李旺勝,余　蕾

(1.貴州省六盤水市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科　553401；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院/貴州省產(chǎn)前診斷中心，貴陽(yáng) 553001)

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·臨床研究·

弱精子癥患者與正常生育者精漿差異蛋白的研究

李旺勝1,余蕾2

(1.貴州省六盤水市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科553401；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院/貴州省產(chǎn)前診斷中心，貴陽(yáng) 553001)

目的研究弱精子癥患者精漿差異蛋白的特征。方法選取六盤水市人民醫(yī)院2015年1～12月就診的200例弱精子癥患者(研究組)，同時(shí)收集同期已婚生育健康男性200例(對(duì)照組)，采集所有研究對(duì)象的精液標(biāo)本，采用Percoll技術(shù)獲得精漿，酶解獲得肽段,Shotgun技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)成分。比較2組標(biāo)本唯一肽段數(shù)等于1但肽段總數(shù)大于或等于4、唯一肽段數(shù)大于或等于2的結(jié)果。結(jié)果2組標(biāo)本唯一肽段數(shù)等于1但肽段總數(shù)大于或等于4、唯一肽段數(shù)大于或等于2情況下，有172種差異蛋白，其中研究組89種，對(duì)照組83種。研究組89種差異蛋白有3種與運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白、3種細(xì)胞凋亡關(guān)聯(lián)蛋白，分別為磷脂磷酸水解酶1同工型1、凝血酶敏感素1前體、相對(duì)分子質(zhì)量為400×103的蛋白質(zhì)，另有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白10種、細(xì)胞周期蛋白4種、結(jié)構(gòu)分子7種、催化活性蛋白27種、分子功能未知蛋白19種、生物進(jìn)程未知蛋白29種、細(xì)胞成分未知蛋白27種。酶催化活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白是常見差異蛋白。結(jié)論10種差異蛋白與弱精子癥緊密相關(guān)，分別為膜聯(lián)蛋白A4、蛋白S100-A9、蛋白S100-A11、維生素D結(jié)合蛋白前體、受體型酪氨酸蛋白磷酸酶η前體、α輔肌動(dòng)蛋白、胞質(zhì)動(dòng)力蛋白、相對(duì)分子質(zhì)量400×103的蛋白質(zhì)、白細(xì)胞介素-6受體β亞單位同工型1前體、聯(lián)蛋白Ⅵ同工型2。

弱精子癥；精漿；差異蛋白

Shotgun蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)又叫鳥槍蛋白質(zhì)組學(xué)策略，該技術(shù)無(wú)需蛋白純化步驟，可直接迅速鑒定蛋白混合標(biāo)本中的蛋白質(zhì)，消化作用將蛋白質(zhì)處理成為多肽后，對(duì)多肽進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)序分析，利用所得多肽波譜數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索，特別算法得出肽段結(jié)構(gòu)特征，從而區(qū)分蛋白質(zhì)[1]。為了解弱精子癥者精液蛋白差異，現(xiàn)對(duì)其與健康體檢者進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比。報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取六盤水市人民醫(yī)院2015年1～12月就診的200例弱精子癥患者(研究組)，年齡22～39歲，平均年齡(29.4±3.2)歲。另選同期已婚生育健康男性200例(對(duì)照組)，均經(jīng)過全面檢測(cè)顯示正常，年齡23～31歲，平均年齡(30.3±2.3)歲。2組研究對(duì)象均符合入選標(biāo)準(zhǔn)：研究組精子密度大于或等于50×106/mL,a級(jí)精子(快速前向運(yùn)動(dòng))比例小于25%,且a+b級(jí)精子(前向運(yùn)動(dòng))小于50%,其余指標(biāo)符合WHO標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組精液液化時(shí)間在30 min內(nèi)，精子計(jì)數(shù)大于或等于20×106/mL,a級(jí)精子大于或等于25%,或a+b級(jí)精子大于或等于50%;正常形態(tài)精子比例大于或等于15%。2組研究對(duì)象的年齡、體質(zhì)量等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法2組研究對(duì)象均禁欲1周，采集精液標(biāo)本。根據(jù)WHO相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)標(biāo)本黏稠度、凝集度、精子密度、液化時(shí)間、畸形率、存活率、活動(dòng)度及白細(xì)胞水平、酸性磷酸酶、果糖進(jìn)行檢測(cè)。所有標(biāo)本定量分裝至100微克/管，混合后使用SDS-PAGE凝膠電泳分離處理，考馬斯亮藍(lán)染色膠體標(biāo)本。獲得分離圖譜后，將泳道以手術(shù)刀切割分為4段，分置于試管內(nèi)，采用100 mmol/L 的NH4HCO3/30%的ACN脫色處理，清洗去除上清液后將剩余部分凍干保存；加入DTT、NH4HCO3孵化30 min，孵化溫度56 ℃，還原處理后去除上清液，各自將100 μL 100% ACN加入后等待5 min，吸除；各自加入30 μL 200 mmol/L IAA、70 μL 100 mmol/L NH4HCO3,避光靜置20 min后，去除上清液部分，再次將10 μL的 NH4HCO3(100 mmol/L)加入,室溫靜置,去除上清液，將100 μL 100% ACN加入后等待5 min，吸除，凍干；將5 μL胰蛋白酶加入標(biāo)本，4 ℃保存60 min，膠塊膨脹后，根據(jù)實(shí)際體積加入緩沖液NH4HCO350 mmol/L，置37 ℃ 20 h，將酶解液吸除后移至清潔的EP管內(nèi)，置入TFA、ACN，超聲粉碎后將溶液吸除，向其中加入前次溶液，如此抽提重復(fù)3次，合并且凍干。毛細(xì)血管反相色譜、電噴霧線性離子阱質(zhì)譜分析標(biāo)本，并通過碎片圖譜掃描、全掃描技術(shù)分析多肽及多肽碎片質(zhì)量電荷比。結(jié)合分析結(jié)果對(duì)蛋白質(zhì)庫(kù)進(jìn)行搜索，SEQUEST方法整合分析結(jié)果，從而獲得蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果，并使用GOA軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分類鑒定。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料對(duì)比應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較使用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.12組研究對(duì)象精漿差異蛋白檢測(cè)結(jié)果比較2組研究對(duì)象標(biāo)本唯一肽段數(shù)等于1但肽段總數(shù)大于或等于4、唯一肽段數(shù)大于或等于2時(shí)，有172種差異蛋白，其中研究組標(biāo)本有89種，對(duì)照組標(biāo)本有83種。見圖1～3。

