鄧永利，周光明，陳軍華，高　意，廖安輝

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，發(fā)光與實(shí)時(shí)分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

離子液體輔助超聲萃取-高效液相色譜同時(shí)測(cè)定半邊蓮中6 種黃酮類化合物

鄧永利，周光明*，陳軍華，高意，廖安輝

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，發(fā)光與實(shí)時(shí)分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

目的：通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)離子液體輔助萃取半邊蓮中黃酮類化合物的條件進(jìn)行優(yōu)化，建立高效液相色譜法同時(shí)分離測(cè)定半邊蓮中蘆丁、槲皮素、柚皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素的方法。方法：采用InertSustain C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行分離；流動(dòng)相為甲醇（B）-乙酸溶液（A，pH 3.0），梯度洗脫；流速1.0 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)285 nm；柱溫35 ℃。結(jié)果：以黃酮類化合物的提取量為指標(biāo)，最佳提取條件為甲醇體積分?jǐn)?shù)80%、固液比1∶80（g/mL）、萃取時(shí)間30 min、離子液體濃度0.6 mol/L。在優(yōu)化的色譜條件下，蘆丁、槲皮素、柚皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素分離效果良好；定性檢出限（RSN= 3）依次為0.001 2、0.002 3、0.002 6、0.000 2、0.001 0、0.000 6 μg/mL；樣品回收率為91.77%～102.53%。結(jié)論：該萃取方法操作簡(jiǎn)單快速，為半邊蓮中黃酮類化合物的提取分離及檢測(cè)提供了有效的方法。

高效液相色譜；半邊蓮；黃酮類化合物；離子液體；超聲萃取

半邊蓮（Herba Lobelia chinensis），又名半邊花、水仙花草、長(zhǎng)蟲草等，系桔?？瓢脒吷彽母稍锶荩晃缎?、平，歸心、小腸、肺經(jīng)?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明半邊蓮具備利尿消腫、清熱解毒等功效，可用于治療臌脹水腫、濕熱黃疸、濕疹濕瘡等疾?。?］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，半邊蓮中含有黃酮類［2-3］、萜類［4］、木脂素類［5-6］、生物堿類［7-9］等多種活性成分。大量國(guó)內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)證明半邊蓮具有抗癌［10-13］、抗病毒［14］、抗炎［15-16］和抑制動(dòng)脈硬化［17］的功能；亦有研究表明半邊蓮能夠大量吸收被污染土壤中的重金屬鎘，并有望用于植物修復(fù)［18］。

半邊蓮具有豐富的植物資源和顯著的藥理作用。目前，關(guān)于半邊蓮中有效成分分離測(cè)定的報(bào)道較少，僅見喬春峰等［19］定量測(cè)定了半邊蓮中兩種多炔類成分；黃秀香［20］、李穎［21］等分別優(yōu)化了半邊蓮中黃酮苷和異阿魏酸的提取工藝，因此亟待對(duì)該植物的化學(xué)成分進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。黃酮類化合物是半邊蓮中非常重要的一類化合物，并且黃酮類化合物被認(rèn)為是抗癌的主要活性成分［22-23］，半邊蓮中含有的黃酮類化合物主要有蘆丁、槲皮素、柚皮素、橙皮素、山柰酚、芹菜素和木犀草素等［5,24-25］。近幾年，在綠色化學(xué)的框架下發(fā)展起來(lái)的一種新型萃取劑——離子液體，具有蒸汽壓低、熱穩(wěn)定性好、溶解性強(qiáng)和可設(shè)計(jì)等特性［26-29］，使其在化學(xué)領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用，離子液體已經(jīng)作為輔助溶劑萃取天然產(chǎn)物中的活性成分［30-31］。另外，超聲波法是提取中藥中活性成分的常用方法，它能加速藥材中有效成分溶解、縮短提取時(shí)間、提高有效成分的提取率等優(yōu)點(diǎn)［32］。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)以離子液體1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（［HMIm］PF6）作為輔助萃取溶劑，結(jié)合超聲波法提取半邊蓮中的有效成分，利用高效液相色譜同時(shí)分離和定量測(cè)定提取液中的蘆丁、槲皮素、柚皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

