劉春波 申欽鵬 張鳳梅 張安豐 何沛 司曉喜 劉志華 楊光宇繆明明

（云南省煙草化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明 650231）

在線液相-氣相二維色譜測(cè)定卷煙主流煙氣中的苯并［a］芘

劉春波 申欽鵬 張鳳梅 張安豐 何沛 司曉喜 劉志華 楊光宇*繆明明

（云南省煙草化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明 650231）

建立了在線液相-氣相二維色譜測(cè)定卷煙主流煙氣中的苯并［a］芘方法。采用劍橋?yàn)V片捕集煙氣粒相物，環(huán)己烷萃取，以D12-苯并［a］芘為內(nèi)標(biāo)，然后用在線液相-氣相二維色譜測(cè)定:樣品直接進(jìn)樣進(jìn)入液相色譜，經(jīng)微型硅膠柱分離，含苯并［a］芘的部位切割進(jìn)入氣相色譜，排干溶劑后啟動(dòng)氣相色譜升溫，經(jīng)毛細(xì)管柱進(jìn)行分離，用質(zhì)譜檢測(cè)。本方法將煙氣苯并［a］芘測(cè)定中的硅膠柱層析和氣相色譜-質(zhì)譜分析在線連接起來(lái)，可不經(jīng)樣品前處理凈化直接進(jìn)樣分析；而且每次進(jìn)樣可達(dá)40 μL，與常規(guī)氣相色譜-質(zhì)譜分析最大進(jìn)樣2.0 μL相比，分析靈敏度提高了20倍。方法線性范圍達(dá)0.08～50 ng/L，相關(guān)系數(shù)為r2=0.999，回收率為94.2% ～105.5%；檢出限和定量限分別為0.09和0.30 ng/支，應(yīng)用本方法對(duì)14個(gè)不同類型市售卷煙和2R4F標(biāo)準(zhǔn)煙進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果與GB/T21130-2007測(cè)定結(jié)果相符合。

在線液相-氣相二維色譜；苯并［a］芘；卷煙；主流煙氣

1 引言

苯并［a］芘是卷煙主流煙氣中的重要有害成分，也是煙草安全評(píng)價(jià)的重要檢測(cè)指標(biāo)，國(guó)內(nèi)外對(duì)卷煙主流煙氣中苯并［a］芘的測(cè)定進(jìn)行過(guò)深入研究，目前已得到實(shí)際應(yīng)用的是GC-MS法［1～4］和HPLC-FLD法［5～9］。由于卷煙主流煙氣成分復(fù)雜，苯并［a］芘的含量又屬于痕量，樣品基質(zhì)中又存在大量的干擾物質(zhì)，因此卷煙煙氣中苯并［a］芘的測(cè)定都需要通過(guò)復(fù)雜的樣品處理，前處理方法主要有溶劑提取、固相萃取或凝膠色譜（GPC）凈化［10，11］等方法。這些方法樣品前處理需多次的濃縮、轉(zhuǎn)移，操作非常麻煩，可引入實(shí)驗(yàn)誤差的因素多；而且耗費(fèi)大量有機(jī)溶劑，對(duì)環(huán)境污染大。

在線液相-氣相二維色譜是近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新分析技術(shù)［12～15］，樣品先經(jīng)液相色譜分離凈化后，含待測(cè)組分的流出餾分在線切割進(jìn)入氣相色譜進(jìn)行分析。液相色譜和氣相色譜的在線聯(lián)用能充分發(fā)揮兩級(jí)色譜的互補(bǔ)性，液相色譜的高柱效大大提高了樣品的凈化效果，能實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基體中痕量待測(cè)成分與干擾物質(zhì)的分離，而且二維色譜間在線切換還可減少樣品前處理過(guò)程中的濃縮和轉(zhuǎn)移，減少了人為分析誤差，使分析結(jié)果的準(zhǔn)確性、精密度大大提高。該技術(shù)在復(fù)雜基體中的痕量有機(jī)化合物分析領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。卷煙主流煙氣中苯并［a］芘的測(cè)定采用硅膠固相萃取凈化，氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定（Coresta推薦方法和中國(guó)國(guó)標(biāo)方法），樣品前處理過(guò)程需大量使用有機(jī)溶劑，多次轉(zhuǎn)移和濃縮，操作非常麻煩。本研究對(duì)島津公司的在線凝膠氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行了改進(jìn)，將儀器上的微型凝膠柱換成微型硅膠柱，樣品經(jīng)過(guò)硅膠柱凈化后，再進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，建立一種在線液相-氣相二維色譜測(cè)定卷煙主流煙氣中苯并［a］芘方法，方法簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果令人滿意，為卷煙主流煙氣中苯并［a］芘的測(cè)定提供了新方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