圖1　　精漿SDS PAGE譜圖及切膠部位

圖2　　對(duì)照組精漿蛋白MS-MS圖

2.22組研究對(duì)象差異蛋白的功能分類2組標(biāo)本差異蛋白采用GOA軟件分類處理，表明研究組89種差異蛋白有3種運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白、3種細(xì)胞凋亡關(guān)聯(lián)蛋白，分別為磷脂磷酸水解酶1同工型1、凝血酶敏感素1前體、相對(duì)分子質(zhì)量為400×103的蛋白質(zhì)，另有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白10種、細(xì)胞周期蛋白4種、結(jié)構(gòu)分子7種、催化活性蛋白27種、分子功能未知蛋白19種、生物進(jìn)程未知蛋白29種、細(xì)胞成分未知蛋白27種。酶催化活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白是常見差異蛋白。

圖3　　研究組精漿蛋白MS-MS圖

3　討　　論

臨床研究者一致認(rèn)可的蛋白質(zhì)研究常見工具是Shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)策略，該方式主要借助LC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜偶聯(lián)液相層析技術(shù)完成混合物中蛋白質(zhì)的鑒別，省去蛋白質(zhì)純化的時(shí)間和步驟[2-3]。鑒定到的蛋白質(zhì)根據(jù)peptide counts和unique peptide counts這2個(gè)參數(shù)將其可信度分級(jí):peptide是鑒定到的肽段總數(shù)(這里指重復(fù)肽段也被包含在內(nèi)),非重復(fù)肽段即unique peptide counts是指某組、某種蛋白質(zhì)特有的唯一肽段數(shù)，其中可信度最高的蛋白質(zhì)為unique peptide counts大于或等于2類，其次為unique peptide counts等于1，再次為peptide counts大于或等于4類[4-5]。

人體精漿的蛋白有較大差別，本研究結(jié)合以往成功案例，對(duì)2組研究對(duì)象均使用混合同類標(biāo)本進(jìn)行鑒定，以保證整體研究的順利進(jìn)行和最終結(jié)果的可信度，同時(shí)增加對(duì)比研究，以提高標(biāo)本例數(shù)縮小個(gè)體差異[6-7]。

