的理論模型，模擬體內(nèi)內(nèi)分泌狀態(tài)，觀察LX-2對HK-2轉(zhuǎn)分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 LX-2，由上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所提供；HK-2，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細胞中心提供；DMEM/ F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；特級胎牛血清購自Hyclone公司；青鏈霉素（雙抗）購自Gibco公司；胰蛋白酶，乙二胺四乙酸（EDTA）購自美國Sigma公司；鼠抗人平滑肌肌動蛋白（α-SMA）免疫組化試劑盒為武漢博士德有限公司產(chǎn)品；氯化鉀（KCl）、氯化鈉（NaCl）、十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、碳酸氫鈉（NaHCO3）等無機試劑均為分析純（天津化學(xué)試劑廠）；磷酸鹽緩沖液（PBS）粉劑，購自天津厚普生物科技有限公司；重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）購自美國Peprotech公司；PCR擴增儀（480Kin-Elmer，Branchburg，NJ）；核酸蛋白分析儀：BECKMAN，DU530 DNA/RNA Protein Analyzer；ABI?7300實時熒光定量系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國）；Trnzol總RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 按照說明配制DMEM/F12培養(yǎng)液、D-hanks液、PBS緩沖液和消化液。用含10%胎牛血清及1%100 KU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素（雙抗）的DMEM/F12培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，接種密度：5×107個/L，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，隔天換液，細胞覆蓋75 cm2培養(yǎng)瓶瓶底壁80%底面積時按1∶3傳代。

1.2.2 Transwell小室建立 HK-2及LX-2長至覆蓋75 cm2培養(yǎng)瓶瓶底壁80%底面積時，倒出瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液，加入D-hanks液3 mL，輕輕搖動至流遍所有細胞表面，倒出，向瓶內(nèi)加入5 mL消化液（0.25%胰蛋白酶和0.04%EDTA等體積配制），輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細胞表面，倒置顯微鏡下觀察。細胞胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大時，予30 μL胎牛血清終止消化。用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)輕輕吹打瓶壁細胞，細胞脫壁后形成細胞懸液，吸出至50 mL離心管，離心800 r/min，5 min。去除上清，加入5 mL培養(yǎng)基，吹打混勻，計數(shù)。調(diào)整細胞密度為5×107個/L，HK-2以每孔1.2 mL細胞懸液量均勻接種于Transwell12孔板下層，同時將LX-2以每孔1 mL細胞懸液量均勻接種在Transwell小室中，空白組則用等密度接種HK-2細胞。培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，共同培養(yǎng)48 h，取下層細胞進行實驗。

1.2.3 實驗分組 Transwell小室 LX-2細胞與HK-2細胞共培養(yǎng)組；空白對照組：HK-2細胞正常換液；陽性對照組：10μg/L重組人TGF-β1刺激HK-2。

1.2.4 HK-2細胞形態(tài)改變 倒置顯微鏡下觀察HK-2細胞形態(tài)改變。

1.2.5 免疫細胞化學(xué) 檢測HK-2細胞α-SMA蛋白的表達。采用SABC法：PBS洗滌5 min×2次；4%多聚甲醛固定20 min；PBS振洗3 min×5次；含1% H2O2的PBS室溫下浸泡30min；PBS洗滌3min×3次；滴加5%BSA封閉液，室溫20 min；甩去多余液體；滴加一抗，陰性對照片用PBS代替，4℃過夜；PBS洗滌3 min×3次；滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室溫下30 min；PBS洗滌2 min×3次；滴加試劑SABC，室溫30 min，PBS洗5 min×4次；DAB顯色：現(xiàn)配H2O 1 mL+A/B/C各1滴，混勻。室溫顯色：2～5 min，鏡下控制。沖洗DAB后，蘇木素復(fù)染核，乙醇逐級脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果，在400×倍顯微鏡下隨機選4個視野拍照，計算每100個細胞的陽性細胞數(shù)。

