胡彬 倪娜娜 呂雅琳 陳浩 劉毅 孫建方

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所病理科（第一作者現(xiàn)在武漢市第一醫(yī)院皮膚科，430022）

·論著·

Cbl-b基因沉默對(duì)小鼠原代淋巴細(xì)胞免疫活性影響的研究

胡彬 倪娜娜 呂雅琳 陳浩 劉毅 孫建方

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所病理科（第一作者現(xiàn)在武漢市第一醫(yī)院皮膚科，430022）

目的 體外初步研究Cbl-b基因經(jīng)特異性siRNA沉默后對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞免疫活性的影響。方法摘取C57BL/6小鼠的脾臟，體外無菌分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)。通過EntransterTM-R4000試劑將Cbl-b siRNA轉(zhuǎn)染入小鼠原代淋巴細(xì)胞以沉默細(xì)胞內(nèi)Cbl-b的表達(dá)。轉(zhuǎn)染72 h后通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中干擾素γ（INF-γ）及腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達(dá)量。通過與B16F10黑素瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，研究Cbl-b基因沉默后的淋巴細(xì)胞對(duì)B16F10黑素瘤細(xì)胞免疫殺傷活性的影響。結(jié)果 Cbl-b siRNA成功轉(zhuǎn)染進(jìn)小鼠原代淋巴細(xì)胞并能有效沉默細(xì)胞內(nèi)Cbl-b的表達(dá)。與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組及空白組相比，轉(zhuǎn)染Cbl-b siRNA的淋巴細(xì)胞IFN-γ、TNF-α分泌量增加（P<0.05）。共培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果顯示，Cbl-b siRNA轉(zhuǎn)染組比轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組能更高效地殺傷小鼠B16F10細(xì)胞。結(jié)論 Cbl-b基因沉默能夠促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞INF-γ、TNF-α分泌能力，并能增強(qiáng)淋巴細(xì)胞對(duì)B16F10黑素瘤細(xì)胞的體外免疫殺傷作用。

黑色素瘤；基因沉默；小鼠；淋巴細(xì)胞；RNA，小分子干擾；免疫活性；Cbl-b

惡性黑素瘤腫瘤微環(huán)境中存在較多導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的負(fù)性調(diào)控因素，導(dǎo)致免疫治療的臨床有效率仍較低。研究發(fā)現(xiàn)，泛素連接酶Cbl-b（casitas B cell lymphoma-b）是調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化的關(guān)鍵因子，在維持外周T細(xì)胞免疫耐受方面具有作用。Cbl-b在T細(xì)胞的活化過程中就起到了“閘”的作用，可能是惡性黑素瘤免疫治療的理想靶位［1］。我們用Cbl-b基因特異性siRNA成功沉默小鼠原代淋巴細(xì)胞Cbl-b基因的表達(dá)，研究Cbl-b基因沉默對(duì)小鼠原代淋巴細(xì)胞增殖及免疫活性及殺傷活性的影響，為后續(xù)研究黑素瘤Cbl-b基因?yàn)榘邢虻拿庖咧委熃⒒A(chǔ)。

材料與方法

一、材料

C57BL/6野生基因型小鼠，雌性，購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心（合格證號(hào)：201512801）。淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司，小鼠干擾素 γ（INF-γ）、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）ELISA試劑盒（北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司），培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的1640（美國(guó)Gibco公司）并添加100 U/ml青霉素和100 g/L鏈霉素（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），TrizolReagent（美國(guó)Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Fermentas公司），PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），Cbl-b單克隆抗體（sc-8006）（美國(guó)Santa Cruz公司），PVDF膜（美國(guó)Millipore公司），CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）。PCR引物由深圳華大基因科技有限公司合成，其余為國(guó)產(chǎn)分析純。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司），PCR儀（美國(guó)ABI公司），凝膠成像及分析裝置、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀、聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳槽、微型轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司），超純水儀（美國(guó)Millipore公司），電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。Cbl-b siRNA和陰性對(duì)照siRNA均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：從6周齡C57BL/6小鼠取出脾組織，D-Hanks液沖洗1次，含1%青霉素、鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗1次，磨碎后過濾。將過濾得到的液體以1∶1的比例與淋巴細(xì)胞分離液混合，1 118×g離心25 min后液體分為3層，取中間云霧狀細(xì)胞層。D-Hanks液洗2遍，將細(xì)胞重懸于含1640培養(yǎng)基（含90%RPMI 1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+20 μg/L IL-2）中，整個(gè)過程無菌操作，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。B16F10黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)及共培養(yǎng)均用1640培養(yǎng)基。

