張曦媛，孟建宇

（內蒙古農業(yè)大學生命科學學院應用與環(huán)境微生物研究所，內蒙古 呼和浩特 010018）

鹽堿湖耐鹽菌菌株MIM19的生理生化特性分析

張曦媛，孟建宇

（內蒙古農業(yè)大學生命科學學院應用與環(huán)境微生物研究所，內蒙古 呼和浩特 010018）

對分離自內蒙古渾善達克鹽堿湖的1株耐鹽菌MIM19的生理生化特性進行了研究。結果表明，該菌為革蘭陰性桿菌，菌落呈粉紅色，可分泌酯酶、脲酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶，能夠液化明膠，還原亞硝酸鹽。

鹽堿湖；耐鹽菌；生理生化特性

地球表面廣泛存在的大面積鹽水環(huán)境為一種喜鹽微生物，即耐鹽菌的出現與進化提供了極為有利的條件［1］，該種高鹽環(huán)境包括鹽湖、鹽堿湖以及死海等濃縮海水［2-3］。目前，對耐鹽菌的研究主要集中在其產生的大分子多聚物、生物活性物質以及這些物質在生物環(huán)保中的應用等方面［4-5］。另外，耐鹽菌對高鹽環(huán)境廣泛而強大的適應能力以及耐鹽菌的生理特性和代謝機制的特殊性，也使之成為人們分離、篩選新的活性物質的主要來源之一［6-7］。

內蒙古地區(qū)分布有廣泛的鹽堿湖系統(tǒng)，其中蘊藏著豐富的微生物資源，利用這些微生物資源對鹽堿湖進行治理、改造和合理開發(fā)利用，可為生態(tài)可持續(xù)發(fā)展提供新途徑［8-9］。在對高鹽環(huán)境長期適應的微生物群體中，逐漸進化出了較為特殊的耐鹽機制［10-11］。同時，針對湖泊與土壤的鹽堿化對生產與生態(tài)帶來極大不良影響的現狀，如何結合微生物改良手段，如轉耐鹽基因植物的改造或微生物菌肥的開發(fā)等手段［12］，有效開展鹽堿地與鹽湖系統(tǒng)的治理、改造工作，提升其經濟與生態(tài)效益，已成為當今環(huán)境與生態(tài)科學的研究熱點問題之一［13-15］。為此，該研究對分離自內蒙古地區(qū)鹽堿湖的耐鹽菌株MIM19的生理生化特性進行了分析，以期為后期耐鹽微生物菌劑的研究與開發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 耐鹽菌菌株：耐鹽菌菌株MIM19由內蒙古農業(yè)大學生命科學學院應用與環(huán)境微生物研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基：

①液體培養(yǎng)基：酵母粉0.5 g/L，蛋白胨2.5 g/L，MgCl24.4 g/L，KCl 0.275 g/L，Na2SO31.62 g/L，CaCl20.9 g/L，NaHCO30.08 g/L，檸檬酸鐵0.05 g/L，NaCl 9.76 g/L，微量元素溶液5 mL/L，pH值為9～10，蒸餾水1 000 mL。

②微量元素溶液配方：FeCl30.05 g/L，MnSO4· H2O 0.02 g/L，H3BO30.01 g/L，CuSO4·5H2O 0.01 g/L，（NH4）6Mo7O24·4H2O 0.02 g/L，ZnSO40.01 g/L，EDTA 0.5 g/L，CaCl2·2H2O 0.2 g/L。

③固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g/L制成。

④半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂6 g/L制成。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)特征觀察：通過平板劃線培養(yǎng)和革蘭染色法，觀察菌株MIM19的基本形態(tài)特征。

1.2.2 生長曲線的繪制：將MIM19菌株接種于含50 mL液體培養(yǎng)基的 150 mL錐形瓶中，30℃、200 r/min搖床光照培養(yǎng)。隔時取樣，于540 nm下進行吸光度測定。以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD540nm值為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.3 生理生化特性：

①酯酶：劃線接種于Tween 20終濃度為1%的固體培養(yǎng)基中，33℃光照培養(yǎng)，每天觀察。

②苯丙氨酸脫氫酶：在固體培養(yǎng)基中加入0.2 g DL-苯丙氨酸，冷卻至40～50℃，接種，適溫培養(yǎng)；滴加10%（W/V）的FeCl3溶液4～5滴于生長菌的培養(yǎng)基上，觀察培養(yǎng)基表面和冷凝水的顏色。

③精氨酸雙水解酶：在半固體培養(yǎng)基中加入1 g L-精氨酸鹽分裝試管4～5 mL，冷卻至40～50℃，用幼齡菌穿刺接種，適溫培養(yǎng)3、7、14 d，觀察試驗結果。

④賴氨酸脫羧酶：在半固體培養(yǎng)基中加入1 g L-賴氨酸分裝試管3～4 mL，121℃滅菌10 min，冷卻，接種，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。取62.5 μL濃度為1.6%的溴甲酚紫及250 μL濃度為0.2%的甲酚紅作為指示劑，觀察試驗結果。

⑤脲酶：配制固體培養(yǎng)基，在菌液中滴加1滴酚紅試劑，調pH值至9.0。在其中1份菌液中加0.1 g尿素，另1份不加作為對照，觀察顏色變化。倒平板，冷卻至40～50℃，接種，適溫培養(yǎng)。

