敖特根巴雅爾，烏蘭其其格，陸繼爽，特尼格爾

（1.內(nèi)蒙古鄂托克旗農(nóng)牧業(yè)局動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 鄂托克旗 016100；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

干肉制品中霉菌PCR鑒定方法的建立

敖特根巴雅爾1，烏蘭其其格1，陸繼爽2，特尼格爾2

（1.內(nèi)蒙古鄂托克旗農(nóng)牧業(yè)局動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 鄂托克旗 016100；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

為了早期預(yù)防傳統(tǒng)牛肉干發(fā)生霉變，建立了牛肉干中真菌PCR的鑒定方法，在特異性和敏感性方面對所建立的PCR方法進(jìn)行了驗(yàn)證。其中特異性試驗(yàn)以霉變的鮮牛肉、酵母菌、乳酸球菌、乳酸桿菌、大腸桿菌為材料進(jìn)行驗(yàn)證；敏感性試驗(yàn)以霉變的鮮牛肉為材料，提取其DNA并將其稀釋成不同的濃度進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示：特異性試驗(yàn)中僅霉菌樣品在約300 bp處出現(xiàn)特異性條帶，而其他樣品在該處無特異性條帶出現(xiàn)，表明具有良好的特異性；敏感性試驗(yàn)中，霉菌DNA原液、10倍稀釋、100倍稀釋、1 000倍稀釋時(shí)均出現(xiàn)了約300 bp的特異性條帶，即霉菌DNA模板稀釋度為1 000倍（2 ng/μL）時(shí)仍對引物有敏感性。該試驗(yàn)為市場傳統(tǒng)牛肉干真菌PCR檢測工作提供了依據(jù)。

傳統(tǒng)牛肉干；真菌；PCR鑒定方法；特異性；敏感性

霉菌在自然界中廣泛存在，且其可以產(chǎn)生多種微小的孢子，因而很容易對食品造成污染［1］。食品被霉菌污染后不僅會腐敗變質(zhì)，正常營養(yǎng)成分被改變，而且部分霉菌還會產(chǎn)生毒素，人畜誤食后可能會發(fā)生中毒［2］。自從發(fā)現(xiàn)有強(qiáng)致癌作用的黃曲霉毒素以來［3］，人們對霉菌污染食品日益重視。因此，食品中霉菌的檢測就變得尤為重要。

目前，檢測食品中霉菌的常用方法是平板培養(yǎng)法、鏡檢計(jì)數(shù)法、快速測試片法以及PCR檢測法等［4］。平板培養(yǎng)法是使用滅菌的蒸餾水對樣品稀釋，選用合適的接種方法、培養(yǎng)基、溫度以及培養(yǎng)時(shí)間對樣品進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)［5］。該檢測方法雖然準(zhǔn)確度和靈敏度都比較高，但其過程相當(dāng)繁瑣，需要花費(fèi)大量的時(shí)間及人力物力，這對于食品廠家，尤其是保存期較短的食品來講用途不大，由于其用時(shí)長而極易使被檢測的保存期較短的食品產(chǎn)生食品安全問題。鏡檢計(jì)數(shù)法檢測霉菌所用的是郝氏計(jì)數(shù)法，需要用到帶有標(biāo)準(zhǔn)計(jì)測室的郝氏計(jì)測玻片，檢測時(shí)要將已稀釋樣品涂抹到上面，用90～125倍的放大倍數(shù)檢查每個(gè)視野，對其菌絲進(jìn)行計(jì)數(shù)［5］。由于檢測樣品量小，檢測結(jié)果往往偏差較大，但可大概確定霉菌數(shù)量級?？焖贉y試片法是生化檢測技術(shù)中的一種，它是以紙片、膠片和紙膜等作為培養(yǎng)基的載體，將特定培養(yǎng)基和顯色物質(zhì)附著在上面，憑借微生物在上面的生長特征和顯色反應(yīng)來判定食品中是否有霉菌的方法。因其反應(yīng)具有特異性，所以該檢測方法可以直觀并且準(zhǔn)確地反映出霉菌的種類和數(shù)量［6］。該方法操作簡單，非常適合現(xiàn)場的取樣和檢測，而且成本較低，具有很廣的應(yīng)用范圍。但其也有一定的局限性，因存在一些技術(shù)上的問題使得檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。PCR檢測技術(shù)是食品中霉菌檢測技術(shù)領(lǐng)域的熱點(diǎn)，具有敏感性高、準(zhǔn)確度高、快速和方便的特點(diǎn)。它是一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，在一定溫度下，由耐熱的DNA聚合酶作用，重復(fù)變性—退火—復(fù)性3個(gè)基本反應(yīng)步驟，是極微量的DNA片段成幾何倍數(shù)的擴(kuò)增，然后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增得到DNA條帶，以確定霉菌的特定種類。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，很多新的技術(shù)如逆轉(zhuǎn)錄PCR、巢式PCR、多重PCR和實(shí)時(shí)定量PCR，使得霉菌的檢測更為準(zhǔn)確。該試驗(yàn)采用普通PCR方法，通過擴(kuò)增霉菌的18S rDNA的保守區(qū)域，實(shí)現(xiàn)對已霉變的干肉制品的快速特異性檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 大腸桿菌、乳酸球菌、乳酸桿菌、霉菌、酵母菌，均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院分子實(shí)驗(yàn)平臺提供。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 主要儀器：電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、HZC-250型恒溫振蕩培養(yǎng)箱（太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）、核酸電泳儀（Bio-rad Power Pace Basic，美國伯樂公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Vilber公司）、離心機(jī)（Thermo公司）、多功能酶標(biāo)儀（BioTek公司）。