1.2.6 TGF-β1含量的檢測 收集各組HK-2培養(yǎng)細胞上清液0.5 mL，進行TGF-β1含量的檢測。

1.2.7 RT-PCR檢測各樣本基因表達 將細胞種在12孔板里，按實驗分組處理細胞，用Trnzol法提取細胞總RNA，核酸蛋白分析儀260 nm測定RNA濃度和純度。在Real Time PCR儀上檢測各樣本基因表達，用ABI?7300實時熒光定量系統(tǒng)進行分析，根據(jù)Ct值，以空白作為標(biāo)準(zhǔn)，計算各組基因表達為空白的倍數(shù)，以此倍數(shù)作統(tǒng)計。計算公式：表達倍數(shù)=2-［（Ct用藥目的基因-Ct用藥內(nèi)參基因-Ct對照組目的基因-Ct對照組內(nèi)參基因）］

1.3 統(tǒng)計方法 實驗數(shù)據(jù)使用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett's T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下觀察 不同數(shù)量HK-2細胞由立方鋪路石樣轉(zhuǎn)變呈現(xiàn)梭形長條狀，細胞肥大，而空白對照組仍呈現(xiàn)立方鋪路石樣。見圖1。

圖1 Transwell共培養(yǎng)法免疫組化圖

2.2 各組HK-2細胞α-SMA蛋白表達 見表2。經(jīng)SPSS軟件統(tǒng)計分析，共培養(yǎng)組HK-2細胞高表達α-SMA（P＜0.01）。

表2 HK-2細胞表達α-SMA情況（±s） 個

表2 HK-2細胞表達α-SMA情況（±s） 個

注：與空白對照組比較，**P＜0.01。

組別 n 每100個細胞中陽性細胞數(shù)共培養(yǎng)組 3 43.67±1.53**空白對照組 3 1.70±0.95陽性對照組 3 60.70±4.32**

2.3 各組細胞上清液TGF-β1含量比較 見表3。經(jīng)SPSS統(tǒng)計軟件顯示，共培養(yǎng)組下層HK-2細胞上清液中TGF-β1含量明顯高于空白對照組。

表3 下層細胞培養(yǎng)液中TGF-β1濃度（±s） ng/L

表3 下層細胞培養(yǎng)液中TGF-β1濃度（±s） ng/L

注：與空白對照組比較，**P＜0.01。

組別 n 細胞上清液TGF-β1量共培養(yǎng)組 3 156.17±3.51**空白對照組 3 15.34±0.44陽性對照組 3 446.30±1.05**

2.4 各樣本基因表達情況 見表4。SPSS統(tǒng)計軟件分析，共培養(yǎng)組各目的基因與空白對照組相比均有顯著性差異。TβRⅠ、Smad2、Smad3基因表達均明顯上調(diào)，而TβRⅡ、Smad7基因則是下調(diào)效應(yīng)。

表4 各目的基因表達倍量（±s）

表4 各目的基因表達倍量（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01。

?

3 討論

Transwell小室共培養(yǎng)為間接共培養(yǎng)，共培養(yǎng)體系中一者對另者的影響是通過本身分泌的細胞因子起作用的，這種分泌不用兩者接觸。兩者之間鋪一層soft agar，使兩者不發(fā)生直接接觸，但可以使被分泌的細胞因子通過。其主要利用了可溶性細胞因子等成分的作用（可擴散性）。肝星狀細胞的活化與增殖是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)［13-14］，是肝臟細胞外基質(zhì)的主要來源，為肝纖維化形成的細胞學(xué)基礎(chǔ)。其在Matrigel等基質(zhì)中呈靜止?fàn)顟B(tài)，但在無任何包被的塑料培養(yǎng)皿中可自發(fā)性活化，與體內(nèi)肝損傷后的活化過程相似，其體外培養(yǎng)細胞具有很好的慢性肝病的模型意義，故采用LX-2與HK-2細胞間接共培養(yǎng)，以研究LX-2對HK-2細胞轉(zhuǎn)分化的影響。

本實驗共培養(yǎng)中的HK-2細胞，形態(tài)由立方鋪路石樣轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細胞樣的梭形長條狀，且肌成纖維細胞標(biāo)志物α-SMA高表達（P＜0.01）；HK-2細胞上清液中TGF-β1含量明顯高于空白組（P＜0.01）。結(jié)果證實LX-2細胞可誘導(dǎo)HK-2細胞表型轉(zhuǎn)化，這可能是肝纖維化引發(fā)腎纖維化的機制之一，具體信號傳導(dǎo)通路可能與TGFβ1/Smad信號通路有關(guān)。

