劉小麗 王斌 江元山 梁建生 袁紅 張麗華 周燕飛 許慧瓊

430015武漢市疾病預(yù)防控制中心消毒與病媒生物防制所（劉小麗、王斌、梁建生、許慧瓊），病原生物檢測(cè)所（江元山）；武漢市第一醫(yī)院護(hù)理部（袁紅）；黃陂區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)院感染管理科（張麗華）；武漢市第五醫(yī)院醫(yī)院感染管理科（周燕飛）

·論著·

武漢地區(qū)門(mén)診皮膚軟組織感染患者中甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌PVL基因攜帶及耐藥性檢測(cè)

劉小麗 王斌 江元山 梁建生 袁紅 張麗華 周燕飛 許慧瓊

430015武漢市疾病預(yù)防控制中心消毒與病媒生物防制所（劉小麗、王斌、梁建生、許慧瓊），病原生物檢測(cè)所（江元山）；武漢市第一醫(yī)院護(hù)理部（袁紅）；黃陂區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)院感染管理科（張麗華）；武漢市第五醫(yī)院醫(yī)院感染管理科（周燕飛）

目的 探討從武漢地區(qū)門(mén)診皮膚軟組織感染（SSTI）患者中分離的甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）攜帶殺白細(xì)胞毒素（PVL）基因及耐藥特征。方法 收集2011—2013年在武漢市5所醫(yī)療機(jī)構(gòu)門(mén)診就診SSTI患者中分離的182株MSSA，采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，多重PCR法檢測(cè)mecA基因和PVL基因。結(jié)果 182株MSSA中有65株P(guān)VL陽(yáng)性，陽(yáng)性率為35.71%。不同病種PVL陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=49.76，P=0.00），其中癤/癰（7/7）、毛囊炎（3/3）、膿腫（55.53%，30/57）和膿皰瘡（2/4）的檢出率較高。PVL 陽(yáng)性患者年齡［（35.40±19.31）歲］小于 PVL陰性患者［（43.21±20.75）歲］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.50，P=0.01）。在65株P(guān)VL陽(yáng)性MSSA菌株中，耐藥率居前3位的依次是氨芐西林（87.69%）、青霉素（53.85%）、紅霉素（41.54%）。在117株P(guān)VL陰性MSSA菌株中，耐藥率居前3位的依次是克林霉素（26.50%）、青霉素（20.51%）、氨芐西林（12.82%）。PVL陽(yáng)性 MSSA 菌株對(duì)青霉素（χ2=21.19）、氨芐西林（χ2=97.97）、多西環(huán)素（χ2=11.61）、環(huán)丙沙星（χ2=8.07）、紅霉素（χ2=25.04）、慶大霉素（χ2=10.86）的耐藥率高于 PVL陰性 MSSA菌株，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 武漢地區(qū)門(mén)診MSSA SSTI患者中，PVL陽(yáng)性率較高，對(duì)大多數(shù)β內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，經(jīng)驗(yàn)治療可選擇氟氯西林、復(fù)方磺胺甲 唑片或多西環(huán)素。

軟組織感染；金黃色葡萄球菌；微生物敏感性試驗(yàn)；殺白細(xì)胞毒素；PVL基因

金黃色葡萄球菌是一種主要人類致病菌，它可引起輕微的皮膚軟組織感染（skin and soft-tissue infections，SSTI），亦可引起壞死性肺炎和中毒休克綜合征等中毒相關(guān)性疾病。金黃色葡萄球菌引起SSTI和嚴(yán)重的深部感染多與菌株攜帶殺白細(xì)胞毒素（Panton-Valentine leukocidin，PVL）基因有關(guān)，甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin-sensitive Staphylococcusaureus，MSSA）和社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（community-acquired methicillinresistantStaphylococcus aureus，CA-MRSA）均可攜帶PVL基因，兩者之間關(guān)系密切，PVL陽(yáng)性MSSA是CA-MRSA的基因儲(chǔ)菌庫(kù)［1］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)PVL的MSSA引起的感染越來(lái)越多，甚至可以引起死亡［2］。本研究采集門(mén)診SSTI患者標(biāo)本，以期了解武漢地區(qū)門(mén)診SSTI患者中MSSA攜帶PVL基因及與耐藥性關(guān)系，為門(mén)診SSTI患者的抗菌藥物合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

