管清香, 張廣遠, 孫丹丹, 孫士淋, 孫　誠, 劉　昕, 韓　冰

(吉林大學藥學院, 長春 130021)

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白芨多糖兩親性聚合物的合成及載藥納米體系

管清香, 張廣遠, 孫丹丹, 孫士淋, 孫誠, 劉昕, 韓冰

(吉林大學藥學院, 長春 130021)

制備了硬脂酸改性白芨多糖兩親性聚合物(SA-BSPS)藥物載體, 采用紅外光譜及核磁共振氫譜對SA-BSPS藥物載體進行了表征, 并以核磁共振氫譜峰面積計算取代度. 以多西他賽(DTX)為模型藥物, 制備了多西他賽-硬脂酸改性白芨多糖聚合物(DTX-SA-BSPS)膠束, 測定了DTX-SA-BSPS的粒徑分布、Zeta電位、 載藥量及包封率. 結果表明, 硬脂酸已接枝到白芨多糖的羥基上, 取代度為12.94%. DTX-SA-BSPS膠束的粒徑為(97.01±3.17) nm,Zeta電位為(-19.56±0.22) mV, 載藥量為(9.13±0.17)%、 包封率達(81.11±0.18)%. 探討了SA-BSPS膠束的細胞毒性及其被人肝癌細胞(HepG2)株攝入的情況. 細胞毒性實驗表明, 濃度為0.5 μg/mL的SA-BSPS膠束孵育72 h時, 肝癌細胞存活率為(78.82±3.25)%. 熒光攝入實驗表明, 孵育4 h后細胞中包載羅丹明B的SA-BSPS膠束的熒光強度明顯強于游離羅丹明B, 且在孵育過程中, 熒光強度隨孵育時間的延長而增強.

白芨多糖; 兩親性聚合物; 聚合物膠束; 載藥量; 包封率

兩親性接枝或嵌段聚合物在水溶液中能自組裝形成聚合物膠束, 廣泛用于藥物載體研究[1～4]. 多糖類高分子如殼聚糖、 普魯蘭多糖和海藻酸鈉等因具有生物相容性好、 安全性高及生物可降解性等特點而廣泛應用于藥物遞送系統(tǒng)[5～7]. Jung等[8]制備了乙?；蒸斕m(PA)納米粒, 發(fā)現(xiàn)普魯蘭乙?；潭仍礁? 疏水性越強, 載藥量增加, 且呈緩慢釋藥的趨勢. Tang等[9]用聚對二氧環(huán)己酮修飾殼聚糖, 通過共價結合形成兩親性嵌段共聚物, 在水溶液中自組裝成膠束, 氨基的質子化使其具有pH依賴性. 白芨多糖是從白芨[(Thunb.)Reichb.f.]藥材中用一定工藝提取的由葡萄糖和甘露糖(1∶4, 摩爾比)以β-糖苷鍵聚合而成的一種葡甘聚糖, 具有抗炎及抗腫瘤等生物學活性, 無刺激、 無毒副作用且廉價易得, 其應用越來越受到重視[10]. 研究表明, 白芨多糖作為藥物傳送載體具有自身的缺陷, 主要體現(xiàn)在兩方面: (1) 白芨多糖的分子結構主要由多羥基的葡萄糖和甘露糖構成, 親水性較強, 在水中溶蝕較快, 機械強度較低, 故不宜直接作為緩釋或控釋骨架材料使用; (2) 白芨多糖缺少疏水域, 對難溶性藥物的載藥量低且包封率差. 許多研究者嘗試對其進行疏水性修飾. Chen等[11]對白芨多糖進行硫酸酯化修飾, 結果表明, 在一定濃度條件下硫酸酯化的白芨多糖有促進B淋巴細胞增殖的作用, 對體外白血病細胞株U937的生長具有抑制作用; Bi等[12]制備了一種膽甾醇琥珀?；揎棸总付嗵? 增強了白芨多糖的疏水性, 并制備了一種兩親性的嵌段共聚物, 擴大了其應用范圍.