1.2.2 主要試劑：十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，天津市興復(fù)精細(xì)化工廠研究所）；LB培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；rTaq 酶、DL2000 DNA Marker（寶生物有限責(zé)任公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)：大腸桿菌、乳酸球菌、乳酸桿菌和酵母菌分別接種于LB培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)，霉菌則取自已經(jīng)發(fā)霉的牛肉干中，這些菌均待提取DNA。

1.3.2 模板DNA制備：霉菌DNA提?。孩購囊呀?jīng)發(fā)霉的牛肉干上用已消毒刀片刮取少量霉菌菌體于研缽中；②向研缽中倒入液氮，充分研磨至粉末狀。提前稱量1.5 mL離心管重，將樣品粉末小心倒入1.5 mL離心管中，室溫放置1～2 min；再稱量1.5 mL離心管重，計(jì)算樣品質(zhì)量；③按照1 g樣品加入5 mL 2%CTAB的比例加入65℃預(yù)熱的2%CTAB提取液，充分混勻后，置65℃水浴1 h，期間可適當(dāng)搖勻（每隔 5～10 min混勻 1次），取出后，放至室溫；④加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1），充分顛倒混合，將提取液中含有的蛋白質(zhì)變性，分裝至2.0 mL離心管內(nèi)，室溫下12 000 r/min離心10 min；⑤將上清轉(zhuǎn)移到新的2.0 mL離心管中，注意不要吸到中間的蛋白質(zhì)層，加入等體積氯仿/異戊醇（為吸取充分，可將吸到的蛋白質(zhì)層再離心），充分顛倒混合，抽提提取液中含有的蛋白質(zhì)，并萃取出其中的酚；室溫下12 000 r/min離心10 min；⑥將上清轉(zhuǎn)移到新1.5 mL離心管中，向上清中加入1倍體積異丙醇，充分顛倒混勻，使DNA從溶液中析出，形成絮狀沉淀（-20℃放置1～2 h促進(jìn)DNA沉淀）；4℃離心，12 000 r/min離心20 min；⑦棄上清，加入500 μL 70%乙醇，顛倒混勻，至沉淀懸起；⑧4℃12 000 r/min離心5 min，再用500 μL70%乙醇洗滌1次；⑨4℃12 000 r/min離心5 min，棄酒精，將剩余的液體盡量吸凈并干燥，加入適量TE緩沖液或滅菌三蒸水溶解DNA；如果DNA溶解困難，可以37℃溫育30 min；⑩DNA溶解后，可按樣品體積加入1/10體積的濃度為10 mg/mL的RNase A并在37℃處理 10 min，除去 RNA；取 1 μL用酶標(biāo)儀檢測其濃度，另取5 μL于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