一、菌株來(lái)源及鑒定

選擇2011—2013年在武漢市第一醫(yī)院、武漢市第五醫(yī)院、黃陂區(qū)人民醫(yī)院、江漢區(qū)萬(wàn)松街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心、江岸區(qū)西馬街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心皮膚科、外科門(mén)診就診SSTI患者，對(duì)需切開(kāi)引流或病灶破潰患者進(jìn)行采樣，如果病灶沒(méi)有破損且不需切開(kāi)引流，則不予采樣，經(jīng)患者知情同意后，由門(mén)診換藥室護(hù)士以無(wú)菌棉拭子采集病灶深部的膿液或分泌物，共采集標(biāo)本1 400份，同時(shí)填寫(xiě)研究小組專門(mén)設(shè)計(jì)的《醫(yī)院門(mén)診病人換藥情況問(wèn)卷調(diào)查表》。按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第3版）所規(guī)定的方法分離培養(yǎng)和鑒定出金黃色葡萄球菌。MSSA的篩查用頭孢西丁（30 μg/片）紙片擴(kuò)散法，并以PCR檢測(cè)MecA基因確定。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

二、藥敏試驗(yàn)

用紙片擴(kuò)散法對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行11種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)，根據(jù)美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）相關(guān)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)與操作規(guī)范（2010版）進(jìn)行操作和結(jié)果判定［3］，抗菌藥物包括青霉素、頭孢西丁、氨芐西林、復(fù)方磺胺甲 唑片、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、紅霉素、克林霉素、慶大霉素、四環(huán)素、利福平，均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

三、基因檢測(cè)

1.細(xì)菌DNA模板制備：挑取金黃色葡萄球菌分離株轉(zhuǎn)入700 μl液體LB培養(yǎng)基中，37℃搖床150轉(zhuǎn)/min振搖過(guò)夜培養(yǎng)，離心收集菌落，棄上清后加入 TE 緩沖液（pH 8.0）300 μl混懸，加入 1 g/L 葡萄球菌溶菌酶5 μl消化細(xì)菌細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱孵育2 h。參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取細(xì)菌DNA，每個(gè)PCR反應(yīng)液中加入1.5 μl細(xì)菌DNA洗脫液。

2.多重PCR鑒定PVL陽(yáng)性MSSA分離株：采用 McClure 等［4］設(shè)計(jì)的引物（MecA310）和反應(yīng)條件對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行分子鑒定，檢測(cè)mecA基因，引物上游 5′-GTAGAAATGACTGAACGTCCGATA A-3′，下游：5′-CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTA A-3′（310 bp）。參照J(rèn)arraud等［5］設(shè)計(jì)的PVL引物和反應(yīng)條件檢測(cè)PVL基因，PVL上游：5′-ATCATTA GGTAAAATGTCTGGACATGATCCA-3′，PVL 下游：5′-GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC-3′（433bp）。若mecA陰性、PVL陽(yáng)性，即判定為PVL陽(yáng)性MSSA分離株；若mecA陰性、PVL陰性，則為PVL陰性MSSA分離株。見(jiàn)圖1。

圖1 PCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌攜帶PVL和mecA基因的電泳圖16SrRNA（+）為金黃色葡萄球菌。M：100bpDNAladder；1～4：PVL（+）MSSA；5、8：PVL（-）MSSA；6、7、9：PVL（-）MRSA；10：空白對(duì)照

四、統(tǒng)計(jì)分析

使用WHO推薦的WHONET5.4軟件進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析，同時(shí)用SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般情況

本研究共分離203株金黃色葡萄球菌，其中21株MRSA、182株MSSA。分離出MSSA的182例SSTI患者中，男 106例（58.24%），女 76例（41.76%），年齡11個(gè)月至91（40.42±2.05）歲。病種包括：膿腫57例（31.32%），甲溝炎47例（25.82%），外傷后化膿感染28例（15.38%），表淺皮膚感染18例（9.89%），癤/癰7例（3.85%），膿皰瘡 4例（2.20%），膿性指頭炎 4例（2.20%），毛囊炎 3例（1.65%），丹毒 3例（1.65%）和其他11例（6.04%）。

二、PVL基因檢出情況

182株MSSA中有65株P(guān)VL陽(yáng)性，陽(yáng)性率為35.71%。PVL陽(yáng)性SSTI患者年齡［（35.40±19.31）歲］小于 PVL陰性患者［（43.21±20.75）歲］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.50，P=0.01）。不同病種患者PVL陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其中癤/癰、毛囊炎、膿腫和膿皰瘡的檢出率較高。不同性別患者PVL陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