半邊蓮 重慶藥房。

蘆丁、槲皮素、柚皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素對(duì)照品（純度均≥98.5%） 上海晶純實(shí)業(yè)有限公司；1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（純度為99%） 中科院蘭州化學(xué)物理研究所；乙酸（分析純）、甲醇（色譜純） 重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠；二次蒸餾水 實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀（包括SPD-20A紫外檢測(cè)器、CTO-10AS柱溫箱、LC-20AT泵） 日本島津公司；KH-3200B型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；SZ-2自動(dòng)雙重純化水蒸餾器 上海滬西分析儀器；XY型電熱恒溫干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FA2004A型分析天平 上海精天電子儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：InertSustain C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇為流動(dòng)相B，乙酸（pH 3.0）為流動(dòng)相A，梯度洗脫（0～5 min，50%～55% B；5～1 5 m i n，5 5%～5 5% B；1 5～2 0 m i n，55%～50% B）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：285 nm；柱溫：35 ℃。混合對(duì)照品和樣品的色譜圖見圖1。

圖1　混合對(duì)照品（A）和樣品（B）色譜圖Fig.1　Chromatograms of standard mixture （A） and sample （B）

1.3.2溶液的制備

1.3.2.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱定蘆丁、槲皮素、柚皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素對(duì)照品適量于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制成對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取各對(duì)照品溶液適量于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成混合對(duì)照品溶液，置于冰箱（4 ℃）內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2供試品溶液的制備

將中藥半邊蓮在60 ℃烘箱干至質(zhì)量恒定后研磨粉碎，粉末過60 目篩。稱取0.1 g半邊蓮粉末于具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入8 mL 0.6 mol/L ［HMIm］PF6溶液，稱定質(zhì)量，超聲萃取30 min，再稱定質(zhì)量，用提取溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量。提取液5 000 r/min離心5 min，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

可見，在一個(gè)工作日內(nèi)，A1類機(jī)床安排1臺(tái)來(lái)生產(chǎn)零件B1、安排2臺(tái)來(lái)生產(chǎn)零件B2,A2類2臺(tái)機(jī)床只生產(chǎn)零件B1,A3類4臺(tái)機(jī)床只生產(chǎn)零件B2．零件B1共生產(chǎn)90件，零件B2共生產(chǎn)132件，按2∶3將零件裝配成產(chǎn)品時(shí)最大產(chǎn)量仍為44件．將上述最優(yōu)解整理為企業(yè)的最優(yōu)生產(chǎn)方案，如下表3．

2　結(jié)果與分析

2.1流動(dòng)相的選擇

分別考察甲醇、乙腈與不同pH值（乙酸調(diào)節(jié)）的溶液作為流動(dòng)相的分離效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)pH 3.0的乙酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)能夠有效抑制蘆丁色譜峰的前延和山柰酚、芹菜素色譜峰的拖尾。對(duì)比甲醇和乙腈作為流動(dòng)相的色譜圖，發(fā)現(xiàn)甲醇作為流動(dòng)相時(shí)槲皮素和柚皮素的分離度明顯大于乙腈作為流動(dòng)相的分離度，可能是由于乙腈對(duì)槲皮素和柚皮素的洗脫能力更強(qiáng)，使得槲皮素和柚皮素的分離效果較差。在分離的6 種成分中可能是因?yàn)殚纹に睾丸制に匾约吧借头雍颓鄄怂氐臉O性相近，在等度洗脫的條件下，槲皮素和柚皮素、山柰酚和芹菜素的色譜峰重疊嚴(yán)重，難以達(dá)到定量分析的要求。其中槲皮素和柚皮素更是難以同時(shí)分離，查閱資料顯示有關(guān)槲皮素和柚皮素同時(shí)分離的報(bào)道較少。但是，由圖1可知，通過設(shè)置梯度洗脫，使得不易同時(shí)分離的山柰酚和芹菜素成功完全分離，較難同時(shí)分離的槲皮素和柚皮素亦能達(dá)到定量分析的要求。為了改善色譜峰的峰形和避免基質(zhì)中雜質(zhì)對(duì)分析目標(biāo)物的干擾，不斷調(diào)節(jié)流動(dòng)相的比例，最終確定了1.3.1節(jié)中的梯度洗脫條件。結(jié)果表明，在1.3.1節(jié)的色譜條件下，較難同時(shí)分離的槲皮素和柚皮素能夠得到較好地分離，并且能夠達(dá)到定量分析的要求。

2.2提取條件的優(yōu)化與確定

2.2.1提取溶劑及離子液體濃度的選擇

圖2　甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取量的影響Fig.2　Effect of methanol concentration on the extraction efficiency

圖3　離子液體濃度對(duì)提取量的影響Fig.3　Effect of ionic liquid concentrations on the extraction efficiency

