張曦媛，孟建宇

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用與環(huán)境微生物研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

鹽堿湖耐鹽菌菌株MIM19的生理生化特性分析

張曦媛，孟建宇

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用與環(huán)境微生物研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

對分離自內(nèi)蒙古渾善達克鹽堿湖的1株耐鹽菌MIM19的生理生化特性進行了研究。結(jié)果表明，該菌為革蘭陰性桿菌，菌落呈粉紅色，可分泌酯酶、脲酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶，能夠液化明膠，還原亞硝酸鹽。

鹽堿湖；耐鹽菌；生理生化特性

地球表面廣泛存在的大面積鹽水環(huán)境為一種喜鹽微生物，即耐鹽菌的出現(xiàn)與進化提供了極為有利的條件［1］，該種高鹽環(huán)境包括鹽湖、鹽堿湖以及死海等濃縮海水［2-3］。目前，對耐鹽菌的研究主要集中在其產(chǎn)生的大分子多聚物、生物活性物質(zhì)以及這些物質(zhì)在生物環(huán)保中的應(yīng)用等方面［4-5］。另外，耐鹽菌對高鹽環(huán)境廣泛而強大的適應(yīng)能力以及耐鹽菌的生理特性和代謝機制的特殊性，也使之成為人們分離、篩選新的活性物質(zhì)的主要來源之一［6-7］。

內(nèi)蒙古地區(qū)分布有廣泛的鹽堿湖系統(tǒng)，其中蘊藏著豐富的微生物資源，利用這些微生物資源對鹽堿湖進行治理、改造和合理開發(fā)利用，可為生態(tài)可持續(xù)發(fā)展提供新途徑［8-9］。在對高鹽環(huán)境長期適應(yīng)的微生物群體中，逐漸進化出了較為特殊的耐鹽機制［10-11］。同時，針對湖泊與土壤的鹽堿化對生產(chǎn)與生態(tài)帶來極大不良影響的現(xiàn)狀，如何結(jié)合微生物改良手段，如轉(zhuǎn)耐鹽基因植物的改造或微生物菌肥的開發(fā)等手段［12］，有效開展鹽堿地與鹽湖系統(tǒng)的治理、改造工作，提升其經(jīng)濟與生態(tài)效益，已成為當今環(huán)境與生態(tài)科學(xué)的研究熱點問題之一［13-15］。為此，該研究對分離自內(nèi)蒙古地區(qū)鹽堿湖的耐鹽菌株MIM19的生理生化特性進行了分析，以期為后期耐鹽微生物菌劑的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 耐鹽菌菌株：耐鹽菌菌株MIM19由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用與環(huán)境微生物研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基：

①液體培養(yǎng)基：酵母粉0.5 g/L，蛋白胨2.5 g/L，MgCl24.4 g/L，KCl 0.275 g/L，Na2SO31.62 g/L，CaCl20.9 g/L，NaHCO30.08 g/L，檸檬酸鐵0.05 g/L，NaCl 9.76 g/L，微量元素溶液5 mL/L，pH值為9～10，蒸餾水1 000 mL。

②微量元素溶液配方：FeCl30.05 g/L，MnSO4· H2O 0.02 g/L，H3BO30.01 g/L，CuSO4·5H2O 0.01 g/L，（NH4）6Mo7O24·4H2O 0.02 g/L，ZnSO40.01 g/L，EDTA 0.5 g/L，CaCl2·2H2O 0.2 g/L。

③固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g/L制成。

④半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂6 g/L制成。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)特征觀察：通過平板劃線培養(yǎng)和革蘭染色法，觀察菌株MIM19的基本形態(tài)特征。

1.2.2 生長曲線的繪制：將MIM19菌株接種于含50 mL液體培養(yǎng)基的 150 mL錐形瓶中，30℃、200 r/min搖床光照培養(yǎng)。隔時取樣，于540 nm下進行吸光度測定。以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD540nm值為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.3 生理生化特性：

①酯酶：劃線接種于Tween 20終濃度為1%的固體培養(yǎng)基中，33℃光照培養(yǎng)，每天觀察。

②苯丙氨酸脫氫酶：在固體培養(yǎng)基中加入0.2 g DL-苯丙氨酸，冷卻至40～50℃，接種，適溫培養(yǎng)；滴加10%（W/V）的FeCl3溶液4～5滴于生長菌的培養(yǎng)基上，觀察培養(yǎng)基表面和冷凝水的顏色。

