向元俤，張碧波，吳 娟，姚 琦，李春麗，王陳榮

（武漢市第一醫(yī)院，1.耳鼻咽喉科，2.皮膚科，湖北武漢430022）

脯氨酸羥化酶PHD2在鼻咽癌患者中的表達及臨床意義

向元俤1，張碧波1，吳 娟2，姚 琦1，李春麗1，王陳榮1

（武漢市第一醫(yī)院，1.耳鼻咽喉科，2.皮膚科，湖北武漢430022）

目的 研究脯氨酸羥化酶2（prolyl hydroxylase2，PHD2）在鼻咽癌組織和癌旁組織中的表達差異及其臨床意義。方法 運用免疫組化染色及評分、熒光定量PCR方法檢測56例鼻咽癌組織及56例癌旁組織中PHD2的表達差異，分析PHD2表達水平與鼻咽癌患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系。結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示，在56例鼻咽癌組織中PHD2陽性率19.6%（11/56），其中“-”為45例，“+”為6例，“++”3例，“+++”2例；56例癌旁組織中PHD2陽性率為69.6%（39/ 56），“-”為17例，“+”為8例，“++”10例，“+++”21例，鼻咽癌組織的PHD2表達水平顯著低于癌組織（P＜0.05）；熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，在鼻咽癌組織中PHD2 mRNA的表達水平低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。PHD2的表達與患者年齡、性別、分化程度無相關(guān)性（P＞0.05），而與鼻咽癌的臨床分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性（P＜0.05）。結(jié)論 PHD2在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中可能起到抑制癌癥進展的作用，患者的PHD2表達水平可能與其分期及轉(zhuǎn)移有關(guān)。

PHD2； 鼻咽癌； 免疫組化； 表達水平； 臨床意義

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一種起源于鼻咽部的非淋巴細胞惡性腫瘤［1］，我國南方地區(qū)是全球鼻咽癌高發(fā)地區(qū)，男性發(fā)病率為0.02%～0.22%，女性發(fā)病率為0.08% ～0.10%（8～10）/ 10萬［2］。其具體病因尚不明確，既往研究表明其可能與原癌基因激活、EB病毒感染、抑癌基因的失活、環(huán)境因素改變等相關(guān)。目前，鼻咽癌的治療主要以手術(shù)、放射治療為主，治療的結(jié)果不僅與病理類型、病理分級和臨床分期密切相關(guān)，還與患者自身狀態(tài)及相關(guān)分子的表達相關(guān)。盡管NPC的發(fā)病機制在基因水平、環(huán)境因素等方面得到了深入的認(rèn)識，化療、放療等為主的綜合治療也有了長足的發(fā)展，但NPC的預(yù)后卻沒有得到明顯的改善。因此，繼續(xù)尋找新的生物標(biāo)志物及治療手段顯得尤為重要［3］。在多種惡性腫瘤發(fā)生過程中，缺氧誘導(dǎo)子（hypoxia inducible factor，HIF）調(diào)節(jié)的腫瘤代謝途徑轉(zhuǎn)化起著重要作用，越來越多的證據(jù)表明，HIF將成為腫瘤治療的靶點之一，降低HIF的蛋白水平成為一代難點及亮點。HIF蛋白的降解關(guān)鍵步驟是脯氨酸殘基的羥化，催化這一過程的關(guān)鍵限速酶是脯氨酸羥化酶（prolyl hydroxylase，PHD）［4］。PHD包括PHD1、PHD2、PHD3三種亞型，均含有α、β兩種亞基，現(xiàn)已證實，PHD2是HIF最重要的調(diào)控因子，PHD2在腫瘤細胞的增殖、侵襲等方面扮演了重要角色［5］。目前關(guān)于 PHD2在鼻咽癌中的研究尚不多見，因此，本文旨在PHD2在鼻咽癌組織和癌旁組織間的表達差異，為臨床相關(guān)研究及防治提供思路。

