王智存,白廣紅,施　婕,鄒遠(yuǎn)嫵,王　卓,朱　蕾,李曉曉

(陜西省結(jié)核病防治院，西安 710100)

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·臨床研究·

顯色固液雙相培養(yǎng)基快速檢測結(jié)核分枝桿菌的臨床應(yīng)用評價(jià)

王智存,白廣紅,施婕,鄒遠(yuǎn)嫵,王卓,朱蕾,李曉曉

(陜西省結(jié)核病防治院，西安 710100)

目的探討固液雙相培養(yǎng)基快速檢測結(jié)核分枝桿菌的臨床價(jià)值。方法對350例患者的痰標(biāo)本分別進(jìn)行涂片抗酸染色、改良羅氏培養(yǎng)法、固液雙相培養(yǎng)法、Bactec 960培養(yǎng)法檢測。結(jié)果350例痰標(biāo)本涂片抗酸染色法陽性率為14.8%，改良羅氏培養(yǎng)法為24.0%，固液雙相法為35.7%，Bactec 960培養(yǎng)法為40.3%，改良羅氏培養(yǎng)法與涂片抗酸染色法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，固液雙相培養(yǎng)法與改良羅氏培養(yǎng)法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，固液雙相培養(yǎng)法與Bactec 960培養(yǎng)法比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。改良羅氏培養(yǎng)法平均報(bào)告陽性時(shí)間為21.5 d，固液雙相培養(yǎng)法液相平均為13.2 d，固相為16.4 d，Bactec 960培養(yǎng)法平均為11.8 d。結(jié)論固液雙相培養(yǎng)法操作簡便，陽性率高，時(shí)間短，適合基層醫(yī)院快速檢測結(jié)核分枝桿菌。

結(jié)核分枝桿菌；培養(yǎng)； 結(jié)核病

全國第5次結(jié)核病流行抽樣調(diào)查報(bào)告，2010年全國人口有活動(dòng)性肺結(jié)核患者499萬例，鄉(xiāng)村明顯高于城鎮(zhèn)，無癥狀肺結(jié)核患者比例明顯增加，有癥狀患者初診結(jié)核病院或?qū)？漆t(yī)院僅占3.2%[1]。結(jié)核病防治的關(guān)鍵是早期診斷，早期治療。涂片抗酸染色率低(10%～20%)，我國普及和通用方法為改良羅氏培養(yǎng)法，但時(shí)間長(8周)，液體快速培養(yǎng)法(Bactec 960培養(yǎng)基等)營養(yǎng)成分高，速度快，平均報(bào)告陽性率時(shí)間13 d，但價(jià)格昂貴，需特殊儀器，不能在綜合醫(yī)院和基層醫(yī)院普及和應(yīng)用?，F(xiàn)探討結(jié)合液體和固體培養(yǎng)基特點(diǎn)，研究顯色固液雙相培養(yǎng)基應(yīng)用于臨床的效果。報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料350例痰標(biāo)本來自2014年5～12月該院門診和住院患者采集的清晨痰液，標(biāo)本量3～5 mL，形狀為干酪痰、血痰、黏液痰，排除唾液樣痰標(biāo)本，同一患者只使用1份痰標(biāo)本。

1.2培養(yǎng)基改良羅氏培養(yǎng)基(7毫升/支)購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，Bactec 960培養(yǎng)基和添加劑購自BD公司，固液雙相培養(yǎng)基以改良羅氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入含10%添加劑的7H9液體培養(yǎng)基4 mL，約占斜面的一半。

1.3方法

1.3.1痰標(biāo)本消化處理痰標(biāo)本涂片抗酸染色后加入1～2倍體積NALC-NaOH混合溶液震蕩，消化離心處理[2]。

1.3.2接種培養(yǎng)標(biāo)本加200 μL至改良羅氏培養(yǎng)基和固液雙相培養(yǎng)基；Bactec 960 7H9培養(yǎng)基加標(biāo)本500 μL，置Bactec 960中培養(yǎng)檢測。改良羅氏法還需37 ℃平臥放置斜面24 h后直立放置，培養(yǎng)后3、7 d觀察細(xì)菌生長情況，此后每周觀察1次，培養(yǎng)陽性隨報(bào)告羅氏培養(yǎng)基結(jié)果觀察及判斷參考《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行[3]。固液雙相培養(yǎng)基第9天加入過濾除菌0.1 g/L刃天青(沃凱公司)顯色液30 μL至固液雙相培養(yǎng)基，顏色從藍(lán)色變?yōu)榉奂t色,即利于細(xì)菌生長。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較使用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.14種方法檢測痰標(biāo)本的結(jié)果比較改良羅氏培養(yǎng)法與涂片抗酸染色法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.34，P<0.01),固液雙相培養(yǎng)法與改良羅氏培養(yǎng)法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.466，P<0.01),固液雙相培養(yǎng)法與Bactec 960培養(yǎng)法比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.55，P>0.05)；改良羅氏培養(yǎng)法污染率為2.0%，固液雙相培養(yǎng)法為2.6%，Bactec 960培養(yǎng)法為5.42%。見表1。

