余福恒，李仲娟，，陳敏，蔡小康，廖進(jìn)齊，譚婭玲 (.黃石市東方社區(qū)服務(wù)中心，湖北黃石435000；.湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北黃石435003)

·論著·

氧化石墨烯衍生物對L6細(xì)胞活性的影響

余福恒1，李仲娟1，2，陳敏2，蔡小康2，廖進(jìn)齊2，譚婭玲2(1.黃石市東方社區(qū)服務(wù)中心，湖北黃石435000；
2.湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北黃石435003)

目的研究氧化石墨烯(GO)衍生物對L6細(xì)胞活性的影響。方法原代的L6細(xì)胞經(jīng)過1 d或3 d培養(yǎng)，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并采取電子圖片保存；收集對數(shù)期成熟的L6細(xì)胞，MTT法測定細(xì)胞增殖活性；對數(shù)期成熟的L6細(xì)胞，經(jīng)GO衍生物3 d的刺激培養(yǎng)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA方法測定腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)。結(jié)果原代L6經(jīng)過3 d培養(yǎng)，80%以上細(xì)胞分化為成熟的L6細(xì)胞；0.3μg/m LGO衍生物(GO-L和GO-D)經(jīng)過3 d刺激，GO-L刺激細(xì)胞增殖的OD值為(0.52±0.28)，GO-D刺激細(xì)胞增殖的OD值為(0.81± 0.34)，兩者與對照細(xì)胞OD值(0.18±0.06)比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.05，P＜0.01)；其中D型衍生物對L6細(xì)胞增殖活性強(qiáng)于L型衍生物，兩者之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.54，P＜0.05)；L型衍生物和D型衍生物均能誘導(dǎo)L6細(xì)胞分泌TNF-α[(18.6±5.36)vs(24.9±8.86)]和少量IFN-γ[(14.3±3.78)vs(13.8±2.62)]。但I(xiàn)FN-γ分泌兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.82，P＞0.05)。結(jié)論GO衍生物能誘導(dǎo)L6細(xì)胞活化和分泌TNF-α，可能會影響L6細(xì)胞中糖的代謝與調(diào)節(jié)。

氧化石墨烯；細(xì)胞增殖；腫瘤壞死因子-α；干擾素-γ

氧化石墨烯(graphene oxide，GO)的單原子層結(jié)構(gòu)以及其相對較大的表面積使其成為藥物載體的較佳選擇[1]。它不僅可以吸附芳香類藥物也可以負(fù)載疏水性藥物，這對于難溶于水的藥物劑型的設(shè)計(jì)具有重大的意義[2]。最近，GO在聚乙二醇的修飾后作為靶向藥物應(yīng)用在不同類型細(xì)胞，Liu等[3]就曾用修飾后的GO作為抗癌藥物的載體進(jìn)行抗直腸癌細(xì)胞。王潔等[4]綜合考察了GO對大鼠的干細(xì)胞活性。Yang等[5]研制出了多重靶向的GO阿霉素藥物體系，用于抗乳腺癌細(xì)胞。作為新型的醫(yī)藥納米材料GO對腫瘤細(xì)胞的研究較多，但GO衍生物的對正常細(xì)胞活性的評價(jià)并沒有很多的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過石墨烯衍生物(L型衍生物GO-L和D型衍生物GO-D)對L6肌肉細(xì)胞生長成熟狀況、細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞因子的分泌三方面綜合考察，探討石墨烯衍生物對L6肌肉細(xì)胞分化成熟過程中的影響，為將來石墨烯衍生物在腎病糖尿病等疾病的診斷和治療中的應(yīng)用提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試藥手性修飾的GO衍生物由武漢理工大學(xué)分子材料實(shí)驗(yàn)室友情提供。小鼠原代L6細(xì)胞均購自武漢細(xì)胞保存中心，臺盼藍(lán)、BSS液、小牛血清和DMEM-F12培養(yǎng)液購自GIBCO公司，實(shí)驗(yàn)室自行配制使用。胰蛋白酶、MTT購自上海博谷生物科技有限公司。培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板、6孔培養(yǎng)板和細(xì)胞培養(yǎng)用的吸頭購自美國Costar公司。二甲基亞砜購自Sigma公司。

