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        兩步培養(yǎng)法測定厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)孢的最佳條件

        2016-11-02 09:57:30劉國坤張紹升
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年26期

        石 妍,肖 順, 劉國坤, 張紹升

        福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,福建福州 350002)

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        兩步培養(yǎng)法測定厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)孢的最佳條件

        石 妍,肖 順, 劉國坤, 張紹升*

        福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,福建福州 350002)

        [目的] 探討厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)厚垣孢子的條件。[方法] 采用兩步培養(yǎng)法測定碳源、氮源、碳氮摩爾比、pH等不同營養(yǎng)環(huán)境條件對厚垣孢普可尼亞菌PC021120-152菌株產(chǎn)厚垣孢子的影響。[結(jié)果]PC021120-152菌株的最佳產(chǎn)厚垣孢子條件為:初始碳源濃度為3.00 g/L,碳氮摩爾比為2.5∶1,最佳碳氮源組合為蔗糖/NaNO3,培養(yǎng)基最佳pH為8.0。PC021120-152菌株的最佳產(chǎn)分生孢子條件為:初始碳源濃度為3.00 g/L,碳氮摩爾比為2.5∶1,最佳碳氮源組合為D-果糖/NaNO3,最佳pH為5.0。[結(jié)論]該研究結(jié)果可為厚垣孢普可尼亞菌生防制劑的生產(chǎn)調(diào)控提供依據(jù)。

        厚垣孢普可尼亞菌;產(chǎn)孢;營養(yǎng)條件

        厚垣孢普可尼亞菌(Pochoniachlamydosporia)是根結(jié)線蟲和胞囊線蟲卵及雌蟲的寄生菌[1],是國內(nèi)外目前研究較多的線蟲寄生真菌之一,在無性世代能產(chǎn)生大量磚格狀的、對高溫、干旱和營養(yǎng)貧瘠等不良環(huán)境具有強(qiáng)耐受力的厚垣孢子,使其易在土壤中存活[1-2]。此外,厚垣孢普可尼亞菌對植物不具有致病性[2],是一種具有開發(fā)應(yīng)用前景的線蟲生防真菌。研究表明,營養(yǎng)環(huán)境條件對真菌產(chǎn)孢的類型有較大的影響,可通過營養(yǎng)環(huán)境條件的改變來控制生產(chǎn)所需的孢子類型,以獲得耐受力(耐干燥、高溫)較強(qiáng)的孢子。筆者采用兩步培養(yǎng)法探討碳源、氮源、碳氮比、pH等不同營養(yǎng)環(huán)境條件對厚垣孢普可尼亞菌PC021120-152菌株產(chǎn)厚垣孢子的影響,以期為其固態(tài)擴(kuò)大培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1供試菌株厚垣孢普可尼亞菌菌株P(guān)C021120-152,由福建農(nóng)林大學(xué)植物線蟲學(xué)實驗室分離、鑒定并保存。

        1.2真菌孢子懸浮液的制備PDA斜面菌種活化后,加入適量無菌水,用接種針刮取菌落表面,用微型旋渦混合儀振蕩使孢子均勻分散,使用血球計數(shù)板計數(shù)后,再用無菌水將孢子懸浮液濃度調(diào)至106個/mL,備用。

        1.3營養(yǎng)環(huán)境條件對厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)孢的影響

        1.3.1碳源?;A(chǔ)培養(yǎng)基(Czapek培養(yǎng)基)[3]:蔗糖30.00 g/L、NaNO32.00 g/L、 K2HPO41.00 g/L、 FeSO4·7H2O 0.01 g/L、KCl 0.50 g/L、MgSO4·7H2O 0.50 g/L、瓊脂18.00 g/L,pH自然。

        用相同碳量的碳源代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蔗糖為碳源。供試碳源為:葡萄糖、乳糖、D-果糖、可溶性淀粉。以無碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照(CK),3次重復(fù)。

        1.3.2氮源。用相同氮量的氮源代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的NaNO3為氮源。供試氮源為:NH4Cl、脲(CH4N2O)、L-酪氨酸(C9H11NO3)、甘氨酸(C2H5NO2)。以無氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照(CK),3次重復(fù)。

        1.3.3碳氮源組合。根據(jù)碳氮源單因素試驗,以可溶性淀粉、蔗糖、D-果糖為碳源,以NaNO3、L-酪氨酸為氮源,配成6種不同碳氮源組合的培養(yǎng)基。3次重復(fù)。