2.原代淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染：淋巴細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)2～3 d，至細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，用PBS洗滌細(xì)胞2次。用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋吹打細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，以2×108/L密度接種24孔板，每孔500 μl，按照 EntransterTM-R4000 說明書轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染組每孔加1 μl EntransterTM-R4000和50 pmol Cbl-b siRNA，陰性對(duì)照組每孔加等量EntransterTM-R4000和陰性對(duì)照siRNA，同時(shí)把未經(jīng)任何處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照組。

3.RT-PCR和蛋白印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Cbl-b的表達(dá)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞總RNA及總蛋白。其中RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增Cbl-b基因及內(nèi)參照β肌動(dòng)蛋白。RT-PCR所用Cbl-b正向引物：5′-GTCGCAGGACAGACGGAATC-3′，反向引物：5′-GAGCTGATCTGATGGACCTCA-3′。β 肌動(dòng)蛋白正向引物：5′-ATGACCCAAGCCGAGAAGG-3′，反向引物：5′-CGGCCAAGTCTTAGAGTTGTTG-3′。PCR 條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，63 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)28次；最后1次延伸72℃10 min。提取的各組細(xì)胞蛋白經(jīng)BCA法定量后進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)用1抗為1∶200稀釋的鼠抗Cbl-b，2抗為1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG。以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照，加入ECL顯色劑顯色后曝光成像。各目的基因和目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量以其與β肌動(dòng)蛋白的灰度值比值表示。

4.ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中IFN-γ和TNF-α的分泌量：參照ELISA試劑盒說明要求，轉(zhuǎn)染48 h后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，把標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋液和待測(cè)樣品分別加入酶標(biāo)板中，每孔0.1 ml。37℃反應(yīng)120 min后，加入0.1 ml生物素抗小鼠IFN-γ、TNF-α抗體工作液，37℃反應(yīng)60 min。加入親和素過氧化物酶復(fù)合物的工作液0.1 ml，37℃反應(yīng)30 min。每孔依次加入TMB顯色液，37℃避光反應(yīng)30 min，加入0.1 ml終止液，酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀450 nm測(cè)定吸光度（A值）。

5.CCK-8法檢測(cè)小鼠淋巴細(xì)胞對(duì)B16F10黑素瘤細(xì)胞的殺傷活性：轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞24 h后，將轉(zhuǎn)染組細(xì)胞、陰性對(duì)照組細(xì)胞分別與B16F10黑素瘤細(xì)胞按效靶比為 40∶1、20∶1、10∶1接種于 96孔板，每組3個(gè)復(fù)孔，體積各為100 μl。同時(shí)每個(gè)比例組均設(shè)相同數(shù)目單純轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞、陰性對(duì)照組細(xì)胞及單純腫瘤細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞組和靶細(xì)胞組，每孔100 μl。培養(yǎng)48 h后，CCK-8試劑盒測(cè)定各組淋巴細(xì)胞對(duì)小鼠B16F10黑素瘤細(xì)胞的殺傷作用。腫瘤細(xì)胞殺傷率（%）=（單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞的A值+單獨(dú)靶細(xì)胞的A值-效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞混合培養(yǎng)孔A值）/單獨(dú)靶細(xì)胞的A值×100%。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示。多組間比較采用方差分析，兩兩多重比較采用LSD法，小鼠淋巴細(xì)胞對(duì)B16F10黑素瘤細(xì)胞的殺傷作用比較采用兩因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Cbl-b基因mRNA表達(dá)水平

Cbl-b特異性siRNA轉(zhuǎn)染小鼠原代淋巴細(xì)胞48 h后，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)Cbl-b的相對(duì)表達(dá)水平（0.370±0.016）明顯低于陰性對(duì)照組（0.840±0.03）和空白對(duì)照組（0.850±0.015），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=480.78，P ＜ 0.01）。見圖 1。

二、蛋白印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Cbl-b基因蛋白表達(dá)水平

Cbl-b特異性siRNA轉(zhuǎn)染小鼠原代淋巴細(xì)胞48 h后，Cbl-b蛋白相對(duì)表達(dá)水平（0.460±0.022）明顯低于陰性對(duì)照組（0.740±0.006）和空白對(duì)照組（0.740±0.022），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=240.57，P ＜ 0.01）。見圖 2。

三、ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后淋巴細(xì)胞IFN-γ及TNF-α分泌改變

Cbl-b siRNA轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞48 h后，培養(yǎng)液中IFN-γ及TNF-α濃度在轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且轉(zhuǎn)染組IFN-γ及TNF-α濃度均顯著高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

四、小鼠淋巴細(xì)胞與B16F10黑素瘤細(xì)胞共培養(yǎng)

