侯宏艷，惠文巧，張丹俊，胡曉苗，趙瑞宏

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031）

綿羊肺炎支原體的培養(yǎng)和PC R鑒定

侯宏艷，惠文巧，張丹俊，胡曉苗，趙瑞宏

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031）

安徽省3個(gè)山羊場(chǎng)有羊只發(fā)生肺炎癥狀，用支原體培養(yǎng)基對(duì)病料進(jìn)行病原分離，經(jīng)傳代和純化后分離到3株支原體，隨后對(duì)分離到的支原體進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察、PCR鑒定和序列比對(duì)，結(jié)果顯示分離到的支原體均為綿羊肺炎支原體。

山羊；綿羊肺炎支原體；培養(yǎng)；鑒定

綿羊肺炎支原體可引起綿羊和山羊發(fā)生以患羊被毛粗亂，食欲減少，體溫升高，咳嗽、喘氣和間質(zhì)增生性肺炎為特征的慢性呼吸道傳染病。成年羊有一定的抵抗力，羔羊發(fā)病率和死亡率較高，呈現(xiàn)地方性流行。綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）已在世界許多國(guó)家和地區(qū)流行。研究表明，在我國(guó)引起山羊和綿羊發(fā)生羊支原體性肺炎的主要病原是MO，如冷清文等［1］在新疆地區(qū)患呼吸道疾病的盤羊中分離到MO，楊發(fā)龍等［2］在四川地區(qū)患胸膜肺炎的山羊群中分離鑒定出MO，此外，還有馬玉等［3］、張軒等［4］、付琦等［5］和侯宏艷等［6］在不同地區(qū)分離鑒定出MO。

安徽省作為我國(guó)的養(yǎng)羊省份之一，近年來養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展迅速，羊支原體性肺炎是影響?zhàn)B羊業(yè)健康發(fā)展的重要疾病之一。筆者對(duì)引起安徽省3個(gè)山羊場(chǎng)發(fā)生肺炎的病原進(jìn)行分離培養(yǎng)和PCR鑒定，以期為更清楚地了解該類疾病的發(fā)病原因，提供更有效的防控措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基 病原分離的培養(yǎng)基為改良KM2培養(yǎng)基，參照儲(chǔ)岳峰［7］報(bào)道的方法進(jìn)行配制。

1.2 病料 安徽省某3個(gè)羊場(chǎng)發(fā)病羊只的肺組織。

1.3 病原分離 取肺組織樣品剪碎并用液體培養(yǎng)基進(jìn)行勻漿，隨后進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-3，37℃恒溫培養(yǎng)5~7 d后進(jìn)行傳代，直至培養(yǎng)物顏色變黃。當(dāng)培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色時(shí)，取液體培養(yǎng)物接種于固體培養(yǎng)基進(jìn)行觀察，置于濕盒中37℃培養(yǎng)，生長(zhǎng)4~5 d后，挑取單個(gè)特征明顯的菌落接種于液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待培養(yǎng)基顏色變黃后再次接種固體培養(yǎng)基。重復(fù)2~3次，得到分離純化的培養(yǎng)物。

1.4 病原鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察：將純化的液體培養(yǎng)物涂片，革蘭染色，用油鏡觀察菌體形態(tài)。將培養(yǎng)4~5 d的純化的固體培養(yǎng)物置于低倍鏡下觀察菌落形態(tài)。

1.4.2 PCR 鑒定：根據(jù)參考文獻(xiàn)［8］和［9］報(bào)道的MO和絲狀支原體族的特異性引物合成PCR用引物。MO的上游和下游引物為5′-GACTTCATCCTGCACTCTGT-3′和 5′-TGAACGGAATATGTTAGCTT-3′，絲狀支原體族的上游和下游引物為5′-CGAAAGCGGCTTACTGGCTTGTT-3′和 5′-TTGAGATTAGCTCCCCTTCACAG-3′。使用北京天根生化科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提純培養(yǎng)物基因組DNA，對(duì)分離到的病原進(jìn)行PCR 鑒定。 反應(yīng)體系為：2×Taqmix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上下游引物各 1 μL，模板 3 μL。 反應(yīng)條件為：95℃ 4 min；95℃ 30 s，55℃（擴(kuò)增絲狀支原體簇為 62℃）40 s，72℃ 45 s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為361 bp（絲狀支原體簇的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為548 bp）。

1.4.3 序列比對(duì)：將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與綿羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株Y-98用MegAlign軟件進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離與純化 病料在液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)后，培養(yǎng)基顏色由紅變黃，培養(yǎng)基除了有組織塊外，整體呈透明狀。在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后出現(xiàn)透明的小菌落，大小不一，低倍光學(xué)顯微鏡下可看到菌落呈圓形、突起（見圖1）。

