杜 鵬

貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州貴陽 550004)

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粗莖秦艽中的人工生物堿及化學(xué)成分研究

杜 鵬

貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州貴陽 550004)

[目的]研究粗莖秦艽中的人工生物堿及其他化學(xué)成分。[方法]以含氨溶劑對粗莖秦艽進行提取后，利用硅膠色譜分離純化該浸膏中的化學(xué)成分,根據(jù)化合物的理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。[結(jié)果]分離并鑒定了8個化合物,其結(jié)構(gòu)分別為粗莖龍膽堿A(gentiocrasine A，Ⅰ)、粗莖龍膽堿B(gentiocrasine B，Ⅱ)、秦艽甲素(gentianine，Ⅲ)、秦艽丙素(gentianal，Ⅳ)、西藏龍膽堿(gentiatibetine，Ⅴ)、胡蘿卜苷(daucosterol，Ⅵ)、β-谷甾醇(β-sitosterol，Ⅶ)、棕櫚酸(plamitic acid，Ⅷ)。[結(jié)論]化合物Ⅰ和化合物Ⅱ為首次得到的化合物。

粗莖秦艽；生物堿；化學(xué)成分

秦艽RadixGentianaeMacrophyllae是我國重要的傳統(tǒng)中藥之一，在我國具有悠久的藥用歷史，具有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛的功能，臨床上用于風(fēng)濕痹痛、筋脈拘攣、骨節(jié)酸痛、日曝潮熱和小兒疳積發(fā)熱等癥。粗莖秦艽是中藥志記載的秦艽主要原植物之一，分布于我國四川、云南西北部及西藏與四川的接壤地區(qū)，目前市場上流通的秦艽藥材多為粗莖秦艽。

秦艽主要含裂環(huán)烯醚萜苷、甾醇苷、揮發(fā)油和糖類等成分[1-2]，前人曾從秦艽G.macrophyllyPall.中分離到數(shù)種生物堿[3-5]，但其后的研究表明秦艽生物堿類成分是在提取處理過程中由裂環(huán)烯醚萜苷類成分與氨作用轉(zhuǎn)化而來[6-8]，并非秦艽中本來存在的化學(xué)成分。楊肖鋒等[9]分析認(rèn)為龍膽苦苷的抗炎藥效是龍膽苦苷轉(zhuǎn)化為生物堿后二者的總和作用。喬衛(wèi)等[10]研究指出環(huán)烯醚萜苷和其乙酰酯在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的半縮醛和其他衍生物，這些衍生物才是具有藥理活性的物質(zhì)。為了更深入地探索秦艽藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，該研究首次對龍膽科植物粗莖秦艽進行了生物堿類化學(xué)成分的研究，并通過硅膠柱色譜及UV、IR、NMR、MS等波普技術(shù)鑒定化合物結(jié)構(gòu)，以期為秦艽藥理活性研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。藥材秦艽購于貴州省藥材市場，由貴州醫(yī)科大學(xué)龍慶德副教授鑒定為粗莖秦艽GentianacrassicaulisDuthie ex Burk.的干燥根。

1.1.2儀器。Bruker AC-E200和Varian Unity INOVA 400/54核磁共振儀，TMS為內(nèi)標(biāo)；FINNIGAN LCQDECA 質(zhì)譜儀； VECTOR22紅外儀，KBr壓片；Cintra 10e UV-Visible Spectrometer紫外可見分光光度計；Perkin Elmer Mode-134微量旋光儀；Boetius微量熔點測定儀；Sartorius BP-211D電子天平；Senco R201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.1.3試劑。薄層層析用硅膠G為吸附劑，以0.5%CMC-Na調(diào)制涂板(0.3～1.4 mm)，改良Dragendorff’s試劑和8%硫酸乙醇試劑顯色；柱層析用硅膠H為吸附劑；硅膠均為青島海洋化工廠制品；氯仿、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇為分析純。

1.2提取與分離取干燥粗莖秦艽9.5 kg，粉碎。以混合溶液：吐溫80-70%乙醇溶液-10%氨水(0.5∶99.5∶14.0)浸潤24 h后滲漉。以5%鹽酸調(diào)節(jié)滲漉液至pH 1～2，酸水液用氯仿萃取，氯仿萃取液回收溶劑后得到流動性較大的棕色油狀浸膏A(120 g)；用濃氨水將酸水部分堿化至pH 5～6，用氯仿萃取至水液中無生物堿檢出，濃縮氯仿萃取液得流動性較大的棕色浸膏B(60 g)。