C57BL/6小鼠淋巴細(xì)胞與B16F10黑素瘤細(xì)胞混合培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞未貼壁時(shí)呈圓形，有核；約2～3h后開始貼壁生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形，核仁明顯；約12 h完全貼壁。淋巴細(xì)胞呈圓形，懸浮生長(zhǎng)，有集群生長(zhǎng)能力，能形成肉眼可見幾十到幾百個(gè)細(xì)胞成簇生長(zhǎng)，淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間有廣泛的緊密膜接觸。

圖1 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)Cbl-b siRNA轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞后Cbl-b mRNA的表達(dá)水平

圖2 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后淋巴細(xì)胞內(nèi)Cbl-b蛋白表達(dá)水平

五、CCK8法檢測(cè)小鼠淋巴細(xì)胞對(duì)B16F10黑素瘤細(xì)胞的殺傷作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的不同效靶比對(duì)淋巴細(xì)胞的殺傷活性有顯著影響（F=82.36，P＜0.01），效靶比為40∶1時(shí)，淋巴細(xì)胞的殺傷最強(qiáng)，顯著高于20∶1和 10∶1組（n=3，均P＜0.01）。轉(zhuǎn)染組淋巴細(xì)胞的殺傷活性顯著高于陰性對(duì)照組（F=31.54，P＜0.01）。見表 2。

討 論

惡性黑素瘤是惡性程度最高的皮膚腫瘤，其對(duì)放療和化療均不敏感，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高，臨床上迫切需要新的治療策略［2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，泛素連接酶Cbl-b是調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化的關(guān)鍵分子，在避免免疫無能、維持外周T細(xì)胞耐受力方面具有作用［3］。研究表明，Cbl-b在調(diào)節(jié)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著重要作用，可抑制TGF-β誘導(dǎo)的Foxp3+功能性Treg細(xì)胞的生成［4］，還可控制T細(xì)胞活化的預(yù)支，其缺失能使T細(xì)胞對(duì)低親和力配體產(chǎn)生反應(yīng)，這在以分化抗原為靶點(diǎn)的腫瘤免疫治療中相當(dāng)重要，對(duì)抗腫瘤的負(fù)性調(diào)控有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)旨在研究小鼠原代淋巴細(xì)胞經(jīng)過Cbl-b基因特異性siRNA轉(zhuǎn)染后，淋巴細(xì)胞抗腫瘤的細(xì)胞因子分泌情況，以及淋巴細(xì)胞與小鼠B16F10黑素瘤細(xì)胞混合培養(yǎng)后，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性的變化情況。

表1 ELISA法檢測(cè)Cbl-b siRNA轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞48 h后干擾素γ及腫瘤壞死因子α分泌水平比較（±s，ng/L）

表1 ELISA法檢測(cè)Cbl-b siRNA轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞48 h后干擾素γ及腫瘤壞死因子α分泌水平比較（±s，ng/L）

注：n=3

組別 干擾素γ 腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)染組 95.80±17.85 62.23±4.41陰性對(duì)照組 49.92±9.89 32.29±2.10空白對(duì)照組 51.40±10.89 27.14±5.89 F值 11.43 65.70 P值 ＜0.01 ＜0.01

表2 淋巴細(xì)胞對(duì)B16F10黑素瘤細(xì)胞的殺傷率（%，±s）

表2 淋巴細(xì)胞對(duì)B16F10黑素瘤細(xì)胞的殺傷率（%，±s）

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本研究利用合成并篩選出沉默效率最高的Cbl-b 基因特異性 siRNA［5］，體外轉(zhuǎn)染 Cbl-b siRNA至小鼠原代淋巴細(xì)胞，并觀察其Cbl-b基因沉默后的效應(yīng)。為了確保成功轉(zhuǎn)染Cbl-b基因特異性siRNA，通過RT-PCR在基因水平檢測(cè)基因的沉默情況，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)在蛋白水平檢測(cè)Cbl-b蛋白的表達(dá)下降情況，證實(shí)Cbl-b siRNA成功轉(zhuǎn)入小鼠原代淋巴細(xì)胞并有效沉默Cbl-b的表達(dá)。

