劉小榮，王永翔，趙立明，趙小東，劉學(xué)軍，任玉林，李少君

(甘肅省第二人民醫(yī)院：1.檢驗科；2.泌尿外科，蘭州 730000)

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·論著·

實時熒光定量PCR檢測CD44v8在膀胱及尿路上皮癌中的表達(dá)*

劉小榮1，王永翔2△，趙立明2，趙小東2，劉學(xué)軍2，任玉林2，李少君2

(甘肅省第二人民醫(yī)院：1.檢驗科；2.泌尿外科，蘭州 730000)

目的探討CD44v8在膀胱及尿路上皮癌的臨床診斷價值。方法收集實驗組患者膀胱及尿路上皮癌患者75例，采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)從病理和臨床分期2個方面對CD44v8進(jìn)行定量分析。對照組20例患者為正常膀胱黏膜組織。結(jié)果CD44v8蛋白在對照組膀胱黏膜上皮無表達(dá)，拷貝數(shù)小于1×102拷貝/毫升。75例膀胱及尿路上皮癌患者陽性表達(dá)26例(34.7%)，CT值均小于35,基因拷貝數(shù)均大于1×104拷貝/毫升。陽性表達(dá)率與腫瘤病理分級、腫瘤分期(TNM)相關(guān)，與腫瘤復(fù)發(fā)和數(shù)量無相關(guān)性。結(jié)論CD44v8可作為判斷膀胱及尿路上皮癌分級、分期的參考指標(biāo)，具有臨床診斷意義。

上皮癌；膀胱；尿路；實時熒光定量PCR；CD44v8蛋白

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最本質(zhì)的特征,其與很多因素相關(guān)，目前對惡性腫瘤各種因子的研究已成為熱點[1]。CD44分子通過與細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸、膠原蛋白、血管內(nèi)皮細(xì)胞等黏附，致使腫瘤細(xì)胞具有很強的生長及轉(zhuǎn)移能力,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)CD44與多種腫瘤的復(fù)發(fā)、浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)[2-4]。本研究應(yīng)用實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測CD44v8蛋白在膀胱及尿路上皮細(xì)胞癌中的表達(dá)，探討CD44v8與膀胱尿路上皮細(xì)胞癌病理分級、臨床分期、復(fù)發(fā)的相關(guān)性。

1　資料與方法

1.1一般資料75例膀胱尿路上皮細(xì)胞癌標(biāo)本選自2010年1月至20014年6月該院泌尿外科手術(shù)切除且經(jīng)病理確診患者(實驗組)，男59例，女16例，年齡28～86歲，平均年齡57歲。根據(jù)國際抗癌協(xié)會(UICC)制定的腫瘤分期(TNM)標(biāo)準(zhǔn)：Tis-a期14例，T1期25例，T2期21例，T3期10例，T4期5例；病理Ⅰ級27例，Ⅱ級25例，Ⅲ級23例；初發(fā)組51例，復(fù)發(fā)組24例；單發(fā)組51例，多發(fā)組24例。20例對照組患者膀胱尿路上皮細(xì)胞組織均取自經(jīng)恥骨上前列腺摘除術(shù)，經(jīng)病理證實為正常膀胱黏膜組織。

1.2儀器與試劑API7500實時熒光定量PCR 儀。核酸提取液B，逆轉(zhuǎn)錄酶，Taq酶系，CD44v8 PCRMIX,CD44v8陽性質(zhì)控品，陰性質(zhì)控品，均由北京索奧生物醫(yī)藥科技有限公司提供。