材料與方法

1 臨床研究對象

收取2008年5月至2013年9月我院腫瘤科及耳鼻喉科患者的鼻咽癌組織標(biāo)本，所有患者均經(jīng)過影像學(xué)、組織活檢確診。分別取鼻咽癌組織及正常癌旁組織（距離癌組織2.5cm以上，且鏡下未見病理異常）56例，年齡為33～78歲，平均年齡59±4.3歲。其中臨床分期I～II期41例，III～IV期15例；T1+T2期38例，T3+T4期18例；男性患者48例，女性患者8例；無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例；高分化19例，中低分化37例。所有病人均簽寫知情同意書。將所有標(biāo)本取材后，根據(jù)實驗處理不同，立即分為兩個部分，其中一部分置于4%多聚甲醛中固定保存，后期進行免疫組化實驗，另一部分則立即在顯微鏡下進行組織分離，將其分為癌組織和癌旁組織，凍存于液氮中，后期采用熒光定量PCR驗證PHD2的表達情況。

2 免疫組化

①各組標(biāo)本4%多聚甲醛固定最少24小時后，送至我院病理科進行石蠟包埋、脫水、切片，切片厚度約為2.5μm。切片標(biāo)本置于載玻片后，在75℃烤箱里烤3小時，然后立即置于梯度二甲苯溶液和梯度乙醇溶液中進行切片脫蠟，放置待用。②使用碧云天公司抗原修復(fù)液進行修復(fù)，對已脫蠟的病理切片進行HE染色和 PHD2免疫組化染色。染色步驟為：3%H2O2室溫孵育5～10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS浸泡約5 min（至少兩次）；5%～10% 正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，置于室溫孵育約10min，傾去血清，勿洗，滴加一抗工作液，37℃孵育4小時或4℃過夜；PBS沖洗，5min，3次；滴加適量生物素標(biāo)記的二抗工作液，37℃孵育約10～30min；PBS沖洗，5min，3次；滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育約10～30min；PBS沖洗，5min，3次；顯色劑顯色15min（DAB）；自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。PHD2一抗購自Sigma公司，陽性對照采用Hela細胞，陰性對照使用磷酸鹽緩沖液（PBS）替代一抗。染色結(jié)束后，置于顯微鏡下拍照分析并統(tǒng)計各組之間PHD2表達差異。

3 組織RNA提取及熒光定量PCR驗證

3.1 樣品RNA的抽提 ①取液氮中凍存的組織，立即置于液氮中碾磨；②兩相分離：每1mL的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2mL的氯仿，蓋緊管蓋。手動或渦旋劇烈振蕩管體最少15s后，室溫孵育5min。4℃下12000rpm離心15min。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%；③將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中，然后加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后室溫孵育15min，4℃12000rpm離心15min。此時可見膠狀沉淀塊；④RNA清洗移去上清液，分別連續(xù)使用1mL的75%乙醇（75%乙醇用 DEPC水配制）、無水乙醇清洗RNA沉淀，混勻后，4℃下7000rpm離心5min；⑤小心吸去大部分乙醇溶液后，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5min，然后使用無RNA酶的水40μL用槍反復(fù)吹打，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

3.2 測定組織RNA濃度 本研究所獲取的RNA其A260/A280比值皆在1.8～2.3區(qū)間，濃度在100ng/mL～2000ng/μL之間，A230/A280比值均在2.0以上，說明標(biāo)本提取過程比較標(biāo)準(zhǔn)，所得樣品純度較好；

3.3 RT-PCR及Real time PCR RT-PCR采用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒20μL體系，其中RNA模板為1μg，Oligo dT引物和隨機引物各1μL，PCR buffer為 4μL（包含鎂離子、dNTPs、甘油等），逆轉(zhuǎn)錄酶為1μL，其余用DEPC水補足，RT-PCR反應(yīng)條件為：37℃ 15min，85℃ 5秒，4℃ ∞；Real time PCR：本實驗采用20μL反應(yīng)體系，其中模板為100μg，PHD2上下游引物各使用1μL，TAKARA SYBR GREEN為10μL，其余用DEPC水補足；Real time PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min，95℃30秒+57℃30秒+72℃30秒共計40個循環(huán)，72℃3min，4℃∞，并在退火時采集熒光值。PHD2引物序列為：上游引物：AAGCCCAGTTTGCTGACATTG，下游引物：TAGCTCG TGCTCTCTCATCTG，產(chǎn)物長度：150bp；內(nèi)參基因為GAPDH，其引物序列為：上游引物：AATGGGCAGCCG TTAGGAAA，下游引物：GCGCCCAATACG ACCAAATC，產(chǎn)物長度：168bp。