        1.3.4碳氮比(摩爾比)。根據(jù)篩選出的最佳碳氮源,設(shè)定碳源起始濃度為3.00、6.00、12.00、24.00 g/L;氮源起始濃度為0.35、0.70、1.40、2.80 g/L;16種不同碳氮濃度組合所得的碳氮比范圍為:1.25∶1~80.00∶1。3次重復(fù)。

        1.3.5pH。根據(jù)上述試驗結(jié)果配制培養(yǎng)基,滅菌前用1.0 mol/L HCl 和1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH,分別為4、5、6、7、8、9。以不調(diào)整pH的培養(yǎng)基為對照(CK),3次重復(fù)。

        1.4試驗方法

        1.4.1兩步培養(yǎng)法。參考Sun等[4]的方法,稍做改動。①在培養(yǎng)皿中倒入基礎(chǔ)培養(yǎng)基后,在培養(yǎng)基表面放無菌玻璃紙(φ7.5 cm)。將孢子懸浮液(接種量為100 μL)接種到玻璃紙上,用無菌玻璃刮鏟來回充分涂勻。正面靜置20~30 min,用parafilm封口。28 ℃下倒置黑暗培養(yǎng),3次重復(fù)。②4 d后,將玻璃紙移至不同營養(yǎng)環(huán)境條件的新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后,用鑷子輕刮玻璃紙上的菌落,然后將菌落放入裝有100 mL體積分?jǐn)?shù)為0.15%的吐溫-80溶液的三角瓶中,置于微型旋渦混合儀上充分渦旋混合,稀釋成一定倍數(shù)后,取樣,計孢子數(shù),3次重復(fù)。

        1.4.2孢子計數(shù)。分生孢子使用血球計數(shù)板計數(shù);厚垣孢子由于其直徑(20~25 μm)較大,不易用血球計數(shù)板計數(shù),故用以下方法計數(shù):用移液槍吸取20 μL孢子懸浮液于載玻片上,蓋上蓋玻片,置于光學(xué)顯微鏡下逐一計數(shù),3次重復(fù)。1.5數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與繪圖,使用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,方差分析采用Duncan’s新復(fù)極差法。2結(jié)果與分析

        2.1不同碳源對厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)孢的影響從圖1、2可以看出,5種碳源對菌株P(guān)C021120-152產(chǎn)孢有顯著影響。可溶性淀粉最有利于產(chǎn)厚垣孢子,培養(yǎng)結(jié)束時產(chǎn)孢量達(dá)到3.04×106個/菌落,其中α-乳糖的產(chǎn)孢量少于對照。就產(chǎn)分生孢子而言,以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量最大,達(dá)到2.17×109個/菌落。5種碳源產(chǎn)分生孢子量均高于對照。由此可見,供試菌株P(guān)C021120-152產(chǎn)分生孢子和產(chǎn)厚垣孢子所需的最佳碳源不同。

        注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters mean significant differences (P<0.05).圖1 不同碳源對厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)厚垣孢子的影響Fig.1 Effects of carbon sources on chlamydospore production of P.chlamydosporia

        注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters mean significant differences (P<0.05).圖2 不同碳源對厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)分生孢子的影響Fig.2 Effects of carbon sources on conidiophore production of P.chlamydosporia

        2.2不同氮源對厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)孢的影響從圖3可以看出,厚垣孢普可尼亞菌PC021120-152在以NaNO3為氮源的培養(yǎng)基中產(chǎn)厚垣孢子量最大,為3.50×106個/菌落,其次為L-酪氨酸,其他3種氮源的產(chǎn)孢量均低于對照。就產(chǎn)分生孢子而言,也是NaNO3最利于產(chǎn)分生孢子,以脲、NH4Cl、甘氨酸為氮源的處理產(chǎn)分生孢子量低于對照(圖4)。由此可見,以NaNO3為氮源,既有利于產(chǎn)厚垣孢子,又有利于產(chǎn)分生孢子。

        注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters mean significant differences (P<0.05).圖3 不同氮源對厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)厚垣孢子的影響Fig.3 Effects of nitrogen sources on chlamydospore production of P.chlamydosporia

        注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters mean significant differences (P<0.05).圖4 不同氮源對厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)分生孢子的影響Fig.4 Effects of nitrogen sources on conidiophore production of P.chlamydosporia

        2.3最佳碳氮源組合的確定由表1可知,產(chǎn)厚垣孢子量最大的碳氮源組合為蔗糖/ NaNO3,其次為可溶性淀粉/ NaNO3和D-果糖/ NaNO3,與其他碳氮源組合差異顯著;D-果糖/ NaNO3的碳氮源組合分生孢子產(chǎn)量最大,其次為蔗糖/ NaNO3組合。2.4碳源濃度和碳氮摩爾比對厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)孢的影響從表2可以看出,碳源濃度、碳氮摩爾比對菌株P(guān)C021120

        表1 不同碳氮源組合對厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)孢的影響

        注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

        Note: Different lowercase letters in the same column mean significant differences (P<0.05).