比較了20%、40%、60%、80%和100%甲醇體積分?jǐn)?shù)的溶液作為提取溶劑后，由圖2可知，6 種分析物的提取量隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，且80%和100%的甲醇對(duì)6 種分析物的提取量相當(dāng)，為了節(jié)約有機(jī)試劑，選擇80%甲醇溶液作為單因素試驗(yàn)的提取溶劑。同時(shí)進(jìn)一步考察不同濃度離子液體提取溶劑對(duì)有效成分提取量的影響，依次以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L離子液體作為提取溶劑的提取效果。圖3表明，當(dāng)離子液體的濃度為0.6 mol/L時(shí)，各成分的提取量達(dá)到最大，其中柚皮素和蘆丁的提取量明顯增加，離子液體的濃度大于0.6 mol/L提取量并無(wú)明顯增加。

2.2.2超聲時(shí)間的選擇

比較超聲提取10、20、30、40 min和50 min 6 種成分的提取量，在10～30 min內(nèi)，各成分的提取量隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增大，超過30 min后，提取量并無(wú)明顯增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4　超聲時(shí)間對(duì)提取量的影響Fig.4　Effect of ultrasonication time on the extraction efficiency

考察固液比為1∶30、1∶50、1∶60、1∶80和1∶100（g/mL）6 種成分的提取效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5，1∶80和1∶100的固液比都可以得到滿意的提取效果。根據(jù)6 種有效成分對(duì)紫外光的吸收強(qiáng)度，選擇285 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖5　固液比對(duì)提取量的影響Fig.5　Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction efficiency

2.2.4正交試驗(yàn)結(jié)果

為全面考察離子液體輔助超聲提取各因素的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。采用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，以甲醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、離子液體濃度和超聲時(shí)間為考察因素，綜合單因素試驗(yàn)的結(jié)果各選取3 個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)中以6 種成分的提取量為考察指標(biāo)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果及直觀分析見表1。由極差R可知，各因素對(duì)6 種活性成分提取量的影響程度依次為B＞A＞C＞D，即固液比對(duì)提取量的影響最大，其次分別為甲醇體積分?jǐn)?shù)、離子液體濃度、超聲時(shí)間。由表1可知，在正交試驗(yàn)范圍內(nèi)得到的最佳試驗(yàn)條件為A2B2C1D1，即甲醇體積分?jǐn)?shù)80%、固液比1∶80、離子液體濃度0.6 mol/L、超聲時(shí)間30 min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)半邊蓮中各成分提取量為蘆丁12.3 μg/0.1 g、槲皮素5.1 μg/0.1 g、柚皮素14.5 μg/0.1 g、橙皮素8.1 μg/0.1 g、山柰酚4.9 μg/0.1 g和芹菜素5.2 μg/0.1 g。

表1　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table1　Orthogonal array design with experimental results for the extraction of total flavonoids

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系考察

精密量取1.3.2.1節(jié)的混合對(duì)照品溶液，以甲醇逐步稀釋為7 個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液并在1.3.1節(jié)的條件下按質(zhì)量濃度由低到高的順序依次進(jìn)樣3 次進(jìn)行分析。以對(duì)照品平均峰面積為縱坐標(biāo)Y，質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)X作圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)RSN=3計(jì)算方法的檢出限。6種化合物線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表2。

表2　6種化合物的線性關(guān)系考察結(jié)果Table2　Calibration curves with linear ranges and limits of detection for 6 flavonoid compounds

2.3.2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用同一供試品溶液48 h內(nèi)每間隔6 h進(jìn)樣分析，結(jié)果蘆丁、槲皮素、柚皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.81%、0.93%、2.55%、1.71%、2.10%、2.32%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.3精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

混合對(duì)照品溶液在1.3.1節(jié)的條件下重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定各個(gè)對(duì)照品的峰面積，結(jié)果蘆丁、槲皮素、柚皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素對(duì)照品的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.90%、1.61%、2.34%、1.63%、1.20%、2.56%，表明儀器精密度良好。

2.3.4樣品的含量測(cè)定及回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按1.3.2.2節(jié)的步驟制備供試品溶液3 份，每份供試品溶液進(jìn)樣分析3 次，根據(jù)線性方程測(cè)定樣品含量，結(jié)果見表3。精密稱取已知含量的同一批半邊蓮樣品9 份，每份0.1 g，分為3 組，每組按低、中、高分別加入一定量的對(duì)照品溶液，然后按照供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理，每份進(jìn)樣3 次，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見表3。樣品回收率為91.77%～102.53%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%。

表3　樣品含量測(cè)定及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table3　Results for the determination of six flavonoids in real samples and spiked recoveries （ n= 3）