③精氨酸雙水解酶：在半固體培養(yǎng)基中加入1 g L-精氨酸鹽分裝試管4～5 mL，冷卻至40～50℃，用幼齡菌穿刺接種，適溫培養(yǎng)3、7、14 d，觀察試驗結(jié)果。

④賴氨酸脫羧酶：在半固體培養(yǎng)基中加入1 g L-賴氨酸分裝試管3～4 mL，121℃滅菌10 min，冷卻，接種，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。取62.5 μL濃度為1.6%的溴甲酚紫及250 μL濃度為0.2%的甲酚紅作為指示劑，觀察試驗結(jié)果。

⑤脲酶：配制固體培養(yǎng)基，在菌液中滴加1滴酚紅試劑，調(diào)pH值至9.0。在其中1份菌液中加0.1 g尿素，另1份不加作為對照，觀察顏色變化。倒平板，冷卻至40～50℃，接種，適溫培養(yǎng)。

⑥甲基紅：將菌株接種于液體培養(yǎng)基中適溫培養(yǎng)2～6 d；在菌液中滴加1滴甲基紅試劑，觀察試驗結(jié)果。

⑦淀粉水解：菌株接種于含0.2%可溶性淀粉的固體培養(yǎng)基上，適溫培養(yǎng)2～5 d，形成菌落后滴加盧哥氏碘液，觀察試驗結(jié)果。

⑧明膠液化：將固體培養(yǎng)基中的瓊脂換成10～15 g明膠分裝試管 4～5 cm，115℃間歇滅菌20 min。取培養(yǎng)物穿刺接種，設(shè)空白對照，20℃溫箱培養(yǎng)2、7、10、14 d。置于20℃以下環(huán)境中，觀察是否凹陷，判斷是否液化。

⑨硝酸鹽還原：在液體培養(yǎng)基中加0.1 g KNO3分裝試管4～5 cm，冷卻，取培養(yǎng)菌穿刺接種，設(shè)空白對照，置適溫培養(yǎng)3、5、7 d，觀察試驗結(jié)果。取干凈試管分別倒入培養(yǎng)3、5、7 d的培養(yǎng)液后，各加入1滴格里斯氏試劑，設(shè)空白對照，觀察試驗結(jié)果。

⑩亞硝酸鹽還原：在液體培養(yǎng)基中加入0.1 g NaNO2分裝試管4～5 cm，冷卻，取培養(yǎng)菌穿刺接種，設(shè)空白對照，置適溫培養(yǎng)3、5、7 d，觀察試驗結(jié)果。取干凈試管分別倒入培養(yǎng)3、5、7 d的培養(yǎng)液后，各加入1滴格里斯氏試劑，設(shè)空白對照，觀察試驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 MIM19菌株的形態(tài)特征和生長曲線 菌株MIM19為革蘭陰性菌，呈桿狀，菌落為粉紅色。根據(jù)不同發(fā)酵時間取樣，對樣品在540 nm下進行吸光度測定，根據(jù)OD540nm值繪制出生長曲線。由圖1可以看出，0～24 h為延滯期，24～72 h為指數(shù)期，72～96 h為穩(wěn)定期，120 h后為衰亡期。

圖1 菌株MIM19的生長曲線

2.2 MIM19菌株的生理生化特性 對菌株MIM19進行生理生化特性分析，發(fā)現(xiàn)菌株MIM19可分泌酯酶、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶和脲酶，可水解明膠，可還原亞硝酸鹽，不產(chǎn)生苯丙氨酸脫氫酶，甲基紅試驗和淀粉水解試驗為陰性，不能還原硝酸鹽。詳細結(jié)果見表1。

表1 菌株MIM19的生理生化特性

3 結(jié)論與討論

耐鹽菌菌株MIM19是1株革蘭陰性桿狀細菌，菌落為粉紅色。菌株培養(yǎng)24 h后進入指數(shù)生長期，在72 h后達到穩(wěn)定期。菌株MIM19可分泌酯酶、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶和脲酶，不產(chǎn)生苯丙氨酸脫氫酶，可使明膠液化，不能水解淀粉，甲基紅試驗為陰性，可還原亞硝酸鹽，