李盈潔　饒瑩　曾茜　胡析　王一枝　易學(xué)良　牛英杰　張曉△

(1.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，四川 成都　610500；2.云南省蒙自市人民醫(yī)院，云南 蒙自　661100)

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論著

基于神經(jīng)生物電原理治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用機(jī)制研究*

李盈潔1饒瑩2曾茜1胡析1王一枝1易學(xué)良1牛英杰1張曉1△

(1.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，四川 成都610500；2.云南省蒙自市人民醫(yī)院，云南 蒙自661100)

目的：探究神經(jīng)生物電刺激對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)(Primary dysmenorrhea，PD)大鼠P物質(zhì)(Substance P，SP)的表達(dá)變化的影響。方法：將SD大鼠隨機(jī)分為非模型對(duì)照組、模型對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組3組。實(shí)驗(yàn)組給予股部皮下注射已烯雌酚，每天一次，連續(xù)10 d，第1天0.8 mg·只-1，第2-9天0.4 mg·只-1，第10天0.8 mg·只-1；第11天腹腔注射縮宮素2 U ·只-1；對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行神經(jīng)生物電刺激干預(yù)，并在1 h、3 h和7 h后采用扭體評(píng)分進(jìn)行運(yùn)動(dòng)評(píng)價(jià)。模型對(duì)照組只注射與實(shí)驗(yàn)組相同劑量的已烯雌酚與縮宮素，不進(jìn)行神經(jīng)生物電刺激干預(yù)，其余操作不變。非模型對(duì)照組不注射已烯雌酚與縮宮素，不進(jìn)行神經(jīng)生物電刺激干預(yù)，其余操作不變。免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)各組大鼠脊髓后角中SP的定位及表達(dá)變化，采用免疫熒光技術(shù)探究SP與腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)在脊髓后角的共定位情況。結(jié)果：扭體評(píng)分顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠運(yùn)動(dòng)增加幅度明顯小于模型對(duì)照組(P<0.05)。SP主要分布于脊髓后角Ⅱ板層，所有時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組SP表達(dá)均低于模型對(duì)照組，在3 h表達(dá)差異最大(P<0.05)。免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)顯示SP和BDNF在脊髓后角共表達(dá)。結(jié)論：神經(jīng)生物電刺激能抑制SP的表達(dá)，影響原發(fā)性痛經(jīng)，其機(jī)制可能與SP及BDNF共同作用有關(guān)。

原發(fā)性痛經(jīng)；神經(jīng)生物電刺激；P物質(zhì)；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

原發(fā)性痛經(jīng)(Primary dysmenorrhea，PD)是指非盆腔器質(zhì)性病變引起的痛經(jīng)。西醫(yī)對(duì)PD的治療強(qiáng)調(diào)使用止痛劑、鎮(zhèn)靜劑及前列腺素抑制劑等，不良反應(yīng)多，手術(shù)治療也有一定得療效，但因?yàn)槠渚哂幸欢ǖ木窒扌?，所以手術(shù)治療不易被患者接受[1-2]。因PD的高發(fā)病率及治療棘手，給女性的身心健康和工作學(xué)習(xí)帶來(lái)了嚴(yán)重的影響。因此，探索減輕痛經(jīng)患者的腹痛程度、緩解痛經(jīng)癥狀及提高痛經(jīng)患者的生活質(zhì)量越來(lái)越受到重視。目前已有大量研究表明，神經(jīng)生物電刺激具有鎮(zhèn)痛和延緩疼痛的效果[3-5]。因具有無(wú)創(chuàng)傷、易操作、患者易接受等優(yōu)點(diǎn)，所以我們選擇采用神經(jīng)生物電刺激的方法探討治療PD的方法。

神經(jīng)生物電刺激是治療PD的一種方法。神經(jīng)電刺激主要是利用特定參數(shù)的電流，對(duì)神經(jīng)根及其分支進(jìn)行刺激，進(jìn)而干預(yù)痛覺(jué)反射的神經(jīng)通路。