本文采用內(nèi)源性生理物質硬脂酸對白芨多糖進行疏水性修飾, 制備了一種兩親性的硬脂酸改性白芨多糖聚合物(SA-BSPS)藥物載體, 考察了SA-BSPS藥物載體自組裝形成聚合物膠束的形態(tài)和大小, 并以多西他賽(DTX)為模型藥物, 探討SA-BSPS的載藥量和包封率, 評價了人肝癌細胞(HepG2)對SA-BSPS膠束的攝取情況及載體的細胞毒性.

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

多西他賽(DTX), 上海波以爾化工有限公司, 純度99.6%; 多帕菲(規(guī)格1 mL∶40 mg), 齊魯制藥有限公司; 白芨多糖(BSPS), Pioneer Biotech有限公司, 純度98.5%; 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC, 純度99%)和4-二甲氨基吡啶(DMAP, 純度98.5%), Energy化學品有限公司; 硬脂酸(SA, 純度99%)和二甲基亞砜(DMSO, 純度96%), 國藥集團化學試劑有限公司; 噻唑藍(MTT), Sigma Aldrich公司, 純度98%. AVANCE400型核磁共振波譜(1H NMR)儀, 瑞士Bruker公司; LC-20AT型高效液相色譜(HPLC)儀, 日本Shimadzu公司; 8300型傅里葉變換紅外光譜(FTIR)儀, 日本Shimadzu公司; IX71型熒光倒置顯微鏡, 日本Olympus公司.

1.2實驗過程

1.2.1SA-BSPS藥物載體的合成反應過程如Scheme 1所示.n(SA)∶n(DMAP)∶n(EDC)=1∶1∶1.2, 將127.6 mg SA, 53.4 mg DMAP和96.7 mg EDC溶解于3 mL DMSO中, 室溫磁力攪拌活化1 h, 得到活化反應液; 將400 mg BSPS溶于4 mL DMSO中, 逐滴加入到活化反應液中, 于38 ℃反應48 h; 反應結束后向反應液中加入10倍體積的冰無水乙醇, 靜置過夜, 過濾, 將沉淀物用無水乙醇與乙醚各100 mL交替洗滌3次, 于50 ℃干燥, 得到SA-BSPS藥物載體203.6 mg. 利用溴化鉀壓片法測定[13]BSPS及SA-BSPS藥物載體的紅外光譜; 以DMSO-d6為溶劑, TMS為內(nèi)標, 分別測定BSPS及SA-BSPS藥物載體的1H NMR[14], 通過1H NMR峰面積計算取代度.

Scheme 1　Synthetic route of BSPS(SA-BSPS)

1.2.2SA-BSPS膠束及DTX-SA-BSPS膠束的制備將25.0 mg SA-BSPS藥物載體加入4 mL DMSO中, 超聲使SA-BSPS藥物載體全部溶解, 轉移至透析袋(截留分子量8000～12000)中, 于500 mL蒸餾水中透析, 磁力攪拌速率為100 r/min; 透析過程中, 前8 h中每2 h更換一次蒸餾水, 后24 h中每8 h更換一次蒸餾水, 用0.45 μm微孔濾膜過濾, 濾液用蒸餾水定容至50 mL, 即得SA-BSPS膠束.

將DTX用乙醇超聲溶解, 在攪拌(100 r/min)下將DTX/乙醇溶液逐滴加入到SA-BSPS膠束溶液中, 滴加完成后繼續(xù)攪拌10 min, 于40 ℃旋轉蒸發(fā)除去乙醇, 待SA-BSPS膠束溶液冷卻至室溫后, 加蒸餾水定容至50 mL, 即得DTX-SA-BSPS膠束.

1.2.3載藥量及包封率測定取DTX-SA-BSPS膠束1 mL, 于4 ℃超速離心(12000 r/min)離心10 min, 取上層清液, 測定HPLC, 通過標準曲線方程計算藥物含量, 記為mfree; 取1 mL DTX-SA-BSPS膠束, 加入2 mL無水乙醇, 渦旋振蕩2 min, 超聲5 min, 使藥物充分溶解在無水乙醇中, 于4 ℃超速離心(12000 r/min) 10 min, 取上層清液, 測定HPLC, 通過標準曲線方程計算藥物含量, 記為mtotal, SA-BSPS的質量記為mcarrier, 通過下式計算DTX-SA-BSPS膠束中DTX的載藥量(LC)及包封率(EE):