4 免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

本研究采取雙盲法判定免疫組化實驗結(jié)果，染色結(jié)束后，在光學(xué)顯微鏡高倍鏡下（400倍）觀察切片，設(shè)計為每個標(biāo)本切片4張，每張切片隨機選擇8個視野機型比較。PHD2免疫組化染色的最終得分以陽性細胞百分率及染色強度得分兩項得分之后進行計算，其中細胞染色強度得分評判標(biāo)準(zhǔn)為：無著色0分，弱著色1分（淺黃色），中等著色2分（棕黃色），強著色3分（黃褐色）。陽性細胞百分率及得分計算方法為：陽性細胞≤5%記為0分，陽性細胞≤6%～25%記為1分，陽性細胞≤26%～50%記為2分，陽性細胞＞50%記為3分。將兩項得分相加后進行組化結(jié)果著色強度判定，判定標(biāo)準(zhǔn)為：0分陰性（記為-），1～2分為弱陽性（記為+），3～4分為中等陽性（記為++），5～6分為強陽性（記為+++）。

5 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究采用SPSS15.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 免疫組化檢測及PHD2在癌旁組織中和鼻咽癌組織的表達差異情況

在高倍顯微鏡下，可以看到，在鼻咽癌組織和癌旁組織中，PHD2在細胞核和細胞質(zhì)中都有表達，呈均勻分布，各切片免疫組化染色分別呈黃色、棕黃色、黃褐色（圖1）。在56例鼻咽癌組織中，PHD2的蛋白表達水平為“-”45例，“+”6例，“++”3例，“+++”2例，PHD2蛋白表達陽性率為19.6%（11/ 56）；56例癌旁組織中，PHD2蛋白表達水平為“-”17例，“+”8例，“++”10例，“+++”21例，PHD2蛋白表達陽性率為69.6%（39/56）。經(jīng)過統(tǒng)計分析，鼻咽癌組織的PHD2表達水平顯著低于癌組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。見表1。

表1 PHD2在鼻咽癌組織和癌旁組織中的表達分布情況

2 Real time PCR檢測PHD2 m RNA在鼻咽癌組織和癌旁組織中的表達差異

TRIZOL法提取56例鼻咽癌旁組織和56例癌組織的RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄之后，Real time PCR檢測PHD2在鼻咽癌癌旁組織和癌組織中的表達差異情況（見圖2）。結(jié)果提示PHD2在鼻咽癌癌旁組織中的表達顯著高于癌組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 PHD2蛋白表達水平與患者的臨床病理特征關(guān)系

分析免疫組化染色結(jié)果與鼻咽癌患者臨床資料之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PHD2的蛋白表達水平差異與性別、年齡、分化程度無相關(guān)性（P＞0.05），而與臨床分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性（P＜0.05）。表現(xiàn)為PHD2蛋白表達水平越低的患者，其惡性程度越高。見表2。

表2 PHD2蛋白表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

討 論

腫瘤細胞和正常細胞起源相同，卻具有完全不同的生物性狀，其發(fā)病率具有越來越高的趨勢，腫瘤的發(fā)病機制以及應(yīng)對措施也得到了越來越廣泛的關(guān)注。鼻咽癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等一系列事件的演進，是由眾多癌基因、抑癌基因及環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜過程。癌基因的過表達或抑癌基因的低表達在腫瘤發(fā)生發(fā)展的整個過程均發(fā)揮作用［6］。我國鼻咽癌在南方高發(fā)，死亡率較高，因此，尋找鼻咽癌進程背后的的相關(guān)基因表達變化成為國內(nèi)外研究的熱點問題。脯氨酸羥化酶2（PHD2）屬于 Fe2+、2-酮戊二酸依賴雙加氧家族，在缺氧時被誘導(dǎo)，是缺氧誘導(dǎo)因子Hif-1α降解的主要調(diào)節(jié)因子，在常氧的條件下，PHD2將Hif-1α的2個脯氨酸殘基羥基化從而介導(dǎo)其蛋白酶消化［7］。PHD2在全身各組織都具有廣泛表達，主要位于細胞核中，但其具有跨核膜能力，因此，在細胞核和細胞質(zhì)中均能看到表達。既往研究表明，PHD2的結(jié)構(gòu)域上有缺氧反應(yīng)元件，且PHD2的表達是受缺氧因素控制，因此，PHD2被認(rèn)為介導(dǎo)了腫瘤血管形成、缺氧存活及凋亡［8］，和腫瘤微環(huán)境的形成密切相關(guān)。鼻咽癌作為典型的惡性腫瘤，其癌細胞在缺氧環(huán)境下的存活及代謝途徑轉(zhuǎn)變，被認(rèn)為介導(dǎo)了自身存活和演進［9-10］，然而，關(guān)于PHD2和鼻咽癌的相關(guān)性及具體機制研究卻未見諸報道，本研究通過收取本院住院患者組織，統(tǒng)計PHD2在鼻咽癌癌旁組織和癌組織的表達差異。

