黨海霞,令春艷,陳洪濤

(1.大連醫(yī)科大學 口腔醫(yī)學院，遼寧 大連 116044；2. 大連醫(yī)科大學附屬大連市口腔醫(yī)院 口腔外科，遼寧 大連 116021)

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基于組織學連續(xù)切片的三維重建技術

黨海霞1,令春艷1,陳洪濤2

(1.大連醫(yī)科大學 口腔醫(yī)學院，遼寧 大連 116044；2. 大連醫(yī)科大學附屬大連市口腔醫(yī)院 口腔外科，遼寧 大連 116021)

組織學連續(xù)切片的三維重建技術，因其分辨率高,能精確再現(xiàn)組織內部結構,已在生物科學領域廣泛應用，成為三維重建領域不可替代的部分。本文重點介紹了組織學切片三維重建的方法和三維重建的軟件，提出了醫(yī)學圖像三維重建技術發(fā)展所面臨的相關問題，在此基礎上得出計算機輔助組織學切片三維重建技術在醫(yī)學研究領域的優(yōu)勢，并總結了該技術在醫(yī)學研究中的一些應用，以期對相關研究提供借鑒。

組織學連續(xù)切片；計算機；三維重建

[引用本文]黨海霞,令春艷,陳洪濤.基于組織學連續(xù)切片的三維重建技術[J].大連醫(yī)科大學學報，2016,38(5)：506-510.

三維重建或三維可視化目前在醫(yī)學領域應用甚廣[1-2]。最近，微形態(tài)圖像重建評估技術已經應用到再生醫(yī)學，許多類型的三維重建成像和可視化技術可高分辨率顯示組織微觀結構[3]。然而除了微型計算機斷層掃描(microscopic X-ray computed tomography，microCT)和激光共聚焦掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)，其余三維重建技術都很難達到的二維光的亞微米分辨率顯微圖像，但microCT對特定染色的組織成分難以實現(xiàn)三維重建，而CLSM在重建組織的厚度方面成像有一定程度的限制，對一些熒光標記物很難發(fā)現(xiàn)且對樣本標記物的平均分配也很困難[4-6]。

相對上述技術，連續(xù)組織學切片的計算機三維重建技術在這些方面具有優(yōu)勢。對連續(xù)組織切片進行三維重建，不但能精確地顯示生物組織復雜的三維結構，并可進行隨意旋轉、剖切等操作，結合應用測量軟件，還可對三維重建的結構進行測量，可獲得面積、體積、長度、和角度等精確的解剖參數。該技術正越來越廣泛地應用于形態(tài)學、比較生物學、解剖學、分子生物學等領域[7-9]。本文就計算機輔助組織學切片三維重建技術的三維重建方法和優(yōu)勢及其在醫(yī)學研究中的應用進行綜述。

1　組織學切片三維重建方法

組織學連續(xù)切片計算機輔助三維重建的大致步驟包括組織獲取、固定、包埋、連續(xù)切片、切片染色、圖像采集，最后借助軟件進行圖片配準后采用相應的算法實現(xiàn)組織結構的三維重建。

1.1三維重建前的處理

1.1.1組織獲取、固定和包埋：處理獲取組織時要確保修剪得當，不損傷樣品結構，避免長時間暴露在空氣中或脫水。獲取的組織要及時固定，根據組織類型，目標成分和染色方法選用合適的固定方法和固定液。組織學包埋切片的方法較多，如石蠟、明膠、碳蠟和火棉膠包埋等，以石蠟包埋法最為常用。三維重建對石蠟切片準確度要求很高，對于大塊組織的包埋與切片，特別是富含纖維及肌肉組織的標本，可選用火棉膠包埋。對于硬組織可采取微型磨削技術或脫鈣后進行切片[10-11]。

1.1.2連續(xù)切片和染色：完整連續(xù)的切片是進行后期重建的重要基礎，任何一種方式的連續(xù)切片最好是連續(xù)的、等距的、平整的，避免丟失和變形。連續(xù)切片越薄，數目越多，變形越少，信息越豐富，組織界限特征越分明，重建圖像就越逼真[12]。染色的整體要求是不同結構易于辨認區(qū)分，常規(guī)HE染色一般可滿足三維重建需要。對某些特殊組織結構，可根據組織特點選擇特異性的染色方法便于圖像采集后能夠快速選取所需研究的對象，從而提高效率[13-14]。如利用螺旋CT，蘇木精-伊紅染色，Mallory三色染色可實現(xiàn)三維重建監(jiān)測海藻酸鈉-明膠共混體系/成骨細胞凝膠修復兔顱骨缺損的愈合過程[14]。