圖1 分離物的純化菌落形態(tài)（100×）

2.2 革蘭染色 革蘭染色鏡檢可見有多形態(tài)的菌體，顏色為紅色，多為小球狀。

2.3 PCR鑒定 對(duì)純化的MO菌株提取DNA后，利用MO特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與預(yù)期大小相符的361 bp的片段 （見圖2）。經(jīng)MegAlign軟件比較，3株分離株的序列與綿羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株Y-98序列的相似性為97.8%、98.1%和97.5%。而用絲狀支原體簇的特異性引物擴(kuò)增后，沒有得到預(yù)期片段。

圖2 支原體分離株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

3 討論

MO由 Mackay等［10］于 1963年在蘇格蘭首次分離。 1972 年，Carmicheal等［11］證明了該種支原體的致病性。Goltz等［12］用人工感染方法進(jìn)行研究后認(rèn)為，MO 可引起山羊肺炎。 Rosário 等［13］研究結(jié)果也表明，MO在引起山羊肺炎的多種病原中有著重要的作用。羊支原體的培養(yǎng)比較困難，其對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求比較高，其中，醋酸鉈、青霉素、酚紅和血清等都是必須要添加的。儲(chǔ)岳峰［7］使用改良KM2培養(yǎng)基和Thiaucourt′s培養(yǎng)基對(duì) MO 進(jìn)行分離培養(yǎng)，付琦等［5］和冷清文等［1］則使用改良 Hayflick′s培養(yǎng)基。 該研究使用了改良的KM2培養(yǎng)基，成功分離到了3株MO。

該研究從表現(xiàn)肺炎癥狀的發(fā)病山羊肺組織中分離到菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、PCR鑒定及序列比對(duì)確認(rèn)為MO，而非絲狀支原體感染，說明MO是引起3個(gè)羊場(chǎng)發(fā)生肺炎的病原。通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，3株MO的序列與標(biāo)準(zhǔn)株序列的相似性分別為97.8%、98.1%和97.5%，它們的致病性是否存在差異，需要進(jìn)一步研究。

山羊相對(duì)綿羊更易發(fā)生支原體性肺炎，許多羊場(chǎng)防疫的疫苗為山羊傳染性胸膜肺炎氫氧化鋁滅活苗，其主要對(duì)Mmc起到保護(hù)作用，而MO滅活疫苗還沒有廣泛使用。在支原體性肺炎的高發(fā)地區(qū)免疫接種MO滅活疫苗是預(yù)防該病的有效措施［5］。同時(shí)，羊場(chǎng)要重視和嚴(yán)格執(zhí)行生物安全措施，冬春季節(jié)注意羊只保暖，發(fā)現(xiàn)流鼻涕、咳嗽等呼吸道疾病癥狀的羊只，應(yīng)及時(shí)對(duì)其進(jìn)行隔離治療，特別要對(duì)被污染的羊舍、場(chǎng)地、用具和發(fā)病死亡羊只的尸體等進(jìn)行徹底消毒和無害化處理。

［1］冷清文，李志遠(yuǎn)，魯海富，等.盤羊體內(nèi)綿羊肺炎支原體的分離和鑒定 ［J］. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，36（3）：197-200.

［2］楊發(fā)龍，王華，岳華，等.山羊中綿羊肺炎支原體的分離及鑒定［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，37（8）：177-180.

［3］馬玉，喬軍，孟慶玲，等.綿羊肺炎支原體新疆流行株的分離鑒定及其膜蛋白P80基因序列分析［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，28（3）：1375-1380.

［4］張軒，趙萍，賀英，等.綿羊肺炎支原體的分離鑒定［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（6）：193-195.

［5］付琦，趙寶華，朱子杰，等.綿羊肺炎支原體的分離與鑒定［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（增刊）：289-291.

［6］侯宏艷，惠文巧，張丹俊，等.山羊的綿羊肺炎支原體的分離和鑒定［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（28）：159-160.

［7］儲(chǔ)岳峰.我國(guó)山羊（接觸）傳染性胸膜肺炎病原學(xué)、流行病學(xué)研究及滅活疫苗的研制［D］.蘭州：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011.

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Culture and PCR Identification of Mycoplasma ovipneumoniae

HOU Hong-yan，HUI Wen-qiao，ZHANG Dan-jun，HU Xiao-miao，ZHAO Rui-hong
（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei230031，China）

Pneumonia symptoms of goats appeared in three goat farms in Anhui Province.The mycoplasma isolate was cultivated and purified from lung tissue sample of goats using mycoplasma medium.The mycoplasma isolate was characterized by morphologic observation,PCR identification and sequence alignment.The results indicate that the mycoplasma isolate belongs to Mycoplasma ovipneumoniae.

goat；Mycoplasma ovipneumoniae；culture；identification

S858.272.62

A文章順序編號(hào)1672-5190（2016）11-0097-02

2016－10－29

項(xiàng)目來源：安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（16A0413）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31402048）。

侯宏艷（1975—），女，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物病原學(xué)研究工作。

張丹俊（1962—），男，研究員，主要從事畜禽傳染病學(xué)研究工作。

（責(zé)任編輯：趙俊利）