1.3方法(1)DNA提?。哼x取約50 mg膀胱黏膜組織轉(zhuǎn)移至1.5 mL干凈離心管中，加1 mL生理鹽水混勻，研磨器研制成勻漿，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀加50 μL核酸提取液(DNA)，充分混勻，100 ℃處理10 min，12 000 r/m離心5 min，取上清液4 μL做PCR反應(yīng)。(2)PCR擴(kuò)增：從試劑盒中取出CD44v8 PCR MIX、Taq酶系，室溫融化并振蕩混勻，10 000 r/min離心10 s。參考北京索奧生物醫(yī)藥科技試劑盒說明書提取膀胱尿路上皮癌患者總RNA,利用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以cDNA 為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。CD44v8引物序列上游為：5′-TGG ACT CCA GTC ATA GTA TAA CGC-3′；下游為：5′-GGT CCT GTC CTG TCC AAA TC-3′，測試反應(yīng)體系配置為：CD44v8 PCR MIX 24 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶4 μL，Taq酶系2 μL。向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入26 μL反應(yīng)體系，向每管中加入處理后的樣品或CD44 v8陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品(使用前用陰性質(zhì)控品梯度稀釋10、100、1 000倍，記為1×106、1×105、1×104拷貝/毫升)和陰性質(zhì)控品4 μL,10 000 r/min瞬時離心3 s。將各反應(yīng)管放入定量PCR反應(yīng)槽內(nèi)，按對應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控品、陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品及未知標(biāo)本，并設(shè)置反應(yīng)體系30 μL，樣品名稱，標(biāo)記熒光基團(tuán)種類(報告基團(tuán)為FAM，淬滅基團(tuán)為TAMRA)和循環(huán)條件：95 ℃ 30 s，然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。

1.4結(jié)果判讀(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線：r=0.99，陽性CT≤35,基因拷貝數(shù)為1×104拷貝/毫升。(2)各待測反應(yīng)管曲線圖：分別繪制TNM分期CD44v8蛋白熒光定量PCR曲線圖；WHO病理分級CD44v8蛋白熒光定量PCR曲線圖；臨床分期CD44v8蛋白熒光定量PCR曲線圖；腫瘤數(shù)量CD44v8蛋白熒光定量PCR曲線圖，根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判斷。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料組間比較使用方差分析和t檢驗，兩樣本率的比較應(yīng)用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1CD44v8在2組患者中的表達(dá)結(jié)果比較CD44v8蛋白在對照組正常膀胱及尿路上皮細(xì)胞中不表達(dá)，在實驗組膀胱及尿路上皮癌的陽性表達(dá)26例，陽性率34.7%。

2.2CD44v8與實驗組膀胱尿路上皮癌TNM分期的關(guān)系CD44v8蛋白陽性表達(dá)率隨TNM分期增加而升高，Tis-a期3例(21.4%)，T1期7例(30.4%)，T2期8例(40.0%)，T3期5例(50.0%)，T4期3例(37.5%)，淺表性(Tis-a～T1)與浸潤性(T2～T4)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。見表1。

2.3CD44v8與實驗組膀胱尿路上皮癌病理分級的關(guān)系CD44v8蛋白表達(dá)隨病理分級增加而升高，Ⅰ級4例(14.8%)，Ⅱ級9例(36%)，Ⅲ級13例(56.5%)，高分化膀胱尿路上皮癌(Ⅰ級)與低分化膀胱尿路上皮癌(Ⅱ、Ⅲ級)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。見表1。

2.4CD44v8與膀胱尿路上皮癌復(fù)發(fā)的關(guān)系CD44v8蛋白在51例原發(fā)性膀胱尿路上皮癌中17例表達(dá)(33%)，24例復(fù)發(fā)性膀胱尿路上皮癌中9例表達(dá)(37%)，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0．05)。見表1。

表1　　CD44v8蛋白表達(dá)與TNM分期、病理分級、復(fù)發(fā)及腫瘤數(shù)量的相關(guān)性

2.5CD44v8與膀胱尿路上皮癌數(shù)量的關(guān)系CD44v8蛋白在51例單發(fā)膀胱尿路上皮癌中18例表達(dá)(35.2%)，24例多發(fā)膀胱尿路上皮癌中8例表達(dá)(33%)，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0．05)。見表1。