        -152產(chǎn)厚垣孢子量有顯著的影響。當(dāng)碳源起始濃度為3.00 g/L時,碳氮摩爾比為2.5∶1的處理的產(chǎn)孢量是所有處理中最大的,達(dá)24.00×105個/菌落。當(dāng)碳源濃度較低時(3.00和6.00 g/L),碳氮摩爾比小的處理(碳氮摩爾比為2.5∶1)厚垣孢子產(chǎn)量較大。當(dāng)碳源濃度較高時(12.00和24.00 g/L),碳氮摩爾比大的處理(碳氮摩爾比為20∶1)厚垣孢子產(chǎn)量較大。當(dāng)碳源濃度為24.00 g/L時,所有處理的產(chǎn)孢量開始減少。

        碳源濃度和碳氮摩爾比對菌株VC021120-152產(chǎn)分生孢子也有顯著的影響。當(dāng)碳源濃度為3.00 g/L,碳氮摩爾比為2.5∶1的處理產(chǎn)孢量也最大,達(dá)到31.80×108個/菌落,與其他處理差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

        表2碳源濃度和碳氮比對厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)分生孢子的影響

        Table 2Effects of carbon concentration and carbon-nitrogen molar ratio on sporulation ofP.chlamydosporia

        碳源濃度Carbonconc-entrationg/L碳氮摩爾比Carbon-nitrogenmolarratio厚垣孢子產(chǎn)量Chlamydosporeproduction×105個/菌落分生孢子產(chǎn)量Conidiophoreproduction×108個/菌落3.010∶17.33±0.16bh7.35±0.90def3.05∶19.08±0.04f6.43±0.26efg3.02.5∶124.00±0.21a31.80±2.71a3.01.25∶110.80±0.29d9.07±0.18c6.020∶11.30±0.08j13.70±0.08b6.010∶114.30±0.22c8.73±0.06cd6.05∶10.92±0.01ki5.63±0.71fg6.02.5∶115.50±0.15c6.66±0.29fg12.040∶111.00±0.21d4.35±1.36g12.020∶116.30±0.23b7.36±0.70def12.010∶110.00±0.16e4.67±0.58g12.05∶18.73±0.07g6.54±0.26efg24.080∶10.67±0.02i4.97±0.12g24.040∶10.34±0.02m9.73±1.79c24.020∶17.00±0.02h15.30±0.77b24.010∶11.08±0.03jk7.72±1.41cde

        注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

        Note:Different lowercase letters in the same column mean significant differences (P<0.05).

        2.5pH對厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)孢的影響從圖5可以看出,弱堿性條件有利于厚垣孢子的產(chǎn)生。當(dāng)pH為8.0時,厚垣孢子產(chǎn)量最大,與其他處理差異顯著。就產(chǎn)分生孢子而言,當(dāng)pH為5.0時產(chǎn)孢量較大(圖6),與Gao等[5]報道的結(jié)果相似。

        注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters mean significant differences (P<0.05).圖5 不同pH對厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)厚垣孢子的影響Fig.5 Effects of different pH on chlamydospore production of P.chlamydosporia

        注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters mean significant differences (P<0.05).圖6 不同pH對厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)分生孢子的影響Fig.6 Effects of different pH on conidiophore production of P.chlamydosporia