A部分(120 g)經(jīng)減壓硅膠H柱層析，氯仿-甲醇系統(tǒng)(按1%比例加入二乙胺)，梯度洗脫(99∶1～4∶1)，洗脫液以TLC指導(dǎo)合并得A1、A2、A3三部分。A1濃縮后析出化合物Ⅵ;A2濃縮后析出無色針晶，以丙酮重結(jié)晶得化合物Ⅶ;A3濃縮后析出化合物Ⅷ。B部分(60 g)經(jīng)減壓硅膠H柱層析，石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(按1%比例加入二乙胺)，梯度洗脫(99∶1～4∶1)，洗脫液以TLC指導(dǎo)合并得B1、B2、B3三部分。B1濃縮后析出黃色柱狀結(jié)晶，以丙酮重結(jié)晶后得化合物Ⅳ。B2經(jīng)硅膠H柱層析，石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)，梯度洗脫(99∶1～4∶1)，洗脫液以TLC指導(dǎo)合并得到C1、C2兩部分。B3經(jīng)硅膠H柱層析，石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)，梯度洗脫(99∶1～4∶1)，洗脫液以TLC指導(dǎo)合并后析出化合物V。

C1濃縮后析出白色羽狀結(jié)晶，以環(huán)己烷重結(jié)晶后得化合物Ⅲ。C2部分經(jīng)硅膠H柱層析，石油醚-乙酸乙酯(4∶1)洗脫，洗脫液以TLC指導(dǎo)合并得D1、D2兩部分。D1濃縮后得到化合物Ⅰ；D2濃縮后得到化合物Ⅱ。

2　結(jié)果與分析

對龍膽科植物粗莖秦艽加氨后提取分離得到了8個化合物，其中5個是裂環(huán)烯醚萜苷類生物堿，且化合物Ⅰ和化合物Ⅱ為首次得到的化合物。秦艽生物堿類化合物均未見碳譜數(shù)據(jù)報導(dǎo)，該研究補充了秦艽丙素、西藏龍膽堿的碳譜數(shù)據(jù)。

1H-1H COSY譜與HMQC譜提示分子中含有-CH2-CH2-O-結(jié)構(gòu)：δ 4.12 (1H,ddd,J=11.92 Hz,3.16 Hz,2.88 Hz)和δ 3.64(1H,m)為同碳上非化學(xué)等價的共振峰，該亞甲基碳與氧相連，其化學(xué)位移為δ 56.2。δ 2.95(1H,m)和δ 2.56(1H,m)為同碳上非化學(xué)等價的共振峰，該亞甲基碳的化學(xué)位移為δ 27.4，并從HMBC譜觀察到該亞甲基上2個

氫與吡啶環(huán)的C3、C4、C5均有相關(guān)信號，說明該碳與C5相連。同時HMBC譜上顯示δ 5.49(1H,s)的質(zhì)子信號與位移值為δ 27.4的亞甲基碳相關(guān)，推測分子中含有吡啶單萜結(jié)構(gòu)。

另外，Ⅰ的氫譜中δ 2.45(3H,s)為一個處于較低場的甲基信號，由HMBC譜觀察到該甲基上的氫與吡啶環(huán)上的C2、C3之間的遠程相關(guān)，推斷該甲基與C2相連，HMQC譜提示該甲基碳的化學(xué)位移為δ 21.1。

Ⅰ的氫譜還可見δ 3.92(1H,m)、δ 3.64(1H,m)和δ 1.26(3H,t,J=7.06 Hz)的一組共振峰信號，由化學(xué)位移及質(zhì)子的相互耦合情況推測分子中含有乙氧基，其中信號δ 3.92(1H,m)、δ 3.64(1H,m)為同碳上非化學(xué)等價的共振峰；HMQC譜及DEPT譜提示該乙氧基中2個碳的化學(xué)位移分別為δ 63.5(CH2)和δ 15.0(CH3)。由HMBC譜觀察到質(zhì)子信號δ 5.49(1H,s)與碳信號δ 63.5(CH2)相關(guān)，說明該乙氧基與環(huán)醚結(jié)構(gòu)中的次甲基相連。

根據(jù)以上證據(jù)，推斷化合物Ⅰ結(jié)構(gòu)如圖1，并歸屬了Ⅰ的NMR數(shù)據(jù)(表1)，HMBC圖譜關(guān)鍵相關(guān)信息見圖2。該研究是首次獲得該化合物，暫命名為粗莖龍膽堿A(gentiocrasine A)。