TGF-β必須活化并與其效應(yīng)細胞上的受體結(jié)合才能發(fā)揮作用，它首先在細胞外與TβRⅢ形成復(fù)合物，將TGF-β傳遞給TβRⅡ，或TGF-β直接與TβRⅡ結(jié)合，隨后活性TβRⅡ的蛋白激酶使Ⅰ型受體磷酸化，后者直接使TGF-β的信號通道蛋白Smad2、3 MH2結(jié)構(gòu)域的 SSXS基序磷酸化，與Smad4形成異源寡聚體復(fù)合物，該復(fù)合物轉(zhuǎn)移到胞核調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因轉(zhuǎn)錄，在細胞水平介導(dǎo)TGF-β的生物學(xué)效應(yīng)。抑制型Smad6、7是細胞中TβRⅠ型受體絲氨酸/蘇氨酸激酶的拮抗蛋白，能牢固地與TβRⅠ型受體結(jié)合，抑制Smad2、3磷酸化，完全阻斷TGF-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制活化Smad復(fù)合物在核內(nèi)移動，減少Ⅰ型膠原合成，在TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中構(gòu)成負反饋。研究證實，Smad7能抑制TGF-β依賴的上皮細胞-肌纖維母細胞轉(zhuǎn)分化。

為證實該通路在此共培養(yǎng)體系中的作用，筆者應(yīng)用RT-PCR法檢測了Transwell共培養(yǎng)模型中HK-2細胞TβRⅠmRNA、TβRⅡmRNA、Smad2mRNA、Smad3mRNA、Smad7mRNA的表達。實驗結(jié)果顯示TβRⅠ、Smad2、Smad3基因表達均明顯上調(diào)，而TβRⅡ、Smad7基因則是下調(diào)效應(yīng)。表明在該培養(yǎng)體系中TGFβ1/Smad信號通路是存在的，腎小管上皮細胞是趨向纖維化方向發(fā)展的，其機制可能與TGFβ1/Smad信號通路有關(guān)。故推測此通路可能是肝纖維化導(dǎo)致腎纖維化的一個發(fā)病機制之一。

從中醫(yī)理論上講，肝纖維化引發(fā)腎纖維化的病理基礎(chǔ)在于“肝腎同源”?！案文I同源”理論揭示了同屬下焦的肝腎兩臟在生理、病理上存在相互滋生、相互影響的密切關(guān)系。兩者在發(fā)病學(xué)上具有同源性，即同源于肝腎兩臟具有相同的疾病易感性，除了中醫(yī)臨床中見到的肝陰虛常與腎陰虛相兼存在，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中也找到了肝腎兩臟同病的例證，如部分乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎患者在肝硬化的同時亦有不同程度的腎小球硬化，甚至出現(xiàn)腎小管間質(zhì)的纖維化［15］。故治療中也可以依據(jù)“肝腎同源”理論，做到“肝病治腎”、“腎病治肝”、“肝腎同治”。

綜上所述，Transwell小室建立LX-2細胞及HK-2細胞間接共培養(yǎng)模型，能成功誘導(dǎo)HK-2細胞表型轉(zhuǎn)化，且模型與機體實際作用形式相吻合，具有良好的可行性。同時該實驗也證實，TGFβ/Smad通路可能是肝纖維化導(dǎo)致腎纖維化的重要發(fā)病機制之一，也為“肝腎同源”理論中共同疾病易感性學(xué)說提供了依據(jù)。

［1］Strutz F，Caron R，Tomaszewski J.Transdiferentiation:a new concept in renal fibrogenesis［J］.J AM Soc Nephrol，1994（5）: 819-826.

［2］陳慰峰.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004:45-52.

［3］駱抗先.乙型肝炎基礎(chǔ)和臨床［M］.第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:571.

［4］Fan JM，Ng YY，Hill PA，et al.Transforming growth factorbeta regulates tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation in vitro［J］.Kidney Int，1999，56（4）:1455-1467.