表1　　4種方法檢測痰標(biāo)本結(jié)果比較

注：-表示無數(shù)據(jù)。

2.23種方法報(bào)告陽性時(shí)間結(jié)果比較改良羅氏培養(yǎng)法平均報(bào)告陽性時(shí)間21.5 d，固液雙相培養(yǎng)法液相13.2 d，固相16.4 d，Bactec 960培養(yǎng)法11.8 d。見表2。

表2　　3種方法培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽性耗時(shí)結(jié)果比較(n)

注：-表示無數(shù)據(jù)。

2.32種方法檢測陽性菌落結(jié)果比較固液雙相培養(yǎng)法與改良羅氏培養(yǎng)法陽性菌落(++、+++、++++)結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，菌落(+)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3　　2種方法檢測陽性菌落生長結(jié)果比較(n)

3　討　　論

探討適合我國結(jié)核病疫情的細(xì)菌學(xué)檢查方法，早期發(fā)現(xiàn)傳染源，規(guī)范治療避免耐藥性和減少疫情傳播極為重要。

結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法作為結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法3～8 周才能得到結(jié)果，Bactec 960培養(yǎng)法等液體培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，可使用儀器進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，平均報(bào)告陽性時(shí)間為13 d，具有自動(dòng)化和高靈敏度優(yōu)點(diǎn)[4]。

本研究結(jié)果表明，涂片抗酸染色法陽性率為14.8%，改良羅氏培養(yǎng)法24.0%，固液雙相培養(yǎng)法為35.7%，Bactec 960培養(yǎng)法為40.3%。固液雙相培養(yǎng)法與涂片抗酸染色法、改良羅氏培養(yǎng)法比較，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，與Bactec 960 培養(yǎng)法比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。固液雙相培養(yǎng)基采用固液雙相一體化統(tǒng)計(jì)，其營養(yǎng)豐富，可減少污染，提高陽性率，孔雀綠可進(jìn)一步避免雜菌污染，分離純化獲得單個(gè)菌落，對結(jié)核分枝桿菌有促進(jìn)生長的作用。培養(yǎng)陽性菌落直觀明白，省去抗酸染色步驟，減少工作量，為結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，Bactec 960培養(yǎng)陽性管中結(jié)核分枝桿菌形成條索狀[5]。7H9培養(yǎng)管培養(yǎng)基對菌液濃度配制時(shí)濁度影響，使細(xì)菌濃度較難控制，影響藥敏試驗(yàn)中細(xì)菌接種量，造成藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。

改良羅氏培養(yǎng)法平均報(bào)告陽性時(shí)間21.5 d，固液雙相培養(yǎng)法液相平均時(shí)間13.2 d，固相平均時(shí)間16.4 d，Bactec 960培養(yǎng)法11.8 d。結(jié)核分枝桿菌生長緩慢：(1)標(biāo)本經(jīng)酸或堿處理后直接接種至培養(yǎng)基，至少需2～3 d 培養(yǎng)基才能緩沖酸堿，達(dá)到pH 7.2左右，而本組固液雙相培養(yǎng)基接種pH 6.8 PBS消化混合液后，減少培養(yǎng)基緩沖時(shí)間[6]。(2)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基不能有效吸收營養(yǎng)成分而導(dǎo)致細(xì)菌對數(shù)生長期延長，改良羅氏培養(yǎng)基接種后需傾斜，平放斜面24 h以便細(xì)菌充分接觸培養(yǎng)基，細(xì)菌在雙相培養(yǎng)基內(nèi)可使細(xì)菌浸泡在營養(yǎng)成分中以利于新陳代謝，對數(shù)生長期提前，省去改良羅氏培養(yǎng)基平臥放置斜面的操作，操作簡便快捷。液體培養(yǎng)基陽性標(biāo)本呈絮狀沉淀生成，難以鑒別雜菌污染，而固液雙相培養(yǎng)基生長的菌落則呈典型菜花狀，易于判斷。刃天青是一種氧化還原指示劑，在氧化狀態(tài)呈紫藍(lán)色，且在還原狀態(tài)下呈粉紅色或紅色還原產(chǎn)物。通過培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌還原刃天青鹽從而判斷細(xì)菌是否生長[7]。該方法顯色劑用量少，不需儀器，比較方便，可快速檢測液相中是否有結(jié)核菌生長。實(shí)際應(yīng)用中加入刃天青試劑后一般需要過夜培養(yǎng)。張朝寶等[8]研究XTT/mpms試劑只需繼續(xù)培養(yǎng)4 h，且XTT/mpms和TH9培養(yǎng)基37 ℃恒溫培養(yǎng)時(shí)間至少在7 d內(nèi)保持相對穩(wěn)定，其工作濃度對分枝桿菌具有低細(xì)胞毒性。

綜述所述，固液雙相培養(yǎng)法操作簡便，試劑成本低，陽性率高，不需特殊儀器，陽性平均時(shí)間比改良羅氏培養(yǎng)法提前1周，便于綜合醫(yī)院和基層醫(yī)院檢測結(jié)核分枝桿菌，具有一定的臨床價(jià)值。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.042

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1673-4130(2016)19-2756-02

2016-03-12

2016-05-17)