1.2.4細胞毒性及細胞攝入考察用噻唑藍(MTT)方法評價SA-BSPS膠束的細胞毒性[11]. 以HepG2細胞作為癌細胞組, 將指數(shù)生長期的HepG2細胞用胰酶消化, 調(diào)節(jié)細胞濃度為5×104Cell/mL, 以100 μL/孔接種于96孔板中, 于5%(體積分數(shù))CO2及37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后除去培養(yǎng)液, 將不同濃度(0.0005, 0.005, 0.05, 0.5 μg/mL)的SA-BSPS膠束、 多西他賽參比制劑(多帕菲?)及DTX-SA-BSPS膠束懸浮液置于培養(yǎng)基中, 于5% CO2及37 ℃條件下培養(yǎng)72 h, 每孔加入20 μL MTT溶液, 在相同條件下培養(yǎng)4 h, 除去培養(yǎng)液, 加入DMSO溶液(150 μL/每孔溶解甲瓚, 振蕩10 min, 待藍紫色結晶充分溶解后, 用酶標儀測定492 nm處的OD值, 以不加藥物組為正常對照組, 空白培養(yǎng)基為空白組, 每個樣品平行測定3次. 細胞存活率計算公式:

取適量熒光染料羅丹明B與0.5 mg/mL SA-BSPS膠束混合, 室溫攪拌5 h; 將混合液加入透析袋(截留分子量約500), 置于500 mL蒸餾水中透析8 h, 磁力攪拌速率為100 r/min, 每2 h更換一次蒸餾水. 羅丹明B和透析后得到的包載羅丹明B的SA-BSPS膠束溶液均用基礎培養(yǎng)基定容至5 μg/mL(羅丹明B初始濃度), 將密度為2×104Cell/mL的胰酶消化HepG2肝癌細胞, 以1 mL/孔接種于24孔板中, 在5%(體積分數(shù))CO2及37 ℃條件下培養(yǎng)過夜, 分別于0, 2和4 h在對應孔中加入1.0 mL 5 μg/mL羅丹明B和包載羅丹明B的SA-BSPS膠束進行孵育, 孵育結束后, 用1.0 mol/L冷磷酸鹽緩沖(PBS)沖洗3次, 每次1.0 mL, 再加入1.0 mL PBS和2 μL 1 mg/mL Hoechest33342染料染核, 靜置15 min, 用倒置熒光顯微鏡觀察拍照.

2　結果與討論

2.1SA-BSPS藥物載體的表征

Fig.1　FTIR spectra of BSPS(a) and SA-BSPS(b)

圖2給出了BSPS和SA-BSPS藥物載體的1H NMR圖. 從圖2可知,δ5.4和4.55的特征峰分別代表H1和H2, 這2個特征峰分別為BSPS 1, 6位連接氫與1, 4位連接氫的吸收峰; 在δ1.24附近出現(xiàn)了很明顯的強峰, 為硬脂酸的亞甲基(—CH2) H3特征峰,δ0.85處為硬脂酸的甲基(—CH3) H4特征峰.1H NMR進一步證明了硬脂酸疏水鏈連接到BSPS骨架上, 同時通過1H NMR上CH2和CH3特征峰的積分面積計算出SA-BSPS藥物載體的取代度為12.94%.