3　討　　論

大量研究表明，CD44及其變異體在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用，與乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、膽管癌、前列腺癌等多種腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移有著密切的聯(lián)系[5-6]。CD44是一種蛋白形式的細(xì)胞表面黏附因子，參與細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)之間的特異性粘連過程，人類CD44基因位于11號染色體短臂上。目前已發(fā)現(xiàn)CD44mRNA至少由20個外顯子組成,完整基因組在染色體上大約跨越50 kb[7-8]。CD44基因的外顯子按表達(dá)方式分為2種：一種是組成型外顯子,另一種是V區(qū)變異型外顯子。組成型外顯子共有10個,其轉(zhuǎn)錄片段存在于所有CD44轉(zhuǎn)錄子中,僅含組成型外顯子的轉(zhuǎn)錄子稱為標(biāo)準(zhǔn)型CD44(CD44s)[9]。V區(qū)變異型外顯子也有10個,在基因組上位于第5和第6個組成型外顯子之間,在染色體DNA上跨越25 kb。含有V區(qū)外顯子的CD44轉(zhuǎn)錄子統(tǒng)稱為拼接變異體(CD44V)。

近年來，眾多學(xué)者通過基因水平、蛋白水平2個方面檢測尿液中CD44，從而對膀胱腫瘤的分化、浸潤、數(shù)量、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后作了大量的研究。目前關(guān)注較多的主要是CD44s、CD44v2、CD44v6、CD44v8～10對膀胱腫瘤的診斷。

通過對惡性腫瘤組織中各種CD44分子的檢測結(jié)果表明，許多類型的腫瘤均有不同程度的CD44分子表達(dá)[10]。CD44s和CD44v的異常表達(dá)，與膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系，但目前仍未得出統(tǒng)一的結(jié)論。多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果顯示，CD44s表達(dá)缺失同時伴有CD44v表達(dá)增高，與腫瘤分化程度較差、分期較晚顯著相關(guān)。有關(guān)研究報道，同時檢測組織和尿脫落細(xì)胞中CD44的表達(dá)，CD44v8～10與膀胱尿路上皮癌的進(jìn)展相關(guān)，在浸潤性膀胱尿路上皮癌患者的尿脫落細(xì)胞中升高[11-14]。本研究應(yīng)用實時熒光定PCR方法檢測正常膀胱黏膜及膀胱尿路上皮癌組織中CD44v8蛋白的表達(dá)，探討CD44v8陽性表達(dá)與病理分級、臨床分期、腫瘤數(shù)量及復(fù)發(fā)的關(guān)系，結(jié)果表明，陽性表達(dá)隨膀胱尿路上皮癌的分級、分期增加而升高，但與膀胱尿路上皮癌的數(shù)量、復(fù)發(fā)無關(guān)。CD44v8蛋白可作為判斷膀胱尿路上皮癌分化程度、臨床分期的參考指標(biāo)。

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The detection of the expression of CD44v8 with RT-PCR in bladder and urothelial carcinoma*

LIUXiaorong1,WANGYongxiang2△，ZHAOLiming2，ZHANXiaodong2，LIUXuejun2,RENYulin2,LIShaojun2

(1．DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofUrology，theSecondPeople′sHospitalofGansuProvince，Lanzhou,Gansu730000，China)

ObjectiveTo explore the expression of CD44v8 protein in human bladder and urothelial carcinoma,as well as the value in diagnosis of human bladder and urothelial carcinoma.MethodsRT-PCR was used to analysis the expression of CD44v8 protein in 75 patients with bladder and urothelial carcinoma in the pathological stage and clinical stage and 20 subjects of normal bladder mucosa were collected as control.ResultsCD44v8 protein was negative in all normal bladder and urothelial mucosa,the copy number was less than 1×102copy/mL; 26 cases of bladder and urothelial carcinoma was positive,and the positive rate of CD44v8 was 34.7%,and Ct values were less than 35 and copy number was greater than 1×104copy/mL.Positive rate was correlated with high pathological grades and TNM stages，but no significant difference was observed in recurrence of tumor．ConclusionCD44v8 could be useful indicator for the assessment of pathological grades and TNM stages of bladder and urothelial carcinoma．

carcinoma;bladder;urothelial carcinoma;RT-PCR;CD44v8 protein

蘭州市科技計劃項目資助(2012-1-37)。

劉小榮，女，主管檢驗醫(yī)師，主要從事病原微生物、免疫學(xué)研究。

，E-mail:gswyongxiang@126.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.011

A

1673-4130(2016)19-2687-03

2016-03-02

2016-05-24)