卜兆宇,俞世霖

(1. 揚州市建筑設計研究院有限公司，江蘇 揚州 225000， 2.河海大學，江蘇 南京210008)

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水體中磺胺甲惡唑的存在及其毒性研究機理

卜兆宇1,俞世霖2

(1. 揚州市建筑設計研究院有限公司，江蘇 揚州 225000， 2.河海大學，江蘇 南京210008)

通過實驗對太湖水體中的磺胺甲惡唑進行研究，探究磺胺甲惡唑的存在濃度，并且結合靜態(tài)暴露實驗，研究磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚的代謝毒性作用，對水環(huán)境中磺胺甲惡唑的安全濃度設置具有重要的指導作用。

磺胺甲惡唑；濃度；斑馬魚；代謝毒性

抗生素類物質(zhì)是目前使用較多的一種藥物，并且在常規(guī)水體中被頻繁檢出，對生態(tài)環(huán)境與人類健康造成了巨大的威脅[1]。目前，抗生素類物質(zhì)開始引起廣大學者的廣泛關注，在現(xiàn)有水環(huán)境中檢出的抗生素類藥物中，磺胺類藥物的檢出頻率最高[2]?；前奉愃幬锸且环N廣泛使用的抗菌藥，由合成氨苯磺胺類結構物質(zhì)衍生而成，廣泛應用于預防和治療一類感染性疾病。由于磺胺類藥物的大量使用，水體中磺胺類物質(zhì)的濃度明顯升高。在這類磺胺類藥物中，磺胺甲惡唑的水環(huán)境檢出濃度最高，能達到200 ng/L。目前針對中國太湖流域磺胺甲惡唑的濃度研究相對較少，并且針對磺胺甲惡唑進行毒性研究的資料更少。因此，針對水環(huán)境中的磺胺甲惡唑的存在濃度及生物毒性進行研究十分必要[3]。

本次實驗針對江蘇太湖水環(huán)境中的磺胺甲惡唑濃度進行研究，并且采用斑馬魚作為模式動物，在實驗中進行靜態(tài)染毒實驗，綜合研究磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚的代謝系統(tǒng)毒性作用。

1　材料與方法

1.1實驗材料

本次實驗所采用的斑馬魚為德國Tubingen品系，均由南京大學模式動物研究所斑馬魚實驗室提供。在實驗過程中，斑馬魚的養(yǎng)殖參照Westerfield在1995年所發(fā)表的斑馬魚飼養(yǎng)方法：斑馬魚養(yǎng)殖照明條件為14 h光照、1 h黑暗交替進行；養(yǎng)殖水溫控制在28.5±1℃；水體每隔3 h進行曝氣充氧，保證水體中的溶解氧量為5 mg/L以上；pH控制在7.02～7.25；總硬度采用德國度計，控制在8.02～8.15[4]。抗生素磺胺甲惡唑(符合國家標準物質(zhì))購買于中國藥品檢定所。在靜態(tài)染毒實驗中，斑馬魚的培養(yǎng)液參照Zebra fish Book進行配置[5]。其中，磺胺甲惡唑采用助溶劑DMSO助溶(終濃度<0.1%)，斑馬魚的代謝酶(GST、MDA、CAT、SOD)采用代謝酶試劑盒進行測定，均購于南京建成生物工程研究所。

1.2實驗方法

1.2.1水體中磺胺甲惡唑的檢測方法

本次實驗針對江蘇太湖水體中的磺胺甲惡唑進行檢測，采用定位檢測的方法，針對太湖東西南北側設定4個檢測點進行取樣檢測，所取水樣在48 h內(nèi)進行測定，每個檢測點采取三個平行樣，每個樣品進行三次檢測，保證檢測精度。

實驗采用Waters公司Oasis HLB 6cc (500 mg, Waters, USA)對水樣進行萃取濃縮，并且采用安捷倫公司超高清液相色譜儀(1260)與三重四級桿質(zhì)譜儀(6460)對濃縮液中的磺胺甲惡唑進行檢測，具體濃縮與檢測步驟參照Yan等人的方法[6]，檢測回收率為84±2.1%，檢測限為1.6 ng/L?；前芳讗哼驒z測條件如表1所示。

表1　磺胺甲惡唑檢測條件

1.2.2靜態(tài)染毒實驗設計

考慮到大濃度下的暴露實驗會放大生物毒性效應便于有毒物質(zhì)的研究，在本次針對磺胺甲惡唑的靜態(tài)染毒實驗中，按照等比例區(qū)間進行濃度設置，在實驗中設置五組濃度梯度與一組空白對照，即0、10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、500 μg/L、1 mg/L。實驗中，在相同暴露條件下的特定檢測時間段對6組中的斑馬魚酶活性進行檢測。經(jīng)研究，暴露期限為7 d，特定檢測時間為暴露1 d后、暴露3 d后、暴露7 d后。