在線GPC（LC-20AD）-GC/MS（QP 2010 Plus）聯(lián)用儀（日本島津公司）；SM450型20孔道直線型吸煙機(jī)（英國(guó)Cerulean公司）；KQ-500DB超聲波清洗器（上海越眾儀器設(shè)備有限公司）。

苯并［a］芘標(biāo)準(zhǔn)品、D12-苯并［a］芘（純度＞98%，美國(guó)Aldrich公司）；環(huán)己烷（色譜純，美國(guó)DIKMA Pure公司）。

肯塔基參比卷煙樣品1種（2R4F，美國(guó)肯塔基大學(xué)）。市售卷煙樣品14種（混合型與烤煙型分別為6和8種），盒標(biāo)煙氣焦油量在3～12 mg/支。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 苯并［a］芘標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取10.0 mg苯并［a］芘，用環(huán)己烷溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，得到0.1 mg/mL苯并［a］芘儲(chǔ)備液；使用時(shí)用環(huán)己烷稀釋成所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。D12-苯并［a］芘內(nèi)標(biāo)溶液:準(zhǔn)確稱取D12-苯并［a］芘10.0 mg，用環(huán)己烷溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，得0.1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.2.2 卷煙主流煙氣的捕集 卷煙樣品在（22±1）℃、相對(duì)濕度60%±2%條件下平衡48 h，挑選平均重量±0.02 g和平均吸阻±49 Pa范圍內(nèi)的煙支作為測(cè)試樣品。參照GB/T5606.1-2004［16］、GB/T19609-2004［17］的規(guī)定，采用SM450型20孔道直線型吸煙機(jī)用44 mm劍橋?yàn)V片捕集4支煙的主流煙氣總粒相物。

2.2.3 樣品處理和分析 將濾片放入50 mL錐形瓶中，加入D12-苯并［a］芘內(nèi)標(biāo)溶液200 μL，加入環(huán)己烷10 mL，超聲萃取40 min，靜置待用。萃取液經(jīng)0.25μm濾頭過(guò)濾后，按設(shè)定的儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

GC/MS條件:GC帶柱頭大體積進(jìn)樣附件（圖1），保留間隙柱為5 m×0.53 mm（J&W）的空柱，預(yù)保留柱規(guī)格為5 m×0.25 mm×0.25μm，DB-5 ms（J&W）；主分析柱為HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m ×0.25 mm ×0.25μm）；色譜柱升溫程序:初始溫度150℃，以10℃/min速率升至260℃，再以2℃/ min速率升至280℃，保持20 min；進(jìn)樣口溫度280℃，載氣為氦氣，恒流流速l.2 mL/min。

質(zhì)譜條件:選擇離子檢測(cè)（SIM），苯并［a］芘與D12-苯并［a］芘的保留時(shí)間分別為19.65和19.57 min，定量離子對(duì)分別為m/z 252和264，每個(gè)離子停留100 ms。

液相色譜帶紫外檢測(cè)器（λ=383 nm）:UHP AQ Si色譜柱（150 mm×2 mm，3.5μm，微孔球形硅膠）；柱溫30℃恒溫；流動(dòng)相為環(huán)己烷-丙酮（20∶1，V/V），流速0.1 mL/min；雙泵系統(tǒng)，泵A用于控制色譜柱流量，泵B用于控制HPLC與GC之間的切換。液相色譜進(jìn)樣量為50 μL，收集時(shí)間為6.8～8.6 min，并通過(guò)泵B和切換閥全部在線切換到GC的進(jìn)樣口。

3 結(jié)果與討論

3.1 在線液相-氣相二維色譜裝置

在線液相-氣相二維色譜裝置結(jié)構(gòu)示意圖（見圖1），樣品通過(guò)進(jìn)樣器進(jìn)入高效液相色譜儀，由泵A輸送流動(dòng)相經(jīng)微型硅膠柱分離，所需要的餾分（含苯并［a］芘部位）通過(guò)數(shù)控六通閥轉(zhuǎn)入捕集盤管，泵A流動(dòng)相廢液從六通閥6排出，泵B輸送流動(dòng)相把捕集盤管中所需要的餾分輸送到氣相色譜預(yù)柱中，在氣相色譜預(yù)柱和分析柱之間有溶劑排出閥見圖1，一級(jí)色譜（LC）切入樣品真空蒸發(fā)排出溶劑后，再升溫氣化由載氣輸送進(jìn)入分析柱，經(jīng)分析柱分離后再通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)［18］。