3　結(jié) 論

利用高效液相色譜結(jié)合紫外檢測(cè)器分離和測(cè)定了半邊蓮中蘆丁、槲皮素、柚皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素6 種黃酮類化合物。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化，確定超聲波同時(shí)提取半邊蓮中6 種黃酮類化合物的最佳提取條件為甲醇體積分?jǐn)?shù)80%、固液比1∶80、超聲時(shí)間30 min、離子液體濃度0.6 mol/L，在此條件下測(cè)得半邊蓮樣品中含蘆丁12.3 μg/0.1 g、槲皮素5.1 μg/0.1 g、柚皮素14.5 μg/0.1 g、橙皮素8.1 μg/0.1 g、山柰酚4.9 μg/0.1 g和芹菜素5.2 μg/0.1 g。利用離子液體1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（［HMIm］PF6）作為輔助萃取溶劑，明顯提高了所測(cè)成分的提取率，當(dāng)離子液體濃度為0.6 mol/L時(shí)，各成分的提取量達(dá)到最大。通過結(jié)合超聲波法加快了半邊蓮藥材中所測(cè)成分的溶解，與傳統(tǒng)的浸漬法、滲漉法、煎煮法、索氏提取法相比，大大縮短了超聲時(shí)間，明顯提高了提取效率。樣品各成分的加標(biāo)回收率為91.77%～102.53%（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%），取得了令人滿意的回收率。該方法操作簡(jiǎn)便、快速，為半邊蓮的質(zhì)量控制及其中黃酮類化合物的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Simultaneous Determination of 6 Flavonoid Compounds in Herba Lobelia chinensis by High Performance Liquid Chromatography after Ionic Liquid Assisted Ultrasonic Extraction

DENG Yongli, ZHOU Guangming*, CHEN Junhua, GAO Yi, LIAO Anhui
（Key Laboratory on Luminescence and Real-Time Analysis, Ministry of Education, School of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China）

Objectives： To optimize the conditions for ionic liquid-assisted extraction of fl avonoids compounds from Herba Lobelia chinensis using single factor and orthogonal array designs and consequently to establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for simultaneous determination of rutin, quercetin, naringgenin, hesperetin, kaempferol and apigenin in Herba Lobelia chinensis. Methods： The 6 compounds were separated on an InertSustain C18（150 mm × 4.6 mm, 5 μm）using a mobile phase consisting of methanol and acetic acid （pH 3.0） with gradient elution at a fl ow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 285 nm. The column temperature was maintained at 35 ℃. Results： The optimum extraction conditions for total fl avonoids were determined as follows： 80% （V/V） aqueous methanol as extraction solvent；solid-to-liquid ra tio, 1：80 （g/mL）； extraction time, 30 min； and ionic liquid concentration, 0.6 mol//L. Under these conditions, rutin, quercetin, naringgenin, hesperetin, kaempferol and apigenin were separated satisfactorily. The limits of detection （LODs）for these fl avonoid compounds were 0.001 2, 0.002 3, 0.002 6, 0.000 2, 0.001 0 and 0.000 6 μg/mL, respectively. The recoveries of spiked samples ranged from 91.77% to 102.53%. Conclusion： The proposed method is simple and rapid, and it can provide an effi cient means for the extraction, separation and determination of fl avonoid compounds in Herba Lobelia chinensis.

high performance liquid chromatography； Herba Lobelia chinensis Lour.； flavonoid compounds； ionic liquid；ultrasonic extraction

10.7506/spkx1002-6630-201620007

O657.72

A

1002-6630（2016）20-0037-05

鄧永利, 周光明, 陳軍華, 等. 離子液體輔助超聲萃取-高效液相色譜同時(shí)測(cè)定半邊蓮中6 種黃酮類化合物［J］. 食品科學(xué), 2016, 37（20）： 37-41. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620007. http：//www.spkx.net.cn

DENG Yongli, ZHOU Guangming, CHEN Junhua, et al. Simultaneous determination of 6 flavonoid compounds in Herba Lobelia chinensis by high performance liquid chromatography after ionic liquid assisted ultrasonic extraction［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 37-41. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620007. http：//www.spkx.net.cn

2016-01-04

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（100030-2120130993）

鄧永利（1980—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)殡x子色譜。E-mail：hxdengyl@swu.edu.cn

周光明（1964—），男，教授，博士后，研究方向?yàn)樯V及其聯(lián)用技術(shù)。E-mail：gmzhou@swu.edu.cn