P物質(zhì)(Substance P，SP)是一種與疼痛密切相關(guān)的物質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛[6-13]，它既能傳遞傷害性信息，也有鎮(zhèn)痛作用[8-9]。P物質(zhì)與神經(jīng)系統(tǒng)及其他遞質(zhì)相互作用、相互配合而發(fā)揮作用，其作用機(jī)制十分復(fù)雜[8,11]。另外，也有研究表明調(diào)節(jié)傷害性信息的重要物質(zhì)還有腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)，它在痛覺(jué)中樞敏化的發(fā)生、發(fā)展與維護(hù)中發(fā)揮作用[14]。

雖然有大量證據(jù)表明SP與BDNF參與了疼痛信號(hào)的傳遞，但是在原發(fā)性痛經(jīng)中神經(jīng)電刺激對(duì)SP與BDNF有什么影響還不清楚，SP與BDNF對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)的作用機(jī)制還有待研究。因此，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)技術(shù)的方法，探究神經(jīng)生物電刺激后SP在脊髓后角的表達(dá)變化及定位；通過(guò)免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)，研究SP和BDNF的定位表達(dá)，探討神經(jīng)生物電刺激治療PD的作用機(jī)制，對(duì)于探索非藥物治療PD的方法，具有十分重要的臨床意義。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物模型制備

1.1.1動(dòng)物與分組

清潔級(jí)健康成年SD雌性大鼠54只，體重220±20 g，由華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為非模型對(duì)照組、模型對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組又各分為1 h、3 h 、7 h組，每組各6只。

1.1.2動(dòng)物模型制備

動(dòng)物隨機(jī)分組經(jīng)2天適應(yīng)后開(kāi)始造模，實(shí)驗(yàn)組股部皮下注射已烯雌酚，每天一次，連續(xù)10 d，第1天0.8 mg·只-1，第2-9天0.4 mg·只-1，第10天0.8 mg·只-1；第11天腹腔注射縮宮素2 U ·只-1；對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行神經(jīng)生物電刺激干預(yù)，并對(duì)大鼠進(jìn)行扭體評(píng)分。模型對(duì)照組只注射與實(shí)驗(yàn)組相同劑量的已烯雌酚與縮宮素，不進(jìn)行神經(jīng)生物電刺激干預(yù)，其余操作不變。非模型對(duì)照組不注射已烯雌酚與縮宮素，不進(jìn)行神經(jīng)生物電刺激干預(yù)，其余操作不變。

1.1.3神經(jīng)生物電刺激

術(shù)后用SDZ-IV型電刺激儀對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行神經(jīng)生物壓電刺激干預(yù)，參數(shù)設(shè)置：疏密波脈沖電流，電流強(qiáng)度為2 mA，頻率2 Hz，刺激6次，時(shí)間30 min。電極經(jīng)皮膚及皮下組織，于大鼠第12胸椎棘突下后正中線(xiàn)右側(cè)旁開(kāi)約2 cm，接正極；后正中線(xiàn)右側(cè)旁開(kāi)約10 cm處接負(fù)極。

1.1.4動(dòng)物扭體評(píng)分[15]

觀察注射縮宮素后大鼠每分鐘扭體反應(yīng)，根據(jù)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，將扭體行為分為4個(gè)等級(jí)。0級(jí)：正常姿勢(shì)(手爪平放盒底或正常探查行為)；1級(jí)：身體向左或右偏斜；2級(jí)：后肢伸展，后爪背屈，軀體伸展伴頻繁地盆骨側(cè)向旋轉(zhuǎn)；3級(jí)：腹部肌肉收縮，伴軀體伸展和后肢伸展。每20 min記錄扭體次數(shù)。以每分鐘行為學(xué)分?jǐn)?shù)=[0級(jí)(次數(shù))×0(分)+1級(jí)(次數(shù))×1(分)+2級(jí)(次數(shù))×2(分)+3級(jí)(次數(shù))×3(分)] ·(分鐘數(shù)/20)-1作為指標(biāo)。

1.2免疫組織化學(xué)技術(shù)