3.2 萃取方式和萃取時(shí)間的確定

苯并［a］芘為低極性化合物，因此本實(shí)驗(yàn)中采用環(huán)己烷作為萃取溶劑。比較了振蕩萃取、超聲萃取和加熱回流提取等方法提取樣品中的苯并［a］芘。結(jié)果表明，加熱回流提取操作繁瑣，超聲萃取效率明顯優(yōu)于振蕩萃取，因此本實(shí)驗(yàn)選用超聲萃取。比較了不同萃取時(shí)間（10，20，30，40，50和60 min）對(duì)苯并［a］芘提取效果的影響（圖2）。結(jié)果表明:苯并［a］芘的釋放量隨萃取時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，在40 min時(shí)達(dá)到最大，再延長(zhǎng)萃取時(shí)間對(duì)苯并［a］芘的釋放量沒(méi)有明顯的影響，所以本實(shí)驗(yàn)選擇超聲萃取時(shí)間為40 min。

3.3 液相色譜柱的選擇

考慮到卷煙主流煙氣中苯并［a］芘的測(cè)定采用硅膠柱層析凈化，本實(shí)驗(yàn)采用UHP AQ Si色譜柱（150 mm ×2 mm，3.5μm，微孔球形硅膠）為液相色譜的分離柱，流量0.1 mL/min，與常規(guī)的硅膠固相萃取凈化相比，大大節(jié)約了有機(jī)流動(dòng)相。由于苯并［a］芘和卷煙煙氣中的主要共存物 （酚類、煙堿類似物、烴類等）極性差異比較大，用硅膠正相色譜能分離大部分的干擾組分，從而實(shí)現(xiàn)樣品的凈化。

圖1 在線液相-氣相二維色譜系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of on-line comprehensive two-dimensional liquid-gas chromatographic system

考慮到從液相色譜切入氣相色譜的餾分需排除溶劑后才能進(jìn)行氣相色譜分析，液相色譜需采用易揮發(fā)的流動(dòng)相，因此本實(shí)驗(yàn)中采用環(huán)己烷和丙酮作為流動(dòng)相，當(dāng)環(huán)己烷與丙酮體積比為20∶1時(shí)，苯并［a］芘有較好的凈化效果，因此實(shí)驗(yàn)選用該流動(dòng)相，流速為0.1 mL/min，出峰時(shí)間為7.1～8.3 min（圖3），考慮到收集定量環(huán)體積為200μL，最多只能切換200 μL的餾分進(jìn)入氣相色譜，為保證高濃度的樣品能夠完全收集，本實(shí)驗(yàn)選擇收集時(shí)間為6.8～8.6 min。

圖2 萃取時(shí)間對(duì)苯并［a］芘釋放量的影響Fig.2 Effect of extraction time on benzo［a］pyrene （B［a］P）release quantity

圖3 液相色譜凈化的色譜圖Fig.3 Chromatogram ofliquid chromatographic purification

3.4 GC-MS條件的選擇

對(duì)色譜和質(zhì)譜條件分別進(jìn)行了優(yōu)化，色譜條件主要對(duì)升溫程序進(jìn)行了優(yōu)化，考察了不同升溫程序的分離效果，以苯并［a］芘完全分離并盡可能縮短分析時(shí)間為目標(biāo)，最終選擇了2.2.3節(jié)中的升溫程序。以苯并［a］芘達(dá)到最高響應(yīng)為目標(biāo)，對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終選擇離子源溫度230℃，傳輸線溫度280℃，掃描質(zhì)量范圍50～400 amu，掃描間隔0.5 s。采用從總離子流圖提取單離子的方法進(jìn)行定量分析，苯并［a］芘定量離子為m/z 252，內(nèi)標(biāo)特征離子為m/z 264。在選定條件下，標(biāo)樣和樣品的色譜圖見圖4。

圖4 苯并［a］芘和內(nèi)標(biāo)的氣相色譜-質(zhì)譜分析色譜圖Fig.4 Chromatograms of gas chromatography-mass spectrometric analysis for B［a］P and internal standard

3.5 工作曲線、檢出限和定量限

配制不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，按選定儀器條件繪制工作曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的每一點(diǎn)進(jìn)樣3次，取其峰面積的平均值為縱坐標(biāo)，標(biāo)樣濃度為橫坐標(biāo)，回歸方程A=12.85C+0.173，相關(guān)系數(shù)為0.9997，線性范圍為0.08～50 ng/L。對(duì)最低濃度的苯并［a］芘標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行10次測(cè)定，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為檢出限，10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為定量限，分別為0.09和0.30 ng/支。