Fig.2　1H NMR spectra of BSPS(a) and SA-BSPS(b) in DMSO-d6

2.2DTX-SA-BSPS膠束性質

測定DTX含量的色譜條件: 色譜柱為迪馬C18色譜(5 μm,φ4.6 mm×250 mm); 流動相為V(乙腈)∶V(水)=60∶40; 檢測波長為230 nm; 柱溫為30 ℃; 進樣量為20 μL; 流速為1.0 mL/min. 準確移取DTX儲備液適量, 用無水乙醇稀釋配制成濃度分別為10.12, 21.21, 50.31, 80.24, 70.06及100.53 μg/mL的DTX標準溶液, 按照上述色譜條件進樣測定, 以峰面積(Y)對濃度(X)進行線性回歸, 線性回歸方程為Y=11952X+9498.7(R2=0.9998). 結果表明, DTX在10.12～100.53 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好. 日內(nèi)精密度(RSD)為1.25%, 日間RSD為1.28%. 圖3給出了SA-BSPS膠束加入量對載藥量的影響. 由圖3可知, 隨著m(DTX)∶m(SA-BSPS)從1∶20增加到1∶9, DTX-SA-BSPS膠束的包封率與載藥量呈增加趨勢, 當m(DTX)∶m(SA-BSPS)為1∶9時, 包封率與載藥量達到最高, 此時載藥量為(9.13±0.17)%, 包封率為(81.11±0.18)%. 繼續(xù)增加DTX用量, 載藥量與包封率均呈下降趨勢, 但包封率下降明顯, 其原因可能為疏水核心載藥能力有限, 在m(DTX)∶m(SA-BSPS)為1∶9 時達到最高, 繼續(xù)增加的DTX無法進入SA-BSPS膠束疏水核心, 反而會引起粒子的直接碰撞導致DTX粒子析出. 當m(DTX)∶m(SA-BSPS)為1∶5時, 可明顯地觀察到有藥物粒子懸浮在SA-BSPS膠束溶液中. 通過動態(tài)光散射儀(DLS)測定SA-BSPS膠束粒徑分布與Zeta電位, 結果見圖4. 由圖4可見,m(DTX)∶m(SA-BSPS)從1∶20到1∶5時, DTX粒子的粒徑均小于100 nm. DTX-SA-BSPS膠束Zeta電位維持在-20 mV左右, 未隨藥物與SA-BSPS比值發(fā)生明顯變化, 說明DTX的加入不會改變DTX-SA-BSPS膠束的Zeta電位, 從而保持DTX-SA-BSPS膠束水溶液維持在穩(wěn)定狀態(tài).

Fig.3　　　　EE and LC of DTX loaded SA-BSPS copolymer micelles

Fig.4　　　　Particle size and zeta potential of DTX loaded SA-BSPS copolymer micelles

2.3細胞毒性及SA-BSPS膠束細胞攝入的熒光分析

Fig.5　Cytotoxicity of the blank SA-BSPS copolymermicelles, Duopafei, DTX-loaded SA-BSPS copolymer micelles in HepG2 cell for 72 h

載藥體系的生物安全性和細胞跨膜特性尤為重要, DTX-SA-BSPS膠束進入機體內(nèi)后, 主要被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的巨噬細胞吞噬, 故富集于網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞豐富的肝脾等器官處. 因此, 本文采用HepG2為模型細胞, 測定SA-BSPS膠束、 參比制劑(多帕菲?)及DTX-SA-BSPS膠束的細胞毒性, 結果如圖5所示. SA-BSPS膠束濃度在0.0005 μg/mL條件下對HepG2作用較低, 72 h時HepG2存活率為(97.1±1.32)%. 隨著SA-BSPS膠束濃度的增加, HepG2的存活率呈降低趨勢, 當SA-BSPS膠束濃度為0.5 μg/mL時, 72 h時HepG2存活率最低為(78.82±3.25)%, 這可能是因為SA-BSPS膠束對HepG2具有抑制作用[14]或由于72 h時營養(yǎng)物質耗竭所致. 在相同濃度條件下, 72 h時DTX-SA-BSPS膠束對HepG2的抑制作用明顯, 其原因可能是SA-BSPS膠束粒徑較小(<100 nm)能夠進入HepG2內(nèi)部, 避免了DTX被P-糖蛋白排出細胞外[15], 能夠較長時間存在于HepG2內(nèi)部, 緩慢釋放抗癌藥物從而對HepG2具有抑制作用. 以此模型包載抗癌藥物, 在提高抗癌藥物靶向性的同時, 也能降低抗癌藥物對正常細胞的毒副作用.