1.2.1取材灌注

在電刺激后的第1 h、3 h、7 h，分別對(duì)大鼠進(jìn)行灌注取材。大鼠過(guò)量麻醉后開(kāi)胸暴露心臟，用眼科剪剪開(kāi)心尖，將灌注針頭經(jīng)左心室插入到主動(dòng)脈，快速灌入200 ml 生理鹽水，至右心耳膨脹時(shí)剪開(kāi)右心耳使大鼠體內(nèi)血液完全排出。之后持續(xù)緩慢滴注300 ml的4%多聚甲醛固定液。灌注固定后取出脊髓組織(胸10至腰2)，取出標(biāo)本置于4%多聚甲醛中后固定，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2免疫組織化學(xué)技術(shù)

脊髓標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后，用切片機(jī)制作厚度為5 μm的石蠟切片，置于60℃的烤箱30 min，常規(guī)二甲苯脫蠟，各級(jí)酒精至水化，3%甲醇雙氧水溶液浸泡10 min，高壓鍋加熱修復(fù)5 min，3%H2O2室溫孵育10 min，羊血清37℃孵育30 min。加一抗(BDNF，Rb，1：100；SP，Ms，1：200)，置入4℃過(guò)夜。SP-9001試劑B液與C液均孵育15 min，DAB-H2O2顯色液，PBS終止并沖洗，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分色，自來(lái)水返藍(lán)，梯度酒精逐級(jí)脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。一抗與二抗均購(gòu)自于中杉金橋生物技術(shù)公司。用于熒光免疫組化的石蠟切片在高壓修復(fù)10 min后，羊血清孵育30 min，加入一抗過(guò)夜后，熒光二抗(cy3，anti-Rb，1：200，Jackson；488，anti-Ms，1：100，中杉金橋)37℃孵育2 h，漂洗后用DAPI甘油封片，鏡檢。

每組選取連續(xù)切片中相同序數(shù)的3張代表切片，在高倍鏡下計(jì)數(shù)脊髓視野免疫陽(yáng)性細(xì)胞并記錄陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值，取5個(gè)視野細(xì)胞數(shù)總和及5個(gè)視野灰度值的平均值。運(yùn)用正置熒光顯微鏡(Olympus BX41，Japan)及Motic光學(xué)顯微鏡采集圖像進(jìn)行觀察分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1痛經(jīng)模型制備

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)扭體反應(yīng)來(lái)評(píng)價(jià)大鼠的痛經(jīng)程度。扭體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型對(duì)照組在1 h，3 h，7 h的評(píng)分均高于非模型對(duì)照組且都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備成功。1 h時(shí)模型對(duì)照組的評(píng)分略高于實(shí)驗(yàn)組，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3 h時(shí)模型對(duì)照組評(píng)分明顯高于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，在所測(cè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)分差異達(dá)到最大值；7 h時(shí)模型對(duì)照組評(píng)分也明顯高于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1　大鼠扭體反應(yīng)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表±S，n=6)

注：與模型對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.2免疫酶組化及免疫熒光組化

2.2.1SP在脊髓后角的表達(dá)變化

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫酶組化實(shí)驗(yàn)來(lái)反映SP在脊髓后角的定位表達(dá)，結(jié)果顯示SP免疫反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)呈棕色、纖維狀，主要分布于脊髓后角Ⅰ板層和Ⅱ板層，且在實(shí)驗(yàn)組與模型對(duì)照組的不同時(shí)間段均有表達(dá)。與非模型對(duì)照組相比(圖1-a，b，c)，模型對(duì)照組SP免疫陽(yáng)性物質(zhì)表達(dá)均增加，1 h的表達(dá)量較低，3 h達(dá)到峰值，到7 h有所下降(圖1-d，e，f)，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組SP免疫陽(yáng)性物質(zhì)的表達(dá)量在1 h表達(dá)較低，在3 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，7 h有所下降(圖1-g，h，i)，并且在1 h、3 h、7 h時(shí)的表達(dá)量均明顯小于模型對(duì)照組，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SP在脊髓后角的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1　脊髓后角SP的表達(dá)情況(IHC，400X)