1.2 儀器湖南湘儀臺式高速冷凍離心機(jī)，蘇州凈化二級生物安全柜BHC-1300IIB2，上海三申醫(yī)療壓力蒸汽滅菌器，美國ThermoFisher賀利氏CO2培養(yǎng)箱，美國伯樂DNM-9602型酶標(biāo)儀，日本OLYMPUS CKX41倒置生物顯微鏡及OLYMPUS 1X74倒置熒光顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 L6細(xì)胞的培養(yǎng)[6]原代L6細(xì)胞按105個(gè)細(xì)胞/孔分別加入6孔板，用DMEM-F12培養(yǎng)液置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含10%胎牛血清和雙抗(100U/m L青霉素和100mg/m L硫酸鏈霉素)，細(xì)胞生長至整個(gè)瓶底面積的80%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT法檢測細(xì)胞活性[7]在96孔培養(yǎng)板中，分別加入0.3μg/m L濃度GO-L或GO-D液并按105個(gè)細(xì)胞/孔進(jìn)行混合培養(yǎng)66 h后加20μLMTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入150μL二甲基亞砜振蕩10m in， 490 nm處測吸光度(opticaldensity，OD)值。

1.3.3 細(xì)胞因子的測定TNF-α(或INF-γ)的檢測按說明書進(jìn)行。取包被抗單克隆抗體于96孔酶標(biāo)板，加入100μL細(xì)胞培養(yǎng)上清或已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗體，37℃孵育50m in，洗3次。再加入100μL酶標(biāo)抗抗體繼續(xù)孵育1 h，洗滌后加入等量底物液，室溫孵避光15m in，加入終止液。450 nm測定光密度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本細(xì)胞因子水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。不同手性GO組與對照組的差異或不同手性GO組之間的差異采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 L6細(xì)胞生長的觀察圖1是L6細(xì)胞的原代細(xì)胞與成熟L6細(xì)胞的生長狀況對比，從圖片可以看出，原代L6細(xì)胞大多呈梭形或不規(guī)則多邊形，緊貼于培養(yǎng)瓶底部發(fā)生延性生長，培養(yǎng)3 d后，成熟L6細(xì)胞較原代細(xì)胞數(shù)量有所增加，沒有成團(tuán)生長的細(xì)胞且達(dá)到培養(yǎng)瓶底部平面的80%以上，單個(gè)L6細(xì)胞可以邊界清晰以梭形為主，立體感強(qiáng)，細(xì)胞核小且細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)肌性結(jié)構(gòu)。

圖1 L6細(xì)胞的生長對比

2.2 GO衍生物對L6細(xì)胞活性的影響圖2所示，0.3μg/m LGO衍生物能促進(jìn)L6細(xì)胞增殖，GO-L增殖活性[n=20，OD=(0.52±0.28)]低于GO-D[n=20，OD= (0.81±0.34)]，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.54，P＜0.05)。GO-L和GO-D增殖活性與對照組[n=20，OD=(0.18±0.06)]比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 6.05，P＜0.01)。

2.3 GO衍生物對L6肌肉細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的影響圖3A顯示(n=20)，GO衍生物能誘導(dǎo)L6肌肉細(xì)胞釋放TNF-α，其中D型衍生物TNF-α的表達(dá)水平(24.9±8.86)強(qiáng)于L型衍生物TNF-α的表達(dá)水平(18.6±5.36)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.82，P＜0.05)。圖3B(n=20)顯示，GO衍生物能誘導(dǎo)L6肌肉細(xì)胞分泌少量IFN-γ，L型衍生物IFN-γ(14.3±3.78)和D型衍生物IFN-γ的表達(dá)水平(13.8±2.62)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.82，P＞0.05)，但對于對照組IFN-γ的表達(dá)水平(2.1±0.72)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.64，P＜0.05)。

圖2 0.3μg/m L的GO衍生物對L6細(xì)胞生長活性的測定

圖3 0.3μg/m L的GO衍生物對L6細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響

3 討論

GO衍生物是單原子結(jié)構(gòu)，因其表面積大，很早就被作為藥物載體開發(fā)[8]。楊永崗等[9]通過GO的細(xì)胞毒性研究發(fā)現(xiàn)，GO濃度降至100μg/m L時(shí)，對細(xì)胞毒性較低，40μg/m L濃度的GO對細(xì)胞僅有少許毒性，且細(xì)胞具有可逆性的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)所用的GO濃度為0.3μg/m L，結(jié)果顯示，GO衍生物對于原代L6肌肉細(xì)胞的增殖成熟有積極作用，GO衍生物(GO-L和GO-D)能促進(jìn)成熟的L6肌肉細(xì)胞增殖活性，并且L型GO要弱于D型的作用。這可能與細(xì)胞在貼壁生長時(shí)，GO衍生物充當(dāng)了其支撐物的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。