        3 結(jié)論與討論

        真菌生長和產(chǎn)孢所需的營養(yǎng)條件不同,適合其營養(yǎng)生長的條件并不一定適合其產(chǎn)孢。兩步培養(yǎng)法是指使待測真菌在適宜該真菌生長的培養(yǎng)基中進(jìn)行營養(yǎng)生長至產(chǎn)孢前,然后將獲得的產(chǎn)孢前的營養(yǎng)菌絲體轉(zhuǎn)移至不同營養(yǎng)成分或不同環(huán)境條件的新鮮培養(yǎng)基中,進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)[4]。筆者采用兩步培養(yǎng)法確定了厚垣孢普可尼亞菌PC021120-152菌株的最佳產(chǎn)厚垣孢子條件:初始碳源濃度為3.00 g/L,碳氮摩爾比為2.5∶1,最佳碳氮源組合為蔗糖/NaNO3,最佳pH為8.0。PC021120-152菌株的最佳產(chǎn)分生孢子條件為:初始碳源濃度為3.00 g/L,碳氮摩爾比為2.5∶1,最佳碳氮源組合為D-果糖/ NaNO3,最佳pH為5.0。由此可見,厚垣孢普可尼亞菌PC021120-152菌株的最佳產(chǎn)分生孢子和厚垣孢子的營養(yǎng)條件不同,在該生防菌劑的發(fā)酵調(diào)控中根據(jù)需要選擇最適合的產(chǎn)孢條件。

        培養(yǎng)基的組成和配比合適與否對微生物的生長、繁殖、代謝和產(chǎn)物形成都會產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。影響真菌產(chǎn)孢的因素主要有培養(yǎng)基的營養(yǎng)、pH、濕度、無機(jī)鹽。培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不能太豐富,碳源、氮源不宜過多,尤其是有機(jī)氮源含量要少一些,否則不易形成孢子,而無機(jī)鹽的用量會影響孢子的顏色和數(shù)量[6]。關(guān)于營養(yǎng)、pH、溫度、光照、水活度等條件對厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)分生孢子的影響已有報道[5,7-10],但這些條件對其產(chǎn)厚垣孢子的影響卻鮮有報道。厚垣孢子的產(chǎn)生是菌株應(yīng)對營養(yǎng)缺失或者其他環(huán)境壓力(如高溫、高壓、干燥等)的一種方式[11],使其易在土壤中存活。孢子是真菌殺蟲劑的主要成分,能否在人工培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量孢子是評價菌株作為是否有潛力的重要標(biāo)準(zhǔn)。液固雙相發(fā)酵在微生物大批量培養(yǎng)中應(yīng)用廣泛,它是指經(jīng)液體深層發(fā)酵培養(yǎng)出菌絲或孢子后接入固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生孢子的方法,此過程與兩步培養(yǎng)法相似。Sun等[4]研究表明采用兩步培養(yǎng)法獲得的最佳碳氮源產(chǎn)孢量比連續(xù)培養(yǎng)法相應(yīng)的碳氮源產(chǎn)孢量多。在連續(xù)培養(yǎng)中,菌絲營養(yǎng)生長會改變培養(yǎng)基的成分,降低其營養(yǎng),無法確定真菌產(chǎn)孢階段的起始濃度。采用兩步培養(yǎng)法確定的真菌產(chǎn)孢營養(yǎng)環(huán)境條件對于指導(dǎo)真菌生防菌劑的生產(chǎn)、提高固態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)孢量具有一定的意義。

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        Optimum Conditions for Sporulation ofPochoniachlamydosporiain Two-stage Cultivation

        SHI Yan,XIAO Shun,LIU Guo-kun,ZHANG Shao-sheng*

        (College of Plant Protection,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002)

        [Objective] To discuss the nutritional conditions for sporulation ofPochoniachlamydosporia. [Method] A two-stage cultivation method was used to determine the effects of various nutritional and environmental conditions (carbon sources,nitrogen sources,carbon-nitrogen molar ratio,and pH) on the sporulation ofP.chlamydosporiaPC021120-152.[Result] Chlamydospore production of PC021120-152 strains was the highest when the initial carbon concentration was 3.00 g/L; the carbon-nitrogen molar ratio was 2.5∶1; sucrose/NaNO3was as the carbon/nitrogen source,and the pH was 8.Conidiophore production of PC021120-152 strains was the highest when the initial carbon concentration was 3.00 g/L; the carbon-nitrogen molar ratio was 2.5∶1; D-fructose/NaNO3was as the carbon/nitrogen source,and the pH was 5.0.[Conclusion] The research provides

        for industrialization of biocontrol agents ofP.chlamydosporia.

        Pochoniachlamydosporia; Sporulation; Nutritional conditions

        中國煙草總公司福建公司科技項目(閩煙2012[041]號)。

        石妍 (1986- ),女,福建三明人,助理實驗師,碩士,從事微生物發(fā)酵方面的研究。*通訊作者,教授,博士生導(dǎo)師,從事植物病理學(xué)方面的研究。

        2016-07-11

        S 432.4+4

        A

        0517-6611(2016)26-0016-04

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