三、PVL與MSSA的耐藥性分析

65株P(guān)VL陽(yáng)性MSSA中，耐藥率居前3位的依次是氨芐西林（87.69%）、青霉素（53.85%）、紅霉素（41.54%）。117株P(guān)VL陰性MSSA，耐藥率居前3位的依次是克林霉素（26.50%）、青霉素（20.51%）、氨芐西林（12.82%）。PVL陽(yáng)性MSSA對(duì)青霉素、氨芐西林、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、紅霉素、慶大霉素的耐藥率明顯高于PVL陰性MSSA，尤其是對(duì)β內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥率明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表1 182例皮膚軟組織感染患者中甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌PVL基因檢出情況

討 論

表2 PVL陽(yáng)性與PVL陰性甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）對(duì)抗菌藥物敏感性比較［株（%）］

PVL是一種能募集多形核細(xì)胞和單核細(xì)胞并激發(fā)其凋亡和裂解的穿孔外毒素蛋白［6］，PVL陽(yáng)性MSSA不僅可引起輕微的SSTI，也可引起皮膚感染的爆發(fā)，嚴(yán)重者可引起死亡等［2，7］。MSSA 可通過(guò)噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用獲得PVL基因，然后通過(guò)轉(zhuǎn)座子SCCmec基因變成攜帶 PVL 基因的 MRSA［8］?？梢?jiàn)控制攜帶PVL基因的MSSA至關(guān)重要，如有“蜘蛛樣咬傷”表現(xiàn)，有膿腫反復(fù)發(fā)作，β內(nèi)酰胺類抗菌藥物療效差，存在CA-MRSA的危險(xiǎn)因素，應(yīng)該考慮CAMRSA或PVL陽(yáng)性MSSA［9］。本研究結(jié)果顯示，從門(mén)診SSTI患者中分離的MSSA菌株中PVL基因陽(yáng)性率為35.71%，PVL陽(yáng)性患者年齡小于PVL陰性患者，癤/癰、毛囊炎、膿腫和膿皰瘡的PVL檢出率較高，與國(guó)內(nèi)外MSSA的研究結(jié)果類似［10-11］，但普遍高于國(guó)內(nèi)外報(bào)道MRSA中PVL陽(yáng)性率（28.6%和26.1%）［12-13］。

本次研究顯示，PVL陽(yáng)性MSSA菌株對(duì)β內(nèi)酰胺類抗菌藥物和紅霉素類耐藥率較高，如氨芐西林（87.69%）、青霉素（53.85%）、紅霉素（41.54%），但PVL陰性MSSA菌株對(duì)氨芐西林、青霉素和紅霉素的耐藥率僅為20.51%、12.82%和10.26%，因此在臨床上應(yīng)用時(shí)要慎重選擇β內(nèi)酰胺類和紅霉素類抗菌藥物來(lái)治療癤/癰、毛囊炎和膿腫等SSTI，可選擇半合成的耐青霉素酶青霉素，如氟氯西林［9］。

克林霉素有很好的組織穿透能力，英國(guó)社區(qū)MRSA感染的診斷與處理指南中克林霉素可用于治療MSSA感染［9］。在歐洲，克林霉素是SSTI的唯一推薦用藥［14］。而本研究結(jié)果顯示，PVL陽(yáng)性和陰性MSSA菌株對(duì)克林霉素的敏感率只有21.54%和30.77%，提示我國(guó)門(mén)診MSSA SSTI患者應(yīng)慎用克林霉素進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)治療。

美國(guó)感染病學(xué)會(huì)指南推薦復(fù)方磺胺甲 唑片或多西環(huán)素用于門(mén)診SSTI患者經(jīng)驗(yàn)治療用藥［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，PVL陰性或陽(yáng)性MSSA菌株對(duì)復(fù)方磺胺甲 唑片、多西環(huán)素、慶大霉素、利福平的敏感率都很高，但利福平單獨(dú)應(yīng)用易產(chǎn)生耐藥性，因此利福平可以作為輔助藥物與其他抗菌藥物聯(lián)用，以避免導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。

綜上所述，武漢地區(qū)門(mén)診MSSA SSTI患者中PVL陽(yáng)性率較高，尤其癤/癰、毛囊炎、膿腫和膿皰瘡患者的PVL檢出率最高，PVL陽(yáng)性MSSA的耐藥性普遍高于PVL陰性MSSA，且對(duì)大多數(shù)β內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥率明顯升高，經(jīng)驗(yàn)治療可選擇氟氯西林、復(fù)方磺胺甲 唑片或多西環(huán)素。