1.2.3代謝酶活性測定

本次實驗酶活性均采用南京建成生物工程研究所酶活性試劑盒進行測定，具體操作參照試劑盒說明。其中，GST酶測定參照Habig的方法、MDA含量測定參照硫代巴比妥酸的方法、CAT酶測定參照Gott的方法、SOD酶測定參照Marklund的方法[7]。同時，采用綜合酶活性統(tǒng)計法對四種酶活性進行加權統(tǒng)計，便于綜合反應磺胺甲惡唑的生物毒性作用，具體統(tǒng)計步驟參照Beliaeff的方法[8]。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)分析采用生物毒理學專用分析軟件Graph pad Prism5.0進行。實驗結果表示采用平均值±標準誤差(Mean±SD)形式，數(shù)據(jù)用單尾檢驗法進行比較，p<0.05為顯著差異。

2　結果與討論

2.1水體中磺胺甲惡唑的存在濃度

為了檢測太湖水中磺胺甲惡唑的存在濃度，我們在太湖東(E)西(W)南(S)北(N)四個方向進行取樣，對水樣中的磺胺甲惡唑進行檢測，檢測結果見圖1所示。

圖1　不同取樣點處磺胺甲惡唑的濃度

由圖1可以看出:在太湖四個方向水樣中的磺胺甲惡唑濃度各有差異。其中太湖西部水樣中的磺胺甲惡唑的平均濃度為41 ng/L，最高檢出濃度達到了最高達到了45 ng/L;太湖北側水樣，磺胺甲惡唑平均濃度為24 ng/L，最高檢出濃度達到了27 ng/L;太湖東側水樣，磺胺甲惡唑平均濃度為21 ng/L，最高檢出濃度達到了24 ng/L。檢出濃度最低的是太湖南側水樣，磺胺甲惡唑平均濃度為13 ng/L，最高檢出濃度達到了16 ng/L。

經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在太湖西側，工業(yè)企業(yè)眾多，且均有制藥廠分布，大量的生產(chǎn)廢水經(jīng)內(nèi)部小型污水處理裝置收集處理后直接排入大湖中。由于常規(guī)處理工藝并不能對這類藥物進行完全去除，因此造成了西部水體中的磺胺甲惡唑濃度較高。同時，采樣點西部多為水灣地區(qū)，由于水灣的封閉性作用，并不能促進水體進行交換，從而導致水體中的磺胺甲惡唑累積，最終導致該處的磺胺甲惡唑濃度較高。

在太湖北部和東部，雖然工業(yè)企業(yè)較多，并且水灣較多。由于太湖北部有大量的水生植物生態(tài)修復區(qū)，水體中的水生植物有著發(fā)達的根系，會對水體中的抗生素進行吸收，起到水體凈化作用，因此北部水體中磺胺甲惡唑的濃度比西部低。同時在太湖的東部地區(qū)，為了保證太湖水源質(zhì)量，政府在太湖東部進行了引長江水進太湖水的工程，長江具有極強的水體流動性與交換性，大量的長江水引入會促進太湖東部地區(qū)水體發(fā)生交換，最終提高了東部的水質(zhì)，降低了該地區(qū)的磺胺甲惡唑的濃度。

太湖南部，工藝企業(yè)較少，且與東部、西部、北部工業(yè)區(qū)相距較遠，水體的流動性與稀釋性導致此處的磺胺甲惡唑濃度相比其他三個地區(qū)最低，并且此處岸線平滑、少水灣、污染物累積作用較弱，因此該處的水質(zhì)相對較好。

通過以上研究發(fā)現(xiàn)，太湖水體中的磺胺甲惡唑濃度最高出現(xiàn)在太湖西側，最高達到了45 ng/L。同時，生態(tài)修復區(qū)的建立與引水工程的實施會對水體中的污染物進行凈化，保證水體的優(yōu)良水質(zhì)。

2.2磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚單一代謝酶活性的影響

為研究磺胺甲惡唑?qū)λw生物的代謝毒性作用，采用斑馬魚作為模式動物，研究靜態(tài)暴露下的磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚的代謝酶的毒性作用，實驗結果見圖2。

由圖2可以看出，隨著暴露濃度與暴露的增加，斑馬魚體內(nèi)的四種代謝酶活性均發(fā)生額了不同變化。GST酶產(chǎn)生了先上升后下降的趨勢并且在第3天酶活性達到最大值；MDA含量也產(chǎn)生了先上升后下降的趨勢并且在第3天酶活性達到最大值；CAT酶活性隨著暴露時間與濃度的升高不斷下降，并且在第7天達到最低值；SOD酶活性與GST、MDA酶趨勢相同，并且在第3天酶活性達到最大值。