⑥甲基紅：將菌株接種于液體培養(yǎng)基中適溫培養(yǎng)2～6 d；在菌液中滴加1滴甲基紅試劑，觀察試驗結果。

⑦淀粉水解：菌株接種于含0.2%可溶性淀粉的固體培養(yǎng)基上，適溫培養(yǎng)2～5 d，形成菌落后滴加盧哥氏碘液，觀察試驗結果。

⑧明膠液化：將固體培養(yǎng)基中的瓊脂換成10～15 g明膠分裝試管 4～5 cm，115℃間歇滅菌20 min。取培養(yǎng)物穿刺接種，設空白對照，20℃溫箱培養(yǎng)2、7、10、14 d。置于20℃以下環(huán)境中，觀察是否凹陷，判斷是否液化。

⑨硝酸鹽還原：在液體培養(yǎng)基中加0.1 g KNO3分裝試管4～5 cm，冷卻，取培養(yǎng)菌穿刺接種，設空白對照，置適溫培養(yǎng)3、5、7 d，觀察試驗結果。取干凈試管分別倒入培養(yǎng)3、5、7 d的培養(yǎng)液后，各加入1滴格里斯氏試劑，設空白對照，觀察試驗結果。

⑩亞硝酸鹽還原：在液體培養(yǎng)基中加入0.1 g NaNO2分裝試管4～5 cm，冷卻，取培養(yǎng)菌穿刺接種，設空白對照，置適溫培養(yǎng)3、5、7 d，觀察試驗結果。取干凈試管分別倒入培養(yǎng)3、5、7 d的培養(yǎng)液后，各加入1滴格里斯氏試劑，設空白對照，觀察試驗結果。

2 結果與分析

2.1 MIM19菌株的形態(tài)特征和生長曲線 菌株MIM19為革蘭陰性菌，呈桿狀，菌落為粉紅色。根據不同發(fā)酵時間取樣，對樣品在540 nm下進行吸光度測定，根據OD540nm值繪制出生長曲線。由圖1可以看出，0～24 h為延滯期，24～72 h為指數期，72～96 h為穩(wěn)定期，120 h后為衰亡期。

圖1 菌株MIM19的生長曲線

2.2 MIM19菌株的生理生化特性 對菌株MIM19進行生理生化特性分析，發(fā)現菌株MIM19可分泌酯酶、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶和脲酶，可水解明膠，可還原亞硝酸鹽，不產生苯丙氨酸脫氫酶，甲基紅試驗和淀粉水解試驗為陰性，不能還原硝酸鹽。詳細結果見表1。

表1 菌株MIM19的生理生化特性

3 結論與討論

耐鹽菌菌株MIM19是1株革蘭陰性桿狀細菌，菌落為粉紅色。菌株培養(yǎng)24 h后進入指數生長期，在72 h后達到穩(wěn)定期。菌株MIM19可分泌酯酶、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶和脲酶，不產生苯丙氨酸脫氫酶，可使明膠液化，不能水解淀粉，甲基紅試驗為陰性，可還原亞硝酸鹽，不能還原硝酸鹽。

目前，國內對耐鹽菌的研究較多［16-18］。 對耐鹽菌耐鹽機制及生化特性的研究，無論在轉基因抗鹽菌株的構建還是環(huán)境修復等方面均有廣闊的應用前景［19］。內蒙古地區(qū)擁有豐富的鹽堿湖系統(tǒng)生物資源優(yōu)勢，是極其寶貴的基因資源，具有重大的科學研究和經濟開發(fā)價值［20-21］。

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《畜牧與飼料科學》雜志簡介

《畜牧與飼料科學》是經科技部和國家新聞出版總署批準的學術類期刊。1973年創(chuàng)刊，是《中國學術期刊綜合評價數據庫》《中國學術期刊（光盤版）》《中國核心期刊（遴選）數據庫》《中文科技期刊數據庫》等全文收錄期刊。

主要欄目：基礎科學、試驗研究、水產科學、實驗技術、生物工程、遺傳與繁育、資源與環(huán)境、動物營養(yǎng)與飼料科學、草業(yè)科學、食品科學、畜牧生產、教學研究、藥物科學、動物檢疫、經濟與管理、疾病防治、工藝設備、生態(tài)工程、特種養(yǎng)殖等。

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Physiological and Biochemical Characteristic of a Strain of Halotolerant Bacterium MIM19 Isolated from Salt Alkaline Lake

ZHANG Xi-yuan，MENG Jian-yu
（Institute for Applied and Environmental Microbiology，College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

The physiological and biochemical characteristic of a halotolerant bacterium designated as MIM19 which was isolated from the Hunshandake Salt Lake in Inner Mongolia were investigated.The results showed that the strain was found to be gramnegative and pink-pigmented bacterium.It was able to secreted lipoidase,urease,lysine decarboxylase and arginine dihydrolase, liquefied gelatin and reduced nitrite.

salt alkaline lake；halophiles；physiological and biochemical characteristic

Q93-3

A文章順序編號：1672-5190（2016）09-0022-03

2016－08－09

項目來源：國家自然科學基金項目（31460002）；內蒙古自治區(qū)高等學?？茖W研究項目（NJZY14084）。

張曦媛（1994—），女，所學專業(yè)為生物工程。

孟建宇（1977—），男，副教授，主要研究方向為應用與資源微生物學。

（責任編輯：趙俊利）