我們在本研究中采用了免疫組化及評分、real time PCR的方法觀察PHD2蛋白在鼻咽癌癌旁組織及癌組織中的表達差異情況。免疫組化結(jié)果表明，PHD2蛋白在鼻咽癌癌旁組織和癌組織中均有表達，而且均分布于細胞核和細胞質(zhì)中。通過細胞染色強度評分和陽性細胞百分率兩項統(tǒng)計，我們發(fā)現(xiàn)PHD2在鼻咽癌癌旁組織中高表達，然而在癌組織中表達水平較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示PHD2的表達水平可能和鼻咽癌這一疾病具有相關(guān)性。隨后我們采用了real time PCR檢測 PHD2在鼻咽癌癌旁組織和癌組織中的表達水平差異，結(jié)果表明：鼻咽癌癌旁組織的PHD2在mRNA水平顯著高于癌組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。通過進一步分析PHD2的表達水平與患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)，PHD2的表達水平與年齡、性別、分化程度并不具有相關(guān)性（P＞0.05），而與腫瘤的臨床分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況具有相關(guān)性（P＜0.05），表現(xiàn)為PHD2蛋白表達水平越低的患者，其惡性程度越高，預(yù)后越差，這與部分研究者的前期研究成果一致。既往研究提示，PHD2蛋白表達與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移，尤其是肝門靜脈浸潤過程中，可能起到了關(guān)鍵作用，并與結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，我們的研究發(fā)現(xiàn)，隨著鼻咽癌分期的提高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的增多，PHD2蛋白表達水平也相應(yīng)降低，具有負(fù)相關(guān)，提示PHD2可能與鼻咽癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程關(guān)系密切，但其影響方式及具體機制尚需大量基礎(chǔ)實驗的驗證。

鼻咽癌的腫瘤細胞處于腫瘤炎癥微環(huán)境中，主要發(fā)生機制為腫瘤血管結(jié)構(gòu)及組織分布異常，腫瘤微環(huán)境會造成缺氧的特征［11］，長期缺氧會導(dǎo)致腫瘤細胞出現(xiàn)適應(yīng)性改變，出現(xiàn)無氧糖酵解的增強和炎癥性蛋白質(zhì)的表達增加，最終導(dǎo)致腫瘤細胞出現(xiàn)耐藥性增加、對輻射的敏感性下降、侵襲及轉(zhuǎn)移能力增加等改變，因此，當(dāng)前關(guān)于腫瘤缺氧的治療相關(guān)靶點研究已成熱門。PHD2作為脯氨酸羥化酶中的一大亞型，在缺氧環(huán)境關(guān)鍵因子Hif-1α的存留中起到關(guān)鍵作用，介導(dǎo)了Hif-1α的降解，從而可以調(diào)控腫瘤細胞的分化、轉(zhuǎn)移、腫瘤血管分布、增殖等諸多方面，目前已成為潛在的治療靶點［12-13］。

綜上所述，我們認(rèn)為PHD2可能是鼻咽癌細胞在腫瘤微環(huán)境中介導(dǎo)缺氧存活的關(guān)鍵蛋白，鼻咽癌組織中的PHD2表達水平可能與遠期轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后具有負(fù)相關(guān)性。因此，PHD2可能作為鼻咽癌判斷預(yù)后的敏感生物標(biāo)志物，上調(diào)PHD2的表達可能會成為抑制鼻咽癌細胞的存活、藥物耐受、放療耐受以及侵襲轉(zhuǎn)移等方面的新思路。

［1］Lee A W，Ng W T，Chan Y H，et al.The battle against nasopharyngeal cancer.Radiother Oncol，2012，104（3）：272-278.

