趙 平，楊 光，鄒積宏

(1.黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，黑龍江哈爾濱 150028；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150010)

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京尼平苷微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)京尼平的研究

趙 平1，楊 光1，鄒積宏2

(1.黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，黑龍江哈爾濱 150028；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150010)

[目的]以京尼平苷為原料，在自然pH下，通過(guò)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的鄔衣黑曲霉發(fā)酵將京尼平苷轉(zhuǎn)化為京尼平。[方法]通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)考察了京尼平苷液濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、鄔衣黑曲霉孢子的接入量、搖瓶裝量對(duì)京尼平生成量的影響。[結(jié)果]最終確定最佳工藝為：在自然pH條件下，以0.20%京尼平苷液為發(fā)酵培養(yǎng)基，按菌株孢子與發(fā)酵培養(yǎng)基3.0∶10.0(V/V)的比例接入鄔衣黑曲霉孢子，搖瓶裝量為100 mL/250 mL，28 ℃，200 r/min發(fā)酵66 h。發(fā)酵結(jié)束后高效液相色譜檢測(cè)京尼平，結(jié)果顯示京尼平苷的轉(zhuǎn)化率可達(dá)99%以上，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物京尼平純度可達(dá)98%以上。[結(jié)論]該研究所用方法安全、高效，是生產(chǎn)京尼平的可行方法。

京尼平苷；京尼平；微生物；轉(zhuǎn)化率

梔子是我國(guó)大宗傳統(tǒng)中藥材，為茜草科植物梔子(Gardeniajasminoides)的成熟干燥果實(shí)，是中藥臨床治療黃疸型肝炎的首選中藥材[1]。梔子干果中含有梔子黃色素、京尼平苷和京尼平，京尼平在梔子果實(shí)中的含量相當(dāng)?shù)?0.005%～0.010%)，而京尼平苷的含量豐富(3.06%～4.12%)[2-3]。京尼平是一種環(huán)烯醚萜類(lèi)物質(zhì)，無(wú)毒[4]。近年來(lái)，由于京尼平在抗腫瘤[1，4]、治療肝硬化[1，4-5]等方面療效顯著，同時(shí)作為一種新興的藥物中間體具有很多重要的藥理價(jià)值，因此具有很好的應(yīng)用前景。京尼平還作為一種新型的生物交聯(lián)劑被應(yīng)用于生物材料中[6-9]，它不僅能形成穩(wěn)定的交聯(lián)制品，且具有細(xì)胞毒性小、生物相容性好、抗降解能力強(qiáng)和應(yīng)用領(lǐng)域廣泛等優(yōu)點(diǎn)，是非常有前途的交聯(lián)材料。由于京尼平在自然界中的含量較少[10]，直接提取十分困難，目前國(guó)際市場(chǎng)價(jià)高達(dá)80萬(wàn)元/kg(≥99%純度)，嚴(yán)重制約了京尼平的廣泛應(yīng)用。但京尼平苷為易得的組分，是天然前體物，可利用其與β-葡萄糖苷酶反應(yīng)生成京尼平[3，10]。而β-葡萄糖苷酶價(jià)格昂貴，且它很難將京尼平苷完全轉(zhuǎn)化為京尼平，所以未能應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

由于京尼平在自然界中的含量較低，直接提取困難，國(guó)際市場(chǎng)價(jià)高制約了京尼平的應(yīng)用，然而京尼平苷以京尼平的糖苷形式大量存在于梔子中，提取工藝簡(jiǎn)單，售價(jià)低。酸堿水解打斷糖苷鍵的方法導(dǎo)致京尼平遭到破壞，影響生物活性，酶解法成本過(guò)高，限制了工業(yè)化生產(chǎn)。所以微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化方法生產(chǎn)京尼平是必然趨勢(shì)。該研究利用一株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的真菌黑曲霉發(fā)酵京尼平苷，將其轉(zhuǎn)化為京尼平，并對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，從而最大程度地提高京尼平的產(chǎn)量，使其可以作為一種新的生物學(xué)和藥學(xué)材料被廣泛應(yīng)用。

1　材料與方法

1.1試材京尼平苷(≥98%)，杭州臨安天鴻生物科技有限公司；宇佐美曲霉AS3.758，浙江微生物研究所。

1.2設(shè)備YXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；THZ-C恒溫振蕩器，江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；TDL-40B型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52AAA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海嘉鵬科技有限公司；SPD-20A高效液相色譜儀，日本島津。