圖2　脊髓后角SP表達(dá)變化統(tǒng)計(jì)圖(IHC，400X)注：與模型對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.2.2SP與BDNF在脊髓后角共表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)顯示，SP與BDNF在脊髓后角Ⅱ板層共定位表達(dá)。染色為紅色的為BDNF的定位，綠色的為SP的定位，藍(lán)色的染出細(xì)胞核，顯示黃褐色與藍(lán)色的圖片為BDNF、SP及細(xì)胞核的共定位表達(dá)，如圖3。

圖3　SP和BDNF免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果(IF，200X)

3　討論

原發(fā)性痛經(jīng)是女性常見(jiàn)的給身心健康和工作學(xué)習(xí)帶來(lái)嚴(yán)重的影響的疾病，目前還沒(méi)有比較好的治療方法。神經(jīng)生物電刺激對(duì)緩解痛經(jīng)有一定的療效，因此，本實(shí)驗(yàn)探討神經(jīng)生物電刺激對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示神經(jīng)生物電刺激過(guò)后，大鼠原發(fā)性痛經(jīng)癥狀減輕，脊髓后角的SP明顯較少，BDNF在脊髓后角與SP共定位表達(dá)。

3.1神經(jīng)電刺激通過(guò)抑制SP的表達(dá)來(lái)緩解痛經(jīng)。

大量研究表明，疼痛的信號(hào)主要是由各種神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，SP是傳導(dǎo)傷害性疼痛的一種興奮性遞質(zhì)，它在傳入神經(jīng)的突觸釋放，產(chǎn)生致痛作用[16-18]。在多種慢性疼痛中，SP作為疼痛遞質(zhì)通過(guò)感覺(jué)神經(jīng)傳入纖維向上傳遞至脊髓中樞， 參與疼痛在脊髓中樞的傳導(dǎo)和調(diào)制[19]。因此，痛覺(jué)傳導(dǎo)通路上的SP的釋放加重PD的重要原因。臨床觀察表明神經(jīng)電刺激能夠緩解疼痛，但是其作用機(jī)制不清楚。

本實(shí)驗(yàn)用免疫組織化學(xué)和免疫熒光的技術(shù)觀察SP在脊髓后角的表達(dá)變化，以探討神經(jīng)生物電療法治療痛經(jīng)的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，SP免疫反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)呈棕色、纖維狀，在脊髓后角Ⅰ板層和Ⅱ板層分布，與其他的研究結(jié)果相同[20]。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明與模型對(duì)照組相比SP免疫反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)在神經(jīng)生物電刺激后在脊髓后角的表達(dá)減少，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示神經(jīng)電刺激能夠減少SP的表達(dá)，緩解痛經(jīng)的疼痛傳導(dǎo)。其作用機(jī)制是神經(jīng)生物電刺激產(chǎn)生的疼痛刺激可作為一種神經(jīng)生物電信號(hào)，通過(guò)脊髓細(xì)纖維(Aβ類(lèi)神經(jīng)纖維和C纖維)傳導(dǎo)，激活脊髓后角的神經(jīng)細(xì)胞，興奮后角膠狀質(zhì)細(xì)胞，使其釋放神經(jīng)遞質(zhì)，抑制神經(jīng)細(xì)胞傳導(dǎo)，不再傳遞另一個(gè)疼痛沖動(dòng)的刺激信號(hào)，出現(xiàn)鎮(zhèn)痛作用。Chen YW等人的研究也表明，對(duì)術(shù)后的大鼠進(jìn)行神經(jīng)生物電刺激，會(huì)減少SP在脊髓的釋放，抑制異常性疼痛[21]。用高頻經(jīng)皮電神經(jīng)刺激抑制SP在大鼠背根神經(jīng)節(jié)表達(dá)，減弱手術(shù)后的疼痛[22]，上述的研究支持我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所以，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示神經(jīng)生物電刺激通過(guò)減少SP的表達(dá)，在脊髓減少傷害性信息傳遞，緩解痛經(jīng)。

3.2BDNF可能與SP的共同作用來(lái)影響痛經(jīng)。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，SP與BDNF在脊髓后角的共表達(dá)，提示著B(niǎo)DNF可能與SP的共同作用，增強(qiáng)痛經(jīng)的疼痛程度。