GST酶活性在生物代謝系統(tǒng)去除生物體內(nèi)具有毒性、致突變、致癌性的親電子時有著不可或缺的作用[9]。GST酶可以促進生物體內(nèi)釋放三肽谷胱甘肽，并且促進三肽谷胱甘肽與以內(nèi)的外源性物質(zhì)相互結合，最終促進這類物質(zhì)排出生物體內(nèi)。由圖2可以看出，在暴露實驗的第3天，GST酶達到最大值，隨后濃度降低，這可能是因為在暴露第3天磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚代謝酶進行誘導，而在第7天斑馬魚體內(nèi)適應了磺胺甲惡唑的代謝毒性。

MDA含量通常用來判斷體內(nèi)外源性物質(zhì)對代謝系統(tǒng)的毒性作用，其可直接反應體內(nèi)細胞膜受到的毒性作用[10]。由圖2可以看出，MDA酶在第3天達到最大值，可能是因為在暴露第三天磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚的代謝毒性作用最大。而在暴露第7天MDA的含量降低，回歸第一天的含量，可能是因為斑馬魚體內(nèi)的代謝酶對磺胺甲惡唑產(chǎn)生了代謝作用，最終降低了磺胺甲惡唑?qū)毎拇x作用。

CAT酶和SOD酶是同階段的代謝酶，對外源性物質(zhì)在斑馬魚體內(nèi)產(chǎn)生的自由基有著重要的去除作用，并且兩者之間具有重要的聯(lián)系[11-12]。當斑馬魚體內(nèi)產(chǎn)生自由基時，SOD酶會對斑馬魚體內(nèi)的超氧化物陰離子自由基團產(chǎn)生歧化作用，轉化為氧化作用相對較低的過氧化氫。隨后，CAT酶會對過氧化氫發(fā)生作用，促進體內(nèi)的過氧化氫轉化為氧氣和水，最終實現(xiàn)代謝系統(tǒng)內(nèi)的自由基的去除。由實驗結果可以看出：在暴露的第3天斑馬魚體內(nèi)的SOD濃度明顯上升，這是由于體內(nèi)的自由基濃度上升對SOD酶產(chǎn)生了誘導作用，而在第7天SOD濃度下降，這是因為體內(nèi)自由基被逐漸轉化，濃度降低。而CAT酶一直處于降低的狀態(tài)，這可能因為斑馬魚體內(nèi)的過氧化氫濃度較高，CAT酶負荷過大，產(chǎn)生了抑制作用。

圖2　磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚單一酶活性作用

2.3磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚綜合代謝酶活性的影響

圖3　磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚綜合酶活性作用

為綜合探究磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚代謝系統(tǒng)的綜合毒性作用，對斑馬魚體內(nèi)的單一代謝酶活性結果進行了綜合統(tǒng)計分析，結果見圖3。由圖3可以看出：在暴露的7 d內(nèi)，磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚的代謝毒性作用在暴露第3天最為強烈，且隨著暴露的濃度增加，綜合酶活性指標逐漸增加?；前芳讗哼?qū)Π唏R魚體內(nèi)代謝系統(tǒng)的生物毒性作用隨著暴露濃度的增加而增加，并且磺胺甲惡唑的代謝毒性在染毒第3天作用最為強烈，應該引起重視。

3　結論

(1)在太湖水樣中，太湖西部水樣中的磺胺甲惡唑濃度最高，太湖南部水樣中的磺胺甲惡唑濃度最低，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)生態(tài)修復工程與引水工程會降低水體中磺胺甲惡唑的濃度。

(2)通過代謝酶活性實驗發(fā)現(xiàn)磺胺甲惡唑會對斑馬魚的代謝系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用，因此值得后期實驗進行深入研究。

(3)通過綜合酶活性分析發(fā)現(xiàn)，磺胺甲惡唑的代謝毒性作用在暴露的第3天作用最為強烈，并且隨著暴露濃度的上升，綜合活性指標逐漸變大。因此，磺胺甲惡唑的代謝毒性作用應當受到研究者重視。

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Occurrence of sulfamethoxazole in aquatic environment and its toxicity on zebrafish

BO Zhao-yu1,YU Shi-lin2

(1.YangzhouArchitecturalDesign&ResearchInstituteCo.,Ltd,Yangzhou225000,China;2.HohaiUniversity,Nanjing210008,China)

This experiment studied the sulfamethoxazole concentration and the metabolic toxicity of sulfamethoxazole on zebrafish in Taihu.The results of this study would provide a better reference for safe concentration setting towards sulfamethoxazole.

sulfamethoxazole;concentration;zebrafish;metabolic toxicity

2016-04-07

卜兆宇(1982—)，江蘇揚州人，碩士，工程師。

1674-7046(2016)05-0078-05

10.14140/j.cnki.hncjxb.2016.05.014

X171. 1

A