1.2圖像采集

由于對減小誤差和要求組織三維重建的細致化、清晰化的追求，隨著計算機技術的不斷發(fā)展和進步，近年來除對硬件要求高分辨率以外，這一過程已由傳統(tǒng)的手動拍照逐漸轉向自動化連續(xù)成像系統(tǒng)的開發(fā)與改良[15-16]。

1.3計算機輔助三維重建軟件

目前組織學切片三維重建軟件的總趨勢是易用、高效和開源，具有圖片定位、配準、壓縮、自動切割、數據讀取等基本功能，能精確地生成組織復雜的生物體三維結構，并可進行任意旋轉、剖切等觀察和操作，并能輸出多種格式便于后期渲染和傳播[17-20]。國內外報道的用于圖像三維重建的軟件有很多，如3D-Slice，3D-Doctor，3d-Max，Neuro Tracer3D，ZAIO900，3D-MED，Reconstruct等。其中，3D-Doctor 是一款先進的三維圖像處理和測量軟件，可應用于醫(yī)學方面三維圖像處理程序[21]。

1.4組織學切片顯微結構的三維重建

1.4.1切片圖像的排齊：切片圖像的排齊是指將一幅圖像與另一幅圖像上的對應點達到空間位置和解剖結構上的一致，使一系列切片的空間位置與其原標本位置相對應，以達到重建的最佳效果。配準的結果應使兩幅圖像上所有的解剖點，或至少是所有具有診斷意義的點都達到匹配[22]。

1.4.2圖像的追蹤分割技術和重建后的輸出和渲染：常見的分割技術有微分算子邊緣檢測、閾值分割技術、區(qū)域增長技術和聚類分割技術[23-24]。目前，醫(yī)學圖像分割的研究多數是針對CT和MRI圖像，組織切片圖像為真彩色圖像，而彩色圖像的分割一直是圖像處理領域中的難點，將彩色圖像轉換為灰度圖像，然后用灰度圖像分割算法分割。也可利用Photoshop提供的畫筆(Brush)，套索(Lasso)等圖像分割工具進行手工分割的辦法。重建后的圖片一般輸出為VRML 2.0，VRML 1.0，DXF,Bitmap,360Bitmaps等格式。后導入3D Max(Autodesk公司)，Maya(美國Autodesk公司)等軟件進行渲染。

2　基于組織學切片的三維重建在醫(yī)學研究中的優(yōu)勢及應用

在醫(yī)療干預(如術中使用圖像引導系統(tǒng)或基于圖像的術前計劃)以及再生醫(yī)學研究中，計算機輔助建立三維模型起到了一個關鍵性的作用。然而像側顱底，尤其是聽覺系統(tǒng)一些特殊的組織結構，由于其組織結構高度的復雜性，小尺寸和廣泛的組織分化，這對于計算機輔助建立三維模型研究是一個具有挑戰(zhàn)性的領域。隨著研究技術的不斷發(fā)展，顯微切割技術雖然提供了非常詳細的顳骨的組織學圖像，但其并不適用于體積三維重建。而多層計算機斷層掃描(multi-slice computed tomography，MSCT)、基于平板探測器計算機斷層掃描(flat-panel detector-based volume computed tomography，fp-VCT)和microCT很難同時獲得骨結構和薄軟組織的圖像，磁共振成像分辨率不到1 mm難以實現(xiàn)可視化。雖然磁共振顯微鏡和其他一些實驗方法如光學相干顯微鏡和正交平面熒光光學切片顯微鏡斷層掃描，可改善到微觀范圍內但仍無法結合空間分辨率和高分辨率同時觀察骨組織和軟組織的代表性組織結構。目前看來，基于組織學連續(xù)切片的三維重建技術是克服上述問題的最佳選擇方法。運用該技術空間分辨率可通過提高調節(jié)放大倍數和切片厚度來加以提高，對于不同分化組織可以通過特定染色來加以區(qū)分。在醫(yī)學臨床與研究領域，通過連續(xù)切片三維重建技術，可以得到醫(yī)學影像數據中隱含的三維解剖結構和功能信息，為醫(yī)療人員提供病變區(qū)域的三維數據，以便于從多角度、多層次進行觀察，并對特定區(qū)域進行準確的定量分析。見圖1。