研究表明，在痛信號(hào)產(chǎn)生的初始階段，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，釋放細(xì)胞因子，如BDNF、TNF-α和SP等[23]。因此，在神經(jīng)病理性疼痛下，脊髓活化的小膠質(zhì)細(xì)胞BDNF的表達(dá)增加，與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)顯示，SP與BDNF共同在脊髓后角2板層表達(dá)，提示BDNF與SP共同作用，增強(qiáng)痛經(jīng)的疼痛程度。因此，BDNF與SP在脊髓強(qiáng)化痛信號(hào)的產(chǎn)生和傳遞中都發(fā)揮作用。Chen FX等人的研究表明，BDNF會(huì)通過(guò)增強(qiáng)SP的興奮性來(lái)加速腸道蠕動(dòng)[24]，說(shuō)明兩者在調(diào)節(jié)生命活動(dòng)的過(guò)程中有聯(lián)系，支持我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，神經(jīng)生物電刺激后，SP表達(dá)減少，表明神經(jīng)生物電刺激具有減輕大鼠原發(fā)性痛經(jīng)的疼痛的作用。BDNF可能與SP共同作用來(lái)影響痛經(jīng)，但是其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Research of the therapy of the primary dysmenorrhea based on the principle of neurobiology electric*

Li Ying-Jie1, Rao Ying2, Zeng Xi1, Hu Xi1, Wang Yi-Zhi1, Yi Xue-Liang1, Niu Ying-Jie1, Zhang Xiao1△

(1.ExperimentalTeaching Center of Basic Medical Science of Chengdu Medical College,Sichuan Chengdu 610500; 2. People′s Hospital of Mengzi City, Yunnan Mengzi 661100)

Objective：To explore the influence of substance P (SP) on rats with primary dysmenorrhea after electric therapy. Methods: SD rats were divided into 3 groups: control group, model group and experimental group. Rats in experimental group were given diethylstilbestrol injection in subcutaneous tissue of femoral region once a day for 10 days. Each rat was given 0.8 mg diethylstilbestrol injection at the first day, 0.4 mg diethylstilbestrol injection from second day to ninth day, 0.8 mg diethylstilbestrol injection on ten day. Each rat was given 2 U oxytocin by intraperitoneal injection on the eleventh day. Rats in the experimental group were given the intervention of neural bioelectricity stimulation and evaluated by the twisting reaction scores in 1 h, 3 h, and 7 h after the intervention. Rats in model group were given the same diethylstilbestrol injection and oxytocin as the rats in experimental group, not the intervention of neural bioelectricity stimulation. The remaming operations in model of group were also the same as that in experimental group. Rats in control group were not given the diethylstilbestrol injection and oxytocin or the intervention of neural bioelectricity stimulation. The remaming operations in model of group were also the same as that in experimental group. In addition, immunohistochemistry was used to observe the distribution and the expression of SP in the posterior horn of the spinal cord. Immunofluorescence was used to detect whether SP and brain derived neurotrophic factor (BDNF) co-expressed in the posterior horn of the spinal cord. Results: Twisting reaction scores in the experimental group were significantly less than that in the model group (P<0.05). Immunohistochemistry results showed that SP was mainly located in the second layer of posterior horn of spinal cord. Positive cells in the experimental group were always less than that in the model group, and the expression at 3 h had the most significantly difference between the two groups (P<0.05). Immunofluorescence indicated that SP and BDNF were co-expressed in the posterior horn of spinal cord. Conclusion: Electric therapy of neurobiology can inhibit the expression of SP and influence the primary dysmenorrhea, which may have some relations to the interaction between SP and BDNF.

Primary dysmenorrhea; Neurobiology electric therapy; Substance P; Brain derived neurotrophic factor

成都醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(編號(hào)：CX201213)

李盈潔，女，成都醫(yī)學(xué)院2014級(jí)臨床本科在讀學(xué)生，主要從事脊髓損傷與修復(fù)研究，Email：1049667281@qq.com。

張曉，男，教授，主要從事脊髓損傷與修復(fù)研究，Email：954073462@qq.com。

2016-4-8)