1.3方法

1.3.1培養(yǎng)基與菌株孢子培養(yǎng)。

1.3.1.1培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L；葡萄糖10 g/L；水。121 ℃滅菌30 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：京尼平苷水溶液，自然pH。

1.3.1.2菌株孢子的培養(yǎng)。無(wú)菌操作，挑取菌種接種于種子培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min，培養(yǎng)48 h，得菌株孢子，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.3京尼平苷的發(fā)酵。將菌株孢子洗去表面培養(yǎng)基接入發(fā)酵培養(yǎng)基，200 r/min，一定溫度發(fā)酵。

1.3.2京尼平苷和京尼平的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立。高效液相色譜法對(duì)發(fā)酵底物和產(chǎn)物進(jìn)行分析，色譜條件：色譜柱(C18，250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm，進(jìn)樣20 L，流動(dòng)相為甲醇∶水(45∶55，V/V)，流速0.8 mL/min。利用此條件對(duì)京尼平苷和京尼平進(jìn)行含量分析，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程分別為y= 245 203x-68 472(r= 0.999 8)、y= 5×107x-6200.6(r= 0.999 9)。

1.3.3京尼平苷轉(zhuǎn)化率的計(jì)算。發(fā)酵前發(fā)酵培養(yǎng)基中京尼平苷的含量減去發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵所得京尼平液中京尼平苷的含量與發(fā)酵前培養(yǎng)基中京尼平苷的含量之比。

1.3.4發(fā)酵條件的優(yōu)化。

1.3.4.1單因素試驗(yàn)。稱(chēng)取一定量的京尼平苷配成京尼平苷水溶液，自然pH，搖瓶裝液量為50 mL/250 mL，121 ℃滅菌30 min，按菌株孢子與發(fā)酵培養(yǎng)基2.0∶10.0(V/V)的比例接入宇佐美曲霉孢子，轉(zhuǎn)速200 r/min，28 ℃進(jìn)行微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化。在此基礎(chǔ)上對(duì)京尼平苷濃度、發(fā)酵轉(zhuǎn)化溫度、時(shí)間、菌株孢子接入量、搖瓶裝液量進(jìn)行單因素考察，確定最佳的發(fā)酵轉(zhuǎn)化條件。

1.3.4.2正交試驗(yàn)。通過(guò)單因素試驗(yàn)的考察確定正交試驗(yàn)因素水平，采用L16(45)進(jìn)行正交試驗(yàn)(表1)，優(yōu)化發(fā)酵條件。

1.3.5發(fā)酵過(guò)程的監(jiān)控。250 mL三角瓶中，加入0.20%京

表1　正交試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)

尼平苷溶液50 mL，無(wú)菌操作以2.0∶10.0的比例接入接種物，在自然pH條件下，28 ℃，200 r/min，搖床發(fā)酵120 h。發(fā)酵12 h后，每隔4 h取一次發(fā)酵菌液，發(fā)酵結(jié)束后過(guò)濾除去菌絲，然后以HPLC峰面積法來(lái)測(cè)定京尼平苷和京尼平的含量。

1.3.6京尼平液凍干。發(fā)酵結(jié)束后過(guò)濾除去菌絲，將所得京尼平液減壓濃縮后，凍干得白色結(jié)晶狀粉末。

2　結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1單因素試驗(yàn)。

2.1.1.1時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響。從圖1可以看出，轉(zhuǎn)化66 h后京尼平苷的轉(zhuǎn)化率即可達(dá)95%以上，72 h達(dá)99%以上且隨轉(zhuǎn)化時(shí)間的增加，轉(zhuǎn)化率不再增加，而培養(yǎng)基顏色會(huì)逐漸加深，因?yàn)樗镁┠崞脚c發(fā)酵培養(yǎng)基中游離氨基酸發(fā)生反應(yīng)，生成了梔子藍(lán)色素，且反應(yīng)不可逆。為了減少損失，反應(yīng)時(shí)間應(yīng)控制在84 h以?xún)?nèi)。

圖1　發(fā)酵時(shí)間對(duì)京尼平苷轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1　Effects of fermentation time on the transformation rate of geniposide

2.1.1.2發(fā)酵培養(yǎng)基中京尼平苷含量對(duì)發(fā)酵的影響。由圖2可見(jiàn)，當(dāng)京尼平苷含量高于0.20%時(shí)京尼平苷轉(zhuǎn)化率并不高，由于反應(yīng)不徹底京尼平苷的損失量較大，且所得京尼平不純；當(dāng)京尼平苷含量低于0.20%時(shí)，京尼平苷轉(zhuǎn)化率可達(dá)99%以上，且所得京尼平純度較高。