酵母菌DNA也使用上述方法提取。乳酸球菌和乳酸桿菌則用溶菌酶在37℃溫浴30 min，再跟大腸桿菌一起用蛋白酶K在55℃處理30 min，然后再從上述步驟中的第4步開始進(jìn)行DNA的提取。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank中公布的霉菌18S rDNA序列設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為5′-AACTTAAAGGAATTGACGGAAG-3′，下游引物序列為 5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCT-3′，該引物為上海桑尼公司合成。

1.3.4 PCR體系的優(yōu)化：通過梯度PCR來篩選出合適的退火溫度。PCR反應(yīng)條件：95℃（5 min），95℃（30 s），梯度退火溫度（45 s），72 ℃（30 s），35 個(gè)循環(huán)，72 ℃（7 min）；退火溫度的梯度選擇：52.2、53.4、54.2、55.1、55.9、56.7、57.6 ℃；4 ℃保存。

表1 PCR反應(yīng)體系 μL

1.3.5 特異性試驗(yàn)：分別提取霉菌、酵母菌、乳酸桿菌、乳酸球菌、大腸桿菌基因組進(jìn)行PCR檢測，驗(yàn)證該檢測方法的特異性。

1.3.6 敏感性試驗(yàn)：將霉菌DNA提取液進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋梯度分別為原液、10倍稀釋、100倍稀釋、1 000倍稀釋以及10 000倍稀釋，DNA模板用量為1 μL，應(yīng)用以上DNA進(jìn)行PCR檢測，電泳觀察結(jié)果。

1.3.7 PCR產(chǎn)物電泳：取5 μL PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條件為1×TAE、2%瓊脂糖凝膠、120 V電壓條件下電泳25 min，最后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照留存。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物退火溫度的優(yōu)化 應(yīng)用梯度PCR方法對霉菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增，退火溫度設(shè)為52.2、53.4、54.2、55.1、55.9、56.7、57.6 ℃，在 300 bp 處均有目的條帶出現(xiàn)，55.9℃時(shí)呈現(xiàn)最強(qiáng)熒光，而在這些退火溫度均無非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)，說明該引物適合霉菌的DNA擴(kuò)增。所以選擇56℃作為以后PCR擴(kuò)增的退火溫度。結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同退火溫度下霉菌DNA PCR結(jié)果

2.2 特異性試驗(yàn) 霉菌DNA呈陽性擴(kuò)增，而其他幾種菌均無特異性條帶出現(xiàn)，表明該引物只與霉菌樣品有特性性反應(yīng)，不與其他幾種菌發(fā)生交叉反應(yīng)，證明設(shè)計(jì)引物特異性很強(qiáng)，與預(yù)期相符合（見圖2）。

圖2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 敏感性試驗(yàn) 分別以不同濃度的霉菌DNA做模板，檢測該P(yáng)CR方法對不同濃度模板的敏感性。由圖3可知，隨著模板DNA濃度的降低，PCR反應(yīng)的條帶亮度呈梯度下降。當(dāng)霉菌DNA濃度降為2 ng/μL時(shí)，仍可見到有微弱的目的條帶，因此該P(yáng)CR檢測方法的檢測敏感度是DNA濃度約為2 ng/μL的反應(yīng)體系。

圖3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

霉菌在生活中無處不在，它比較喜歡溫暖潮濕的環(huán)境，一有合適的環(huán)境就會大量的繁殖，尤其是會對食品產(chǎn)生極大威脅。所以必須采取有效措施來阻止霉菌的繁殖或切斷其傳播途徑，才可以擺脫霉菌的感染。食品受到霉菌污染后，其正常營養(yǎng)成分會被改變，并且會形成累積毒性，甚至生成有致癌作用的霉菌毒素，這會危害人與動物的生命安全［7］。最近幾年，由霉菌引起的食物中毒越來越多，而且曾報(bào)道的由霉菌引發(fā)的食物中毒，多是和人們生活息息相關(guān)的食品，人們對食品的安全性的要求越來越高。如今國家對于食品安全等越來越重視，并出臺了食品中的霉菌的檢測標(biāo)準(zhǔn)。