志謝 感染項(xiàng)目組所有工作人員的辛勤付出，武漢市疾病預(yù)防控制中心熊燕主任、陳智副主任技師，江漢區(qū)萬(wàn)松街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心楊志兵主任、江岸區(qū)西馬街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心夏志忠主任、江漢區(qū)疾病預(yù)防控制中心劉建龍科長(zhǎng)、江岸區(qū)疾病預(yù)防控制中心丁曉紅副主任、黃陂區(qū)疾病預(yù)防控制中心韓墨主任在項(xiàng)目實(shí)施過(guò)程中的支持與幫助

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Prevalence of Panton-Valentine leukocidin genes and antimicrobic resistance inStaphylococcus aureusisolates from outpatients with skin and soft-tissue infections in Wuhan city

Liu Xiaoli,Wang Bin,Jiang Yuanshan,Liang Jiansheng,Yuan Hong,Zhang Lihua,Zhou Yanfei,Xu Huiqiong

Department of Disinfection and Pest Control,Wuhan Centers For Disease Prevention and Control,Wuhan 430015,China（Liu XL,Wang B,Liang JS,Xu HQ）;Institute of Pathogen Detection,Wuhan Centers For Disease Prevention and Control,Wuhan 430015,China（Jiang YS）;Department of Nursing,Wuhan No.1 Hospital,Wuhan 430022,China（Yuan H）;Department of Hospital Infection Management,Huangpi People′s Hospital,Wuhan 430300,China （Zhang LH）;Department of Hospital Infection Management,Wuhan Fifth Hospital,Wuhan 430050,China（Zhou YF）

Objective ToestimatetheprevalenceofPanton-Valentineleukocidin（PVL）genesandantimicrobial resistance in methicillin-sensitiveStaphylococcus aureus（MSSA）isolateds from outpatients with skin and soft-tissue infections （SSTIs）in Wuhan city.Methods A total of 182 MSSA isolates were collected from outpatients with SSTIs in 5 different hospitals in Wuhan city between 2011 and 2013.The Kirby-Bauer′s disk diffusion method was used to evaluate antimicrobial susceptibility of the MSSA isolates,and multiplex PCR was performed to detect mecA and PVL genes in these isolates.Results Of the 182 MSSA isolates,65（35.71%）carried PVL genes.The positive rate of PVL genes was significantly different among patients with different diseases （χ2=49.76,P=0.00）,and relatively higher in patients with furuncles/carbuncles（7/7）,folliculitis（3/3）,abscesses（55.53%,30/57）or impetigo（2/4）.The age of patients with PVL-positive MSSA infection was significantly younger than that with PVL-negative MSSA infection（35.40±19.31 years vs.43.21±20.75years,t=2.50,P=0.01）.Among65PVL-positiveMSSAisolates,therateofresistancetoclindamycinwashighest（87.69%）,followedbythattopenicillin（53.85%）anderythromycin（41.54%）.Thefrequencyofresistancetoclindamycinwas highestin117PVL-negativeMSSAisolates,followedbythattopenicillin（20.51%）andampicillin（12.82%）.Furthermore,there was a significantincrease in the rate of resistance to penicillin（χ2=21.19）,ampicillin（χ2=97.97）,doxycycline（χ2=11.61）,ciprofloxacin（χ2=8.07）,erythromycin（χ2=25.04）and gentamicin（χ2=10.86）in PVL-positive MSSA isolates compared with PVL-negative MSSA isolates（allP＜0.05）.Conclusions MSSA isolates from outpatients with SSTIs in Wuhan city are resistant to most β-lactam antibiotics.Flucloxacillin,compound sulfamethoxazole tablets or doxycycline is recommended for empirical treatment of PVL-positive MSSA infections.

Soft tissue infections;Staphylococcus aureus;Microbial sensitivity tests;Panton-Valentine leukocidin;PVL genes

Liang Jiansheng,Email:wh-ljs@sohu.com

梁建生，Email:wh-ljs@sohu.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.03.005

武漢市衛(wèi)生局公共衛(wèi)生科研項(xiàng)目（WG12D03）

Fund program:Public Health Research Program of Wuhan Municipal Health Bureau（WG12D03）

2015-08-12）

（本文編輯：周良佳 顏艷）