3.6 方法回收率和重復(fù)性

卷煙2R4F樣品4份，其中1份為參比，另3份分別加入高、中、低不同濃度水平的苯并［a］芘，樣品按2.2節(jié)的前處理方法處理，選定色譜條件進(jìn)樣分析，得到苯并［a］芘的回收率在94.2% ～105.5%之間（表1），說(shuō)明方法回收率較好。將參比卷煙2R4F重復(fù)分析6次，測(cè)得苯并［a］芘含量為7.21 ng/cig，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.7%，表明方法的重復(fù)性良好，滿足日常煙氣樣品的檢測(cè)。

表1 2R4F卷煙樣品主流煙氣中苯并［a］芘的回收率Table 1 Recovery rate of benzo（a）pyrene in cigarette mainstream smoke of 2R4F samples

3.7 卷煙樣品主流煙氣中苯并［a］芘分析結(jié)果

采用本方法和煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T21130-2007［19］中規(guī)定的方法對(duì)14個(gè)不同類型市售卷煙和2R4F卷煙樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。由表2可知，本方法的測(cè)定結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法GB/T21130-2007的分析結(jié)果具有較好的一致性，標(biāo)準(zhǔn)卷煙樣品2R4F數(shù)據(jù)也與文獻(xiàn)［20］報(bào)道值（6.96 ng/cig）基本一致，說(shuō)明本方法準(zhǔn)確可靠。

表2 14種卷煙樣品中苯并［a］芘的測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of benzo［a］pyrene in 14 kinds of cigarette samples

續(xù)表2（Continued to Table 2）

4 結(jié)論

基于在線液相-氣相二維色譜聯(lián)用技術(shù)，建立了測(cè)定卷煙主流煙氣中苯并［a］芘的新方法。采用微型硅膠柱凈化減少了溶劑消耗和環(huán)境污染，降低了實(shí)驗(yàn)成本。每次進(jìn)樣可達(dá)40 μL，與常規(guī)氣相色譜相比，進(jìn)樣量擴(kuò)大了20倍以上，靈敏度也顯著提高，同時(shí)避免了樣品處理過(guò)程中的濃縮、轉(zhuǎn)移、定容等前處理步驟，減少了實(shí)驗(yàn)誤差，由于樣品處理人工操作環(huán)節(jié)大大減少，方法的重現(xiàn)性和靈敏度明顯提高。

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This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.21365026）

Determination of Benzo［a］pyrene in Mainstream Cigarette Smoke by Online Comprehensive Two-dimensional Liquid-Gas Chromatography

LIU Chun-Bo，SHEN Qin-Peng，ZHANG Feng-Mei，ZHANG An-Feng，HE Pei，SI Xiao-Xi，LIU Zhi-Hua，YANG Guang-Yu*，MIAO Ming-Ming
（Key Lab of Tobacco Chemistry of Yunnan，Technology Center，China Tobacco Yunnan Industrial Co.，Ltd.，Kunming 650231，China）

An online comprehensive two-dimensional liquid-gas chromatography method was developed to determine the benzo［a］pyrene（B［a］P）in mainstream cigarette smoke.The B［a］P in mainstream cigarette smoke was collected by a cambridge filter pad，then the pad was extracted with cyclohexane and the extract was quantitatively analyzed by online LC-GC/MS with B［a］P-D12 as an internal standard.After direct injection into the performance liquid chromatography，the benzo［a］pyrene in the samples were separated by micro silica gel column and cut into the gas chromatography.After draining the solvent，the benzo［a］pyrene was separated by capillary column gas chromatography warming and detected by mass spectrometry detection. By using silica gel column chromatography and gas chromatography-mass spectrometry in combination，the benzo［a］pyrene in the mainstream cigarette smoke was directly detected without any sample pretreatment.The sample injection volume of the method could reach 40 μL each time，which was far greater than that of conventional gas chromatography-mass spectrometry（2.0 μL of sample injection volume），resulting in an increasing analysis sensitivity of 20 times.The linearity range of the method（R2=0.999）was in the range of 0.08 ng/L to 50 ng/L.The recoveries at three spiked levels ranged from 94.2%to 105.5%and the limit of detection was 0.09 ng/cig.This method was applied for the determination of benzo［a］pyrene in 14 kind cigarettes in Chinese marked and the reference cigarettes 2R4F，and the determination results were consistent with GB/T21130-2007 method.

Online comprehensive two-dimensional liquid-gas chromatography；Benzo［a］pyrene；Cigarette；Mainstream smoke

21 August 2015；accepted 5 November 2015）

10.11895/j.issn.0253-3820.150666

2015-08-21收稿；2015-11-05接受

本文系國(guó)家自然科學(xué)基金（No.21365026）資助項(xiàng)目

* E-mail:ygy1110@163.com