近年來的研究證明骨骼肌具有分泌細(xì)胞因子的功能[10]，其中TNF-α、IL-18和IL-6在參與骨骼肌能源物質(zhì)代謝、修復(fù)與合成的調(diào)控作用[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GO烯衍生物能誘導(dǎo)成熟的L6肌肉細(xì)胞分泌TNF-α和少量IFN-γ，D型衍生物對L6肌肉細(xì)胞釋放TNF-α作用較強(qiáng)。由于L6肌肉細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于糖尿病中胰島素抵抗細(xì)胞模型機(jī)理的研究[12-14]，因此，TNF-α的釋放可能與L6肌肉細(xì)胞糖代謝相關(guān)[15]。

IFN-γ在肌肉細(xì)胞中的作用尚未見報(bào)道，本次實(shí)驗(yàn)也沒有對L6肌肉細(xì)胞中調(diào)控IFN-γ的蛋白作進(jìn)一步研究，因此，L6肌肉細(xì)胞分泌少量IFN-γ的作用也不清楚。今后，將會對細(xì)胞因子相關(guān)蛋白的信號途徑作深入研究，從而揭示GO衍生物在疾病研究中的新應(yīng)用。

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Effect of graphene oxide derivatives on the activity of L6 cells.

YU Fu-heng1,LIZhong-juan1,2,CHEN Min2,CAI Xiao-kang2,LIAO Jin-qi2,TAN Ya-Ling2.1.Huangshi Oriental Community Service Center,Huangshi 435000,Hubei, CHINA;2.SchoolofMedicine,HubeiPolytechnic University,Huangshi435003,Hubei,CHINA

Objective To investigate the effectof graphene oxide(GO)derivatives on the activity of L6 cells. M ethods Morphologies of primary L6 cells,which had been cultured for 1 day or 3 days,and the cellmorphology were observed w ith inverted fluorescentmicroscope and saved as electronic graphics.Mature L6 cells in logarithmic phasewere collected.Cellproliferation activity was detected by MTT assay.Mature L6 cells in logarithm ic phase stimulated w ith GO derivatives had been cultured for 3 days,then cell culture supernatantswere collected.The serum tumor necrosis factor alpha(TNF-α)and interferon gamma(INF-γ)levelswere determined by ELISA.Results Over 80% of primary L6 cells had been cultured for 3 days differentiated into mature ones.0.3μg/m L GO derivatives(GO-L and GO-D)were stimulated by 3 d.OD value for cell proliferation stimulated by GO-L and GO-D was(0.52±0.28),(0.81±0.34),respectively.Both had significant differences compared w ith OD value for control cells[(0.18±0.06),F= 6.05,P＜0.01].Activity of GO-D on L6 cells proliferation was significantly higher than GO-L(F=4.54,P＜0.05).Both GO-L and GO-D could induce L6 cells to secrete TNF-α[(18.6±5.36)and(24.9±8.86)respectively]and a smallamount of IFN-γ[(13.8±2.62)and(14.3±3.78)respectively].But therewere no significant differences in IFN-γbetween the GO-L and GO-D(F=0.82,P＞0.05).Conclusion GO derivatives can induce L6 cellactivation and secretion of TNF-α, both ofwhichmay affect themetabolism and regulation of sugar in L6 cells.

Graphene oxide derivatives;Cell proliferation;Tumor necrosis factor alpha(TNF-α);Interferon gamma(IFN-γ)

R730.3

A

1003—6350（2016）16—2583—03

2016-03-03)

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2016.16.002

湖北省科技項(xiàng)目(編號：2011Cdc116)；湖北省黃石市科技項(xiàng)目(編號：黃科農(nóng)[2012]1號)；教育部留學(xué)生啟動資金(編號：46-2)

李仲娟。E-mail：1525677891@qq.com