圖1　化合物Ⅰ結(jié)構(gòu)式Fig.1　Structure of compound Ⅰ

CδCHδH(J=Hz)1H-1HCOSYHMBC(HtoC)2158.5,C2———3128.3,C3———4143.0,C4———5121.3,CH56.84,d(1H,d,4.8)63,4,6,106147.7,CH68.25,d(1H,d,5.2)52,4,5794.4,CH75.48(1H,s)—2,3,4,9,12956.2,CH29a4.11(1H,ddd,11.92,3.16,2.88)9b,10a,10b4,79b3.84(1H,m)9a,10a4,7,101027.4,CH210a2.52(1H,m)9a,9b,10b3,4,5,910b2.94(1H,m)5,9a,9b,10a3,4,51121.1,CH3112.45(3H,s)—2,31263.5,CH212a3.64(1H,m)12b,137,1312b3.92(1H,m)12a,137,131315.0,CH3131.25(3H,t,6.8)12a,12b12

圖2　化合物Ⅰ的HMBC圖譜的關(guān)鍵相關(guān)信息Fig.2　Key correlation information of HMBC spectrum of compound Ⅰ

Ⅱ的碳氫譜數(shù)據(jù)與Ⅰ比較，乙氧基的數(shù)據(jù)相似：1H-NMR(CDCl3，200 MHz)譜中可見δ 3.85(1H,m)、δ 3.68(1H,m)和δ 1.27(3H,t,J=7.00)的乙氧基共振峰信號，結(jié)合13C-NMR(DEPT)譜推斷該乙氧基的化學(xué)位移分別為δ 64.0(CH2)和δ 15.2(CH3)。由于Ⅱ分子中的環(huán)醚與二氫吡啶相連，與Ⅰ的環(huán)醚信號相差較大。1H-NMR譜中可觀察到C1～C10上各質(zhì)子間的耦合：δ 2.28(1H,m)和δ 4.38(2H,q)為二氫吡啶環(huán)上C5-H與C6-H的信號峰；信號δ 4.24(1H,m)和δ 4.38(1H,q)為C9上非化學(xué)等價的同碳二氫共振峰；信號δ 2.53(1H,m)和δ 2.18(1H,m)為C10上非化學(xué)等價的同碳二氫共振峰；δ 5.36(1H,s)為C7上的氫信號。另外，1H-NMR譜中δ 2.14(3H,m)及13C-NMR(DEPT)譜中信號δ 20.7(CH3)共同提示了一個處于較低磁場的甲基，由其化學(xué)位移及氫譜中各信號峰的耦合關(guān)系，推斷該甲基與C5相連。根據(jù)以上證據(jù)，推斷化合物Ⅱ結(jié)構(gòu)如圖3，并歸屬了Ⅱ的NMR數(shù)據(jù)(表2)。該研究是首次獲得該化合物，暫命名為粗莖龍膽堿B(gentiocrasidine B)。

圖3　化合物Ⅱ結(jié)構(gòu)式Fig.3　Structure of compound Ⅱ

表2　化合物Ⅱ的NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)

圖4　化合物Ⅲ結(jié)構(gòu)式Fig.4　Structure of compound Ⅲ

圖5　化合物Ⅳ結(jié)構(gòu)式Fig.5　Structure of compound Ⅳ

CδCCδC2164.8,CH745.3,CH393.4,C964.8,CH24149.1,C1022.9,CH25115.1,C11185.6,CH6151.28,C1222.0,CH3

13C-NMR(DEPT)(CD3OD，50 MHz)譜給出9個碳信號，由5個低場區(qū)的碳信號δ 157.5(C)、δ 146.0(CH)、δ 147.7(C)、δ 131.8(C)、δ 123.2(CH)，以及1H-NMR(CD3OD，200 MHz)譜中的特征質(zhì)子信號δ 8.25(1H,d,J=5.02 Hz)和δ 7.11(1H,d,J=5.05 Hz)推測分子中含有吡啶環(huán)[13]；并由13C-NMR譜信號δ 28.6(CH2)、δ 57.0 (CH2)、δ 89.4(CH)，結(jié)合生源初步推斷Ⅴ為吡啶單萜類生物堿。1H-NMR譜中信號δ 8.25(1H,d,J=5.02 Hz)和δ 7.11(1H,d,J=5.05 Hz)為吡啶環(huán)上α-H與β-H的共振峰；信號δ4.28(1H,ddd,J=11.9 Hz,3.48 Hz,2.86 Hz)和 δ 3.93(1H,m)為C9上同碳二氫的共振峰；信號δ 3.02(1H,m)和δ 2.66(1H,m)為C10上同碳二氫的共振峰。δ 5.98(1H,s)為C7上的氫信號；13C-NMR(DEPT)譜中C7的信號峰δ 94.4(CH)為縮醛結(jié)構(gòu)，處于較低磁場。C9及C10的化學(xué)位移為δ 56.2(CH2)和δ 27.4(CH2)，δ 20.9(CH3)為與吡啶環(huán)相連的C11信號峰。波譜數(shù)據(jù)與文獻[11]對照，與已知化合物西藏龍膽堿基本一致，鑒定化合物Ⅴ為西藏龍膽堿(gentiatibetine)，其結(jié)構(gòu)見圖6。該研究歸屬了Ⅴ的碳譜數(shù)據(jù)(表4)。