［2］Wee J T，Ha T C，Loong S L，et al.Is nasopharyngeal cancer really a“Cantonese cancer”？Cancer，2010，29（5）：517-526.

［3］Yan M，Kumachev A，Siu L L，et al.Chemoradiotherapy regimens for locoregionally advanced nasopharyngeal carcinoma：A Bayesian networkmeta-analysis.EurJCancer， 2015；51（12）：1570-1579.

［4］Ikeda E.Cellular response to tissue hypoxia and its involvement in disease progression.Pathol Int，2005，55（10）：603-610.

［5］Lee F S，Percy M J.The HIF pathway and erythrocytosis.Annu Rev Pathol，2011，6：165-192.

［6］Lai S Z，LiW F，Chen L，et al.How does intensity-modμLated radio-therapy versus conventional two-dimensional radiotherapy influence thetreatment resultsinnasopharyngeal carcinoma patients？Int JRadiat Oncol Biol Phys，2011，80（3）：661-668.

［7］Metzen E.Enzyme substrate recognition in oxygen sensing：how the HIF trap snaps.Biochem J，2007，408（2）：e5-6.

［8］Goel S，Duda D G，Xu L，et al.Normalization of the vascμLature for treatment of cancer and other diseases.Physiol Rev，2011，91（3）：1071-1121.

［9］Fong G H，Takeda K.Role and regμLation of prolyl hydroxylase domain proteins.Cell Death Differ，2008，15（4）：635-641.

［10］Deschoemaeker S，DiConza G，Lilla S，et al.PHD1 regulates p53-mediated colorectal cancer chemoresistance.EMBO Mol Med，2015，7（10）：1350-1365.

［11］Mazzone M.Novel alternatives for anti-angiogenetic therapy and therapeutic angiogenesis.Verh K Acad Geneeskd Belg，2010，72（3-4）：165-75.

［12］Hellfritsch J，KirschJ，SchneiderM， et al， Knockout of mitochondrial thioredoxin reductase stabilizes prolyl hydroxylase 2 and inhibits tumor growth and tumor-derived angiogenesis.Antioxid Redox Signal，2015，22（11）：938-950.

［13］Fujita N，Hirose Y，Tran C M，et al.HIF-1-PHD2 axis controls expression of syndecan 4 in nucleus pulposus cells.FASEB J，2014，28（6）：2455-2465.

（李 凌編輯）

Expression and Clinical Significance of PHD2 in Nasopharyngeal Carcinoma

XIANG Yuan-di，ZHANG Bi-bo，WU Juan，YAO Qi，LIChun-li，WANG Chen-rong
（Department of Otolaryngology，Wuhan No.1 Hospital，Wuhan 430022，China）

Objective To explore the expression of prolyl hydroxylase 2（PHD2）and its clinical significance in nasopharyngeal carcinoma and adjacent tissues.M ethods Immunohistochemistry and Real time PCR were used to detect PHD2 expression level of 56 cases of nasopharyngeal carcinoma and adjacent tissues，and to analysis the relationship between PHD2 expression and clinic pathological features of nasopharyngeal carcinoma. Results In 56 cases of nasopharyngeal carcinoma，the positive rate in carcinoma was 19.6%（11/56），“-”45 cases，“+”6 cases，“++”3 cases，“++++”2 cases；and the positive rate in adjacent tissueswas 69.6%（39/56）。Real time PCR showed PHD2 expression level of nasopharyngeal carcinoma was significantly lower than that in adjacent tissues（P＜0.05）.CCR1 expression had no correlation with age，sex and degree of differentiation（P＞0.05，but it correlated with clinical stage，T stage，development of nasopharyngeal carcinoma（P＜0.05）.Conclusion PHD2 is negatively expressed in themajority of NPC，and its expression levelmay be related to the patient′s prognosis.

PHD2； Nasopharyngeal carcinoma； Immunohistochemistry； Expression；Clinical significance

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.06.008

2015-11-03；

2016-04-22

向元俤（1980—），男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：頭頸腫瘤的基礎(chǔ)與臨床。Email：doctorxiangwuhan@163.com