圖2　京尼平苷含量對(duì)京尼平苷轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2　Effects of geniposide content on the transformation rate of geniposide

2.1.1.3發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵的影響。由圖3可見(jiàn)，當(dāng)發(fā)酵溫度為28～30 ℃時(shí)，京尼平苷轉(zhuǎn)化率達(dá)99%以上，而溫度升高轉(zhuǎn)化率反而下降，這是由于溫度升高酶活受到抑制，且發(fā)酵培養(yǎng)的顏色有所加深。溫度高導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生成的京尼平易與培養(yǎng)基中的游離氨基酸反應(yīng)生成梔子藍(lán)色素，反應(yīng)不可逆，造成京尼平損失。

2.1.1.4菌株孢子接入量對(duì)發(fā)酵的影響。由圖4可見(jiàn)，當(dāng)菌株孢子接入量達(dá)2.0∶10.0(V/V)時(shí),京尼平轉(zhuǎn)化率可達(dá)98%以上，接入量再增加時(shí)京尼平轉(zhuǎn)化率無(wú)明顯增加，且會(huì)增加發(fā)酵培養(yǎng)基中游離氨基酸的機(jī)會(huì)。

2.1.1.5搖瓶裝量對(duì)發(fā)酵的影響。由圖5可見(jiàn)，當(dāng)搖瓶裝量為50 mL/250 mL時(shí),京尼平苷轉(zhuǎn)化率可達(dá)99%以上，隨著搖瓶裝量的增加京尼平苷轉(zhuǎn)化率逐級(jí)降低。搖瓶裝量與轉(zhuǎn)化環(huán)境的溶氧量有直接關(guān)系，增大溶氧量有利于菌株孢子生長(zhǎng)、產(chǎn)酶，促進(jìn)京尼平苷的轉(zhuǎn)化。

圖3　發(fā)酵溫度對(duì)京尼平苷轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3　Effects of fermentation temperature on the transformation rate of geniposide

圖4　菌株孢子接入量對(duì)京尼平苷轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4　Effects of inoculation quantity of strain spores on the transformation rate of geniposide

圖5　搖瓶裝量對(duì)京尼平苷轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5　Effects of bottled liquid volume on the transformation rate of geniposide

2.1.2正交試驗(yàn)。從表2可看出，發(fā)酵培養(yǎng)基中各因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的影響從大到小依次為A、D、E、B、C，即京尼平苷含量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量有很大影響。發(fā)酵最佳條件為A1B3C1D4E1，即發(fā)酵培養(yǎng)基中京尼平苷含量為0.15%，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時(shí)間為66 h，菌株孢子接入量為3.0∶10.0(V/V)，搖瓶裝量為50 mL/250 mL。但實(shí)際操作過(guò)程中，搖瓶裝量過(guò)少會(huì)影響最終的京尼平產(chǎn)量，溫度高既浪費(fèi)能源又會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生成的京尼平與培養(yǎng)基中的游離氨基酸反應(yīng)造成京尼平的損失，而增加搖瓶裝量的同時(shí)需增加京尼平苷含量來(lái)提供發(fā)酵所需的原料。通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)的綜合分析，將京尼平苷含量確定為0.20%，發(fā)酵溫度確定為28 ℃，搖瓶裝量確定為100 mL/250 mL。因此，最終確定發(fā)酵的最佳條件為A2B2C1D4E3，即發(fā)酵培養(yǎng)基中京尼平苷含量為0.20%，發(fā)酵溫度為28 ℃，發(fā)酵時(shí)間為66 h，菌株孢子接入量為3.0∶10.0(V/V)，搖瓶裝量為100 mL/250 mL。

按優(yōu)化方案進(jìn)行平行發(fā)酵試驗(yàn)3次，發(fā)現(xiàn)京尼平苷的轉(zhuǎn)化率為99.24%，京尼平的純度可達(dá)99.01%。然而在發(fā)酵工藝可行性的確定上，培養(yǎng)基的成本是關(guān)鍵因素，該試驗(yàn)中所用京尼平苷可以通過(guò)梔子的提取獲得，且梔子中京尼平苷含量相對(duì)較高，而在發(fā)酵培養(yǎng)基中沒(méi)有其他營(yíng)養(yǎng)物的加入，所以產(chǎn)品的價(jià)值可觀。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2發(fā)酵工藝的特點(diǎn)從圖6可看出，在發(fā)酵過(guò)程中京尼平苷的轉(zhuǎn)化隨β-葡萄糖苷酶的活性一起增長(zhǎng)，但在72～84 h京尼平苷的轉(zhuǎn)化率幾乎不再增長(zhǎng)。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，京尼平濃度開(kāi)始下降，可能由于京尼平和游離氨基酸反應(yīng)造成。因此，京尼平苷完全轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)酵應(yīng)停止，京尼平應(yīng)立即提取，避免降低產(chǎn)率。