本研究探討弱精子癥者精液蛋白差異，對(duì)研究組200例和對(duì)照組200例的精液標(biāo)本蛋白進(jìn)行檢測(cè)比較，采用Percoll技術(shù)分離得到精漿、酶解獲得肽段、Shotgun技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)成分，對(duì)比2組標(biāo)本唯一肽段數(shù)等于1但肽段總數(shù)大于或等于4、唯一肽段數(shù)大于或等于2的結(jié)果[8-9]。 本研究結(jié)果顯示，2組標(biāo)本唯一肽段數(shù)等于1但肽段總數(shù)大于或等于4、唯一肽段數(shù)大于或等于2時(shí)，有172種差異蛋白，其中研究組89種，對(duì)照組83種。研究組89種差異蛋白有3種與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的蛋白、3種細(xì)胞凋亡關(guān)聯(lián)蛋白，分別為磷脂磷酸水解酶1同工型1、凝血酶敏感素1前體、相對(duì)分子質(zhì)量為400×103的蛋白質(zhì)，另有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白10種、細(xì)胞周期蛋白4種、結(jié)構(gòu)分子7種、催化活性蛋白27種、分子功能未知蛋白19種、生物進(jìn)程未知蛋白29種、細(xì)胞成分未知蛋白27種。酶催化活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白是常見差異蛋白。10種差異蛋白與弱精子癥緊密相關(guān)，分別為膜聯(lián)蛋白A4、蛋白S100-A9、蛋白S100-A11、維生素D結(jié)合蛋白前體、受體型酪氨酸蛋白磷酸酶η前體、α輔肌動(dòng)蛋白、胞質(zhì)動(dòng)力蛋白、相對(duì)分子質(zhì)量400×103的蛋白質(zhì)、白細(xì)胞介素-6受體β亞單位同工型1前體、聯(lián)蛋白Ⅵ同工型2。

Shotgun鑒定方式也存在一定的局限性,該技術(shù)無(wú)法發(fā)現(xiàn)在表達(dá)豐度上有顯著差異的蛋白質(zhì)，提示本研究得到的172種差異性的蛋白質(zhì)均為“有和無(wú)”的關(guān)系,這些蛋白質(zhì)不能完全代表正常生育者精漿和弱精子癥精漿蛋白質(zhì)的差異性。進(jìn)一步的功能鑒別分類則精細(xì)化地區(qū)別與病情有直接關(guān)聯(lián)的差異性蛋白質(zhì)[10]。

綜上所述，弱精子癥患者精液差異蛋白應(yīng)著重與研究所示的172種差異蛋白進(jìn)行鑒別和統(tǒng)計(jì)分析，篩選關(guān)聯(lián)密切和重要度高的蛋白質(zhì)，通過添加蛋白和封閉方式獲取功能、去除功能，觀察精子運(yùn)動(dòng)能力變化情況，精準(zhǔn)尋找差異蛋白，為臨床診療工作取得突破性的進(jìn)展。

[1]杜曉鐘,陜文生,鄭雷,等.少弱精子癥患者精漿中精子及睪丸組織端粒酶活性實(shí)驗(yàn)研究[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011,32(12):1277-1278.

[2]麥麗萍,張婷婷,姚華伊,等.佛山市1 865例男性不育門診就診者精液質(zhì)量分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2014,35(14):1851-1853.

[3]左江成,曾一芹,艾紅,等.不育男性精漿中免疫球蛋白與精子參數(shù)的相關(guān)分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2012,33(2):166-167.

[4]周俊豪,薛康頤,陳明坤,等.CRISP2基因及蛋白在弱精子癥患者中的表達(dá)及其臨床意義[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,34(10):1528-1533.

[5]顏秋霞,漆正宇,趙曉英,等.ACRV1在正常男性和弱精子癥患者精液精子中的表達(dá)差異[J].中國(guó)男科學(xué)雜志,2015,29(2):12-16.

[6]王海燕,劉能輝,曾鴻,等.特發(fā)性弱精子癥患者精子中peroxiredoxinⅠ與精漿活性氧的關(guān)系[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,39(8):842-848.

[7]劉伯龍,王娟花,肖秀娟,等.硫氧還蛋白-3基因及蛋白在弱精子癥患者中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2015,25(18):31-34.

[8]劉剛,劉淳,崔志剛,等.復(fù)方玄駒膠囊聯(lián)合十一酸睪酮膠丸治療少弱精子癥的臨床觀察[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2014,15(9):998-1002.

[9]申樹林,劉德銘,賀大林,等.GRP78在弱精癥精子和活力正常精子蛋白中的表達(dá)差異研究[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2012,41(1):27-29.

[10]申樹林,梁季鴻,朱春暉,等.睪丸特異性鈣結(jié)合蛋白CBP86-IV表達(dá)水平變化及抗體制備[J].中國(guó)男科學(xué)雜志,2013,20(10):61-62.

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.044

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1673-4130(2016)19-2759-03

2016-04-21

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