藥物能否被載體材料攜帶進入細胞, 是衡量該材料是否是一個良好的藥物載體的重要指標之一. 通常, 藥物以內(nèi)吞方式被細胞攝入, 因此藥效與細胞內(nèi)吞攝入量密切相關. 為了驗證本文中的SA-BSPS膠束可高效通透細胞膜的假設, 采用熒光倒置顯微鏡初步檢測了包載羅丹明B的SA-BSPS膠束和羅丹明B被HepG2細胞株攝入的情況, 結果見圖6. 紅色熒光表示藥物攝取進入細胞的分布及強度, 熒光強度越大攝取量越多. 從熒光強度上比較, 孵育2 h時二者在細胞質的熒光強度相近, 說明攝入程度相當, 但孵育4 h后包載羅丹明B的SA-BSPS膠束的熒光強度強于游離羅丹明B, 且在整個過程中, 熒光強度隨孵育時間的延長而增強[16]. 包載羅丹明B的SA-BSPS膠束攝取的熒光強度大于游離羅丹明B, 可能是SA-BSPS膠束具有較好的生物相容性, 增強了羅丹明B與細胞的融合, 促進細胞的攝取.

Fig.6　　　　Fluorescent images of HepG2 cells incubated with Rhodamine B(A, B) and Rhodamine B-labeled SA-BSPS copolymer micelles(C, D) for 2 h(A, C) and 4 h(B, D)

3　結　　論

將硬脂酸接枝到白芨多糖的羥基上， 合成了SA-BSPS藥物載體， 取代度為12.94%. 采用透析法制備了SA-BSPS膠束， 載藥量為(9.13±0.17)%、 包封率達(81.11±0.18)%. SA-BSPS膠束毒性低， 濃度為0.5 μg/mL的SA-BSPS膠束孵育72 h時， 肝癌細胞存活率為(78.82±3.25)%. 細胞對SA-BSPS膠束的攝取率較高. 結果表明， 制備的SA-BSPS有望在疏水性藥物及肝癌等相關疾病治療方面成為一種新的有潛在應用價值的藥物載體.

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(Ed.: W, Z)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81401513) and the Graduate Innovation Fundation of Jilin University, China(No.2016225).

Investigation on Synthesis of Bletilla Striata Polysaccharides Amphiphilic Polymer and Drug-loaded Delivery System?

GUAN Qingxiang, ZHANG Guangyuan, SUN Dandan, SUN Shilin,SUN Cheng, LIU Xin*, HAN Bing*

(SchoolofPharmacy,JilinUniversity,Changchun130021,China)

Stearic acid(SA)-modifiedBletillaStriatapolysaccharides(BSPS) amphiphilic copolymers(SA-BSPS) were prepared. Fourier transform infrared spectroscopy and1H nuclear magnetic resonance spectroscopy(1H NMR) were used to describe SA-BSPS group. The substitued degree of the SA-BSPS group was determined by the peak area oflH NMR. Docetaxel-loaded SA-conjugated BSPS(DTX-SA-BSPS) copolymer micelles were formulated and characterized in terms of particle diameter,Zetapotential, drug loading capacity(LC) and encapsulation efficiency(EE). Further, the uptake of rhodamine B-labeled SA-BSPS copolymer micelles and antitumor activityinvitroon human liver cancer cell line (HepG2) were carried out. The results indicated that SA was successfully conjugated with BSPS and the substitued degree of the SA-BSPS group was 12.94%. DTX-SA-BSPS copolymer micelles had an average size of (97.01±3.17) nm withZetapotential in the range of (-19.56±0.22) mV. The drug encapsulation and loading capacity were (81.11±0.18)% and (9.13±0.17)% respectively. The average cell line viability of blank SA-BSPS polymer micelles were (78.82±3.25)% at 0.5 μg/mL after 72 h incubation. Fluorescent intensity of HepG2 cells incubated for 4 h with rhodamine B-labeled SA-BSPS copolymer micelles was higher than that of rhodamine B and fluorescent intensity exhibited an increase trend when incubation time were prolonged.

BletillaStriatapolysaccharide; Amphiphilic copolymer; Polymer micelle; Drug loading capacity; Encapsulation efficiency

10.7503/cjcu20160342

2016-05-16. 網(wǎng)絡出版日期: 2016-08-31.

國家自然科學基金(批準號: 81401513)和吉林大學研究生創(chuàng)新基金(批準號: 2016225)資助.

O636

A

聯(lián)系人簡介: 韓冰, 男, 博士, 副教授, 主要從事藥物制劑研究. E-mail: hanb@jlu.edu.cn

劉昕, 女, 副教授, 主要從事聚合物材料及藥物分析研究. E-mail: liux@jlu.edu.cn