圖6　發(fā)酵時(shí)間與京尼平濃度的關(guān)系Fig.6　Relations of fermentation time with genipin and geniposide concentration

發(fā)酵所得京尼平樣品與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比(圖7)發(fā)現(xiàn)，京尼平苷標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間為6.8 min，京尼平標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為10.5 min；發(fā)酵進(jìn)行60 h時(shí)發(fā)酵體系中產(chǎn)物在6.8 min有色譜峰產(chǎn)生，京尼平苷轉(zhuǎn)化不完全；發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)物京尼平在10.5 min處有色譜峰產(chǎn)生，且6.8 min處無(wú)明顯峰產(chǎn)生。表明京尼平苷和宇佐美曲霉菌株進(jìn)行發(fā)酵可完全將京尼平苷轉(zhuǎn)化為京尼平。

注：a.京尼平苷標(biāo)準(zhǔn)品；b.京尼平標(biāo)準(zhǔn)品；c.發(fā)酵60 h時(shí)發(fā)酵體系中產(chǎn)物；d.發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)物京尼平。Note：a.Standard of geniposide；b.Standard of genipin；c.Products in the fermentation system 60 h after the fermentation；d.Genipin after the ending of the fermentation.圖7 　發(fā)酵樣品與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比Fig.7　Comparison of fermentation samples and standards

3　結(jié)論

該試驗(yàn)利用一株黑曲霉菌種通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)考察了京尼平苷液濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、宇佐美曲霉孢子的接入量、搖瓶裝量對(duì)京尼平生成量的影響。結(jié)果表明，最佳工藝為：在自然pH條件下，以0.20%京尼平苷液為發(fā)酵培養(yǎng)基，按菌株孢子與發(fā)酵培養(yǎng)基3.0∶10.0(V/V)的比例接入宇佐美曲霉孢子，搖瓶裝量為100 mL/250 mL，28 ℃，200 r/min發(fā)酵66.0 h，并成功地將京尼平苷轉(zhuǎn)化為京尼平且轉(zhuǎn)化率可達(dá)99%，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物京尼平的純度可達(dá)98%以上。在發(fā)酵培養(yǎng)基中不需加入其他的物質(zhì)且pH自然，因此，這種方法成本低、轉(zhuǎn)化率高，轉(zhuǎn)化液中不含其他雜質(zhì)，所得京尼平純度高且可控性好，具有工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。

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Research on Transformation of Geniposide to Genipin by Microorganism Fermentation

ZHAO Ping1, YANG Guang1, ZOU Ji-hong2

1. Quality Supervision and Testing Institute of Heilongjiang Province, Harbin, Heilongjiang 150028; 2. College of Life Science, Heilongjinag University, Harbin, Heilongjiang 150010)

[Objective] To transform geniposide to genipin by fermentation ofAspergillususamiithat can produce β-glucosidase under the condition of natural pH. [Method] Through a single factor experiment and orthogonal design experiment, the effects of geniposide concentration, fermentation temperature, fermentation time, inoculation quantity ofA.usamiispores, and bottled liquid volume on the production of genipin were analyzed. [Result] The optimum process is shown as follows: under the condition of natural pH, 0.20% geniposide was as the fermentation medium, and the proportion of the spores to the fermentation medium was 3.0∶10.0 (V/V); bottled liquid volume was 100 mL/250 mL; the fermentation was conducted for 66 h at 28 ℃ at the rotating speed of 200 r/min. Under the optimum conditions, the purity of genipin was more than 98% ,and the conversion rate of geniposide reached more than 99% through HPLC testing. [Conclusion] The method is safe, efficient and feasible to produce genipin.

Geniposide; Genipin; Microorganism; Conversion rate

趙平(1985- )，男，黑龍江哈爾濱人，助理研究員，碩士，從事食品微生物檢測(cè)與研究。

2016-07-08

S 567

A

0517-6611(2016)26-0098-04