抗腫瘤免疫主要是以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主，T細(xì)胞分為CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）和CD4+T輔助T細(xì)胞。CD4+T輔助細(xì)胞在接受抗原提呈細(xì)胞（APC）上的MHC-抗原復(fù)合物和共刺激分子雙信號(hào)刺激后，發(fā)生活化及克隆性增殖，釋放出多種細(xì)胞因子，其中以白細(xì)胞介素2（IL-2）、INF-γ、TNF-α等為主。這些細(xì)胞因子在活化、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞及B細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)中起重要作用。本試驗(yàn)通過ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后淋巴細(xì)胞分泌抗腫瘤性細(xì)胞因子INF-γ、TNF-α的分泌情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組淋巴細(xì)胞相對(duì)于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組INF-γ、TNF-α分泌量明顯增多，表明小鼠原代淋巴細(xì)胞經(jīng)過Cbl-b基因特異性siRNA沉默后更易活化，能產(chǎn)生更多抗腫瘤細(xì)胞因子，因而對(duì)腫瘤細(xì)胞可能有更強(qiáng)的殺傷作用。另外，在淋巴細(xì)胞對(duì)B16F10黑素瘤細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)中，我們將轉(zhuǎn)染過Cbl-b基因特異性siRNA的淋巴細(xì)胞與小鼠B16F10黑素瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察其對(duì)B16F10黑素瘤細(xì)胞的殺傷活性，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組腫瘤細(xì)胞殺傷率明顯高于陰性對(duì)照組，表明Cbl-b基因沉默在體外可以增強(qiáng)淋巴細(xì)胞對(duì)于黑素瘤細(xì)胞的殺傷作用，當(dāng)然，這種腫瘤抑制作用還需更為精確的方法，如3H-TdR摻入法等進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］Wallner S,Gruber T,Baier G,et al.Releasing the brake:targeting Cbl-b to enhance lymphocyte effector functions［J］.Clin Dev Immunol,2012,2012:692639.DOI:10.1155/2012/692639.

［2］Gray-Schopfer V,Wellbrock C,Marais R.Melanoma biology and new targeted therapy［J］.Nature,2007,445（7130）:851-857.DOI:10.1038/nature05661.

［3］Paolino M,Thien CB,Gruber T,et al.Essential role of E3 ubiquitin ligase activity in Cbl-b-regulated T cell functions［J］.J Immunol,2011,186（4）:2138-2147.DOI:10.4049/jimmunol.1003390.

［4］Venuprasad K.Cbl-b and itch:key regulators of peripheral T-cell tolerance［J］.Cancer Res,2010,70（8）:3009-3012.DOI:10.1158/0008-5472.CAN-09-4076.

［5］胡彬,倪娜娜,呂雅琳,等.Cbl-b基因shRNA干擾載體的構(gòu)建及鑒定［J］.中華皮膚科雜志,2015,48（3）:204-207.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.018.Hu B,Ni NN,Lv YL,et al.Construction and identification of a short hairpin RNA expression vector targeting the Cbl-b gene［J］.Chin J Dermatol,2015,48（3）:204-207.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.018.

In vitroeffects of Cbl-b gene silencing on immunocompetence of primary murine lymphocytes

Hu Bin,Ni Nana,Lyu Yalin,Chen Hao,Liu Yi,Sun Jianfang

Department of Pathology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（the current affiliation of the first author was Department of Dermatology,Wuhan No.1 Hospital,Wuhan 430222,China）

Objective To evaluatein vitroeffects of specific small interfering RNA （siRNA）-silencing of the casitas B-lineage lymphoma b （Cbl-b）gene on immunocompetence of primary murine lymphocytes.Methods Spleens were resected from C57BL/6 mice,and splenic lymphocytes were sterily isolated and culturedin vitro.These lymphocytes were divided into 3 groups:silence group transfected with a Cbl-b-specific siRNA using the EntransterTM-R 4000 reagent,negative control group transfected with a negative control siRNA using the EntransterTM-R4000 reagent,blank control group receiving no treatment.After additional culture for 72 hours,ELISA was performed to measure levels of interferon γ（IFN-γ） and tumor necrosis factor α （TNF-α） in culture supernatants of lymphocytes.In addition,the Cbl-b genesilenced lymphocytes were co-cultured with B16F10 melanoma cells to evaluate their immunocytotoxic effects on melanoma cells.ResultsSplenic lymphocytes were successfully isolated from C57BL/6 mice and culturedin vitro,and the Cbl-b-specific siRNA was also successfully transfected into the primary murine lymphocytes and effectively downregulated the expression of Cbl-b gene in them.Compared with the negative control group and blank control group,the silence group showed significantly increased supernatant levels of IFN-γ and TNF-α（allP<0.05）.The immunocytotoxic effect of lymphocytes on melanoma cells was significantly stronger in the silence group than in the negative control group.Conclusion Cbl-b gene silencing can promote secretion of IFN-γ and TNF-α by murine lymphocytes,and enhance their immunocytotoxic effects on B16F10 melanoma cellsin vitro.

Melanoma;Gene silencing;Mice;Lymphocytes;RNA,small interfering;Immunocompetence;Cbl-b

s:Sun Jianfang,Email:Sunjf57@163.com;Liu Yi,Email:dr.liuyi@gmail.com

孫建方，Email：Sunjf57@163.com；劉毅，Email：dr.liuyi@gmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.03.004

國(guó)家自然科學(xué)基金（81171513）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK2012506）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81171513）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK2012506）

2015-06-08）

（本文編輯：吳曉初）