圖1　基于組織學切片的三維重建示意Fig 1 3D reconstruction of series histological sections

目前在醫(yī)學研究領域已經有眾多學者運用連續(xù)切片三維重建技術進行了相關研究，如國外Teutsch等[25]利用大鼠肝臟組織學切片，采用特殊染色葡萄糖-6-磷酸酶染色，三維重建后可清晰觀察到肝實質的邊界結構。Song等[7]通過頭皮皮膚連續(xù)切片的三維重建來描述立毛肌和皮脂腺的形態(tài)學關系。此外，有研究者利用人顳骨(包含中耳和內耳結構)作標本，將標本用環(huán)氧樹脂包埋，然后運用連續(xù)磨削(使用精度為1 μm的觸覺長度計磨削)并獲得相關數據進行三維重建，為軟組織和骨組織結構提供了一個具有高對比度和高分辨率的成像方式[22]。更有學者利用該技術在呼吸系統(tǒng)方面進行了研究，研究者利用番鴨肺的三維重建來闡明了禽肺終端呼吸裝置的微觀結構。將肺用2.5%的戊二醛磷酸鹽緩沖液氣管內滴注固定，并沿肋溝作橫切片。將含側支氣管的標本用環(huán)氧樹脂包埋。用玻璃刀將組織切為厚度為0.3 μm的切片。感興趣的結構鑒定用甲苯胺藍染色。運用軟件進行三維圖像重建后使肺的空氣毛細血管和毛細血管得到了很好的顯現(xiàn)[12]。

又如國內將這一技術應用于數字人數據的獲取，Li等[26]開發(fā)出了一套基于序列切片實時成像的三維重建系統(tǒng)，獲得小鼠全腦的微米級分辨率的三維結構。也有學者利用該技術通過將人體正中神經三維重建實現(xiàn)了感覺和運動神經三維可視化。研究者將正中神經標本用液氮固定，切片厚度為20 μm。用乙酰膽堿酯酶組織化學染色，三維重建后很好的顯現(xiàn)了運動神經纖維和感覺神經纖維[24]。此外，通過結合連續(xù)切片技術與免疫組化、免疫熒光技術(特別是多重標記的技術)，還可以對感興趣的目標抗原(蛋白、多肽等)進行定向定量研究，如利用Array tomography(連續(xù)超薄切片與多重免疫熒光標記的結合)技術首次檢測了單個神經突觸的蛋白質組成、利用超薄切片重建出人體視神經頭的篩狀板和鞏膜通道高分辨的三維結構、利用連續(xù)超薄切片技術對斑馬魚視神經頂蓋中的基因神經元類型進行了特性描述等[27-29]。這些研究對提高醫(yī)學圖像的利用價值有深遠的意義，而且對提高臨床診斷的準確性和正確性有很大益處。表1總結了基于組織學連續(xù)切片的三維重建在醫(yī)學研究中的一些應用。

表1　基于組織學連續(xù)切片的三維重建的應用

3　結　語

三維成像和可視化技術子在科研中具有重要的功能，讓科學家可以從多角度研究組織結構。雖然目前出現(xiàn)很多新的三維成像和可視化技術，但是基于組織學切片的光學顯微鏡圖像的三維重建幾乎是任何類型的組織用于獲得高分辨率重建的最好方法之一。此外，這種技術對于標本的最大大小不具有限制性,甚至整個人體可以切成組織切片而進行三維重建。但目前組織學切片三維重建方法還面臨許多問題，如勞動強度大，精確配準難、軟件的算法和智能化水平還有待提高等。未來還需要多領域和多學科的深入合作探索，實現(xiàn)理論和算法的突破，提高軟件的智能化水平，滿足基于組織學切片的三維重建研究的需要。

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Advances in three-dimensional reconstruction of serial histological sections

DANG Hai-xia1, LING Chun-yan1, CHEN Hong-tao2

(1.SchoolofStomatology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China;2.DepartmentofStomatology,theAffiliatedStomatologicalHospitalofDalianMedicalUniversity，Dalian116021，China)

Three-dimensional (3D) reconstruction of series histological sections is one of the most powerful methods for accurate high-resolution representation of almost any type of tissue structures. It has been widely applied in biological sciences. We introduced 3D reconstruction method and 3D reconstruction software. Moreover, we put forward advantages of 3D reconstruction technique of series histological sections and its application in medical research.

histological serial sections; computer; three-dimensional reconstruction

黨海霞(1987-)，女，山西呂梁人，碩士研究生。E-mail：779021519@qq.com

陳洪濤，副主任醫(yī)師。E-mail：chenhtdsh@163.com

??述

10.11724/jdmu.2016.05.22

R445.9

A

1671-7295(2016)05-0506-05

2016-03-22;

2016-09-11)