圖6　化合物Ⅴ結(jié)構(gòu)式Fig.6　Structure of compound Ⅴ

2.6化合物Ⅵ白色無定形粉末，50 mg，mp：290～295 ℃，Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)均顯陽性。碳氫譜數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻[12]比較，鑒定化合物Ⅵ為胡蘿卜苷(daucosterol)，其結(jié)構(gòu)見圖7。

表4　化合物Ⅴ的NMR數(shù)據(jù)(CD3OD)

圖7　化合物Ⅵ結(jié)構(gòu)式Fig.7　Structure of compound Ⅵ

2.7化合物Ⅶ無色針晶(丙酮)，30 mg,mp：135～137 ℃，與茴香醛試劑產(chǎn)生亮天藍色斑點，漸變成綠色。TLC與β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品比較，Rf值一致，混合測熔點不下降。鑒定化合物Ⅶ為β-谷甾醇(β-sitosterol),其結(jié)構(gòu)見圖8。

圖8　化合物Ⅶ結(jié)構(gòu)式Fig.8　Structure of compound Ⅶ

2.8化合物Ⅷ白色無定形粉末，25 mg,mp：60～61 ℃，溴甲酚綠反應(yīng)陽性。1H-NMR(CDCl3，400 MHz)譜低場區(qū)無質(zhì)子信號；δ 0.88(3H,t,J=6.4 Hz)顯示唯一的-CH3； δ 2.35(2H,t,J=7.6 Hz)顯示羰基α位次甲基；δ 1.63(2H,m)顯示羰基β位次甲基；在δ 1.25處有一脂肪鏈質(zhì)子信號，提示該化合物為一長鏈脂肪酸。TLC與棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品比較，Rf值一致，混合測熔點不下降。鑒定化合物Ⅷ為棕櫚酸(plamitic acid)。

3　結(jié)論

該研究首次對龍膽科植物粗莖秦艽加氨后生成的生物堿類成分進行了提取、分離，共得到了8個化合物，通過波譜和化學(xué)分析鑒定分別為粗莖龍膽堿A(gentiocrasine A，Ⅰ)、粗莖龍膽堿B(gentiocrasine B，Ⅱ)、秦艽甲素(gentianine，Ⅲ)、秦艽丙素(gentianal，Ⅳ)、西藏龍膽堿(gentiatibetine，Ⅴ)、胡蘿卜苷(daucosterol，Ⅵ)、β-谷甾醇(β-sitosterol，Ⅶ)、棕櫚酸(plamitic acid，Ⅷ)，其中5個是裂環(huán)烯醚萜苷類生物堿，化合物Ⅰ和化合物Ⅱ為首次得到的化合物。秦艽生物堿類化合物均未見碳譜數(shù)據(jù)報導(dǎo)，該研究補充了秦艽丙素、西藏龍膽堿的碳譜數(shù)據(jù)。

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Artificial Alkaloids and Chemical Constituents ofGentianacrassicaulisDuthie ex Burk.

DU Peng

Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang,Guizhou 550004)

[Objective] To study artificial alkaloids and other chemical constituents ofGentianacrassicaulisDuthie ex Burk.. [Method] After the crude total alkaloids were extracted with a solvent containing ammonia,the chemical constituents in the extract were isolated and purified by silica gel column chromatography and identified on the basis of their physiochemical and spectral data. [Result] Eight compounds were isolated and identified,including gentiocrasine A (Ⅰ),gentiocrasine B (Ⅱ),gentianine (Ⅲ),gentianal (Ⅳ),gentiatibetine (Ⅴ),daucosterol (Ⅵ),β-sitosterol (Ⅶ),and plamitic acid (Ⅷ). [Conclusion] Compounds Ⅰ and Ⅱ are new compounds.

GentianacrassicaulisDuthie ex Burk.; Alkaloid; Chemical constituents

2016-08-26

S 567

A

0517-6611(2016)26-0091-04

杜鵬(1979- )，男，寧夏銀川人，主管藥師，碩士，從事天然藥物及藥物臨床試驗研究。