［5］Abbate M，Ioja C，Rottoli D，et al.Proximal tubular cells promote fibrogenesis by TGF-β1-mediated induction of peritubular myofibroblasts［J］.Kidney Int，2002，61（6）:2066-2077.

［6］Sommer M，Gerth J，Stein G，et al.Transdifferentiation of endothelial tubular epithelial cells into myfibroblastlike cells under in vitro con Ditions:Amorphologicalanalysis［J］.CellsTissues Organs，2005，180（4）:204-214.

［7］Wang QL，Tao YY，Yuan JL，et al.Salvianolic acid B prevents epithelial-to-mesenchymal transition through the TGF-β1signal transduction pathway in vivo and in vitro［J］.BMC Cell Biology，2010，11（1）:31.

［8］胡志峰，李 忻，何 燕，等.DMN誘導(dǎo)的肝纖維化模型伴腎損害的實驗觀察［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2010，16（4）: 291-294.

［9］王洪霞.扶正化瘀膠囊治療慢性乙型肝炎肝纖維化臨床觀察［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，29（3）:132-133.

［10］Border WA，Noble NA.Evidence that TGF-β should be a therapeutic target in diabetic nephropathy［J］.Kidney Int，1998，54（4）:1390-1391.

［11］唐 閣，郭 卉.瘀血阻絡(luò)型慢性乙型肝炎患者膠原四項與病理分期的相關(guān)性研究［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，32（1）:14-16.

［12］蘇金玲，姜希娟，宋星星，等.ILK、TNFα在酒精性肝纖維化大鼠肝組織中的表達及五田保肝液的干預(yù)作用［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，31（1）:20-22.

［13］Sato M，Suzuki S，Senoo H.Hepatic stellate cell:U niquecharacteristics in cell biology and phenotype［J］.Cell Struct Funct，2003，28（2）：105-112.

［14］Friedm an SL.Mechanism s of hepatic fibro genesis［J］.Gastroenterology，2008，134（6）：1655-1669.

［15］王耀光.“肝腎同源”論初探［J］.中醫(yī)雜志，2008，49（1）:5-7.

LX-2 and HK-2 cell co-culture model and the influence of its cells

WANG Yao-guang1，ZENG You-jia2，ZHOU Hui-jie3
（1.First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Shenzhen City Hospital of traditional Chinese medicine，Shenzhen 518033，China；3.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To establish human hepatic stellate cells（LX-2）and renal tubular epithelial cells（HK-2）co-culture system theory model，research LX-2 cells influence on transdifferentiation of HK-2 cells.［Methods］By Transwell Chambers establish human hepatic stellate cells in vitro（LX-2 cells）and human renal tubular epithelial cells（HK）-2 cells indirectly co-culture system.By cellular immune histochemical method to detect α-SMA of HK-2 cells；With ELISA method to detect the TGF-beta 1 in cell cultures of the content；By RT-PCR method to detect of T beta RⅠmRNA，T beta RⅡmRNA，Smad2 mRNA，Smad3 mRNA and Smad7 mRNA expression of HK-2 cell.［Results］Except the blank group，the two other groups on morphology can see HK-2 dye cell cytoplasm tan，different number of cells from cubic paving stone sample into spindle long strips，cell hypertrophy；HK-2 high expression of α-SMA cells（P＜0.01）；TGF-beta 1 content in the HK-2 cells supernatant fluid was obviously higher than blank group （P＜0.01）.TβRⅠ，Smad2 and Smad3 gene expression increase obviously，while TβRⅡ，Smad7 gene expression significantly lowered in HK-2 cells.［Conclusion］Transwell culture method can be induced to HK-2 cell transdifferentiation，its mechanism may be related to the TGF beta 1/Smad signaling pathways.

renal tubular epithelial cell trans-differentiation；Transwell；LX-2 cell；HK-2 cell；cell co-culture

R285.5

A

1673-9043（2016）05-0318-04

2016-04-25）

天津市教委課題項目（20070307）。

王耀光（1963-），男，博士，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向為中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合治療腎病綜合征，乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎的臨床與實驗研究，慢性腎功能衰竭的臨床與實驗研究等。