目前霉菌的檢測方法較多，該試驗(yàn)采用的是PCR方法。PCR早已廣泛應(yīng)用于各類病原菌的分類、鑒定以及檢測。通常通過設(shè)計(jì)特異性很強(qiáng)的引物對病原菌rDNA進(jìn)行PCR檢測，而真菌PCR檢測的是 18S rDNA 和 rDNA 中的 ITS、IGS 區(qū)［8-10］。PCR具有特異、敏感、高效、快速、簡便、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，它可以分析少量真菌細(xì)胞，甚至單個(gè)真菌孢子。這對于試驗(yàn)的準(zhǔn)確性、實(shí)用性以及試驗(yàn)周期更為實(shí)用。樣品小樣并不充足的前提下依然可以得出穩(wěn)定的測試結(jié)果，對試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性是至關(guān)重要的。

在該研究中，霉菌檢測的特異性反應(yīng)僅霉菌樣品出現(xiàn)特異性條帶，而其他樣品在該處無特異性條帶出現(xiàn)，表明該引物具有良好的特異性；在敏感性反應(yīng)上，霉菌DNA原液、10倍、100倍、1 000倍時(shí)均出現(xiàn)了特異性條帶，即霉菌DNA原液稀釋1 000倍（2 ng）時(shí)，仍對引物有敏感性。由此證明該方法是非常有效的。市場上某些不法商販為了盈利，將過期的牛肉干經(jīng)過處理后仍然銷售。經(jīng)處理后的發(fā)霉牛肉干外表無眼觀變化，通過氣味也無法分辨，但其中霉菌的含量很高。該研究方法的建立為變質(zhì)發(fā)霉牛肉干的快速檢測奠定了實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)，為有關(guān)霉菌的檢測工作提供參考，為實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)和生活安全提供保障。

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Establishment of a PCR Assay for Detection of Molds in Dried Meat Products

Aotegenbayaer1，Wulanqiqige1，LU Ji-shuang2，Tenigeer2
（1.Center for Animal Disease Control and Prevention of Etuoke Banner of Inner Mongolia，Etuoke Banne 016100，China；2.College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

In order to prevent the mildewing of traditional beef jerky in the early stage of retention period， a PCR assay for detection of molds in beef jerky was established,and the specificity and sensibility of the PCR assay were verified.The mouldy fresh beef,yeast,Lactococcus lactis,Lactobacillus and E.coli were used as materials to verify the specificity of the established PCR assay,and a series of different concentration gradients of DNA solutions extracted from mouldy fresh beef were used to identify its sensibility.The results demonstrated that when the DNA extracted from yeast was used as a template,a specific 300 bp amplicon was obtained by the PCR assay;however,no amplicons were obtained using the DNA extracted from other samples as template,which indicated the good specificity of the established PCR assay.The specific bands were observed when the DNA stock solution extracted from mouldy fresh beef samples as well as the 10 times,100 times and 1 000 times diluent of the stock solution were used as template in the PCR assay.The 2 ng/μL of the DNA template was still sensitive to the primers.The PCR assay developed in this study provided a new technique for the rapid detection of molds contamination of saled traditional beefjerky in market.

traditional beef jerky；molds；PCR detection method；specificity；sensibility

TS251.42；TS207.4

A文章順序編號1672-5190（2016）03-0049-03

2016-02-16

項(xiàng)目來源：蒙古馬耐力素質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)量研究（217-206008）。

敖特根巴雅爾（1974—），男，獸醫(yī)師，主要從事動物疫病預(yù)防控制工作。

烏蘭其其格（1974—），女，畜牧師，主要從事家畜品種改良工作。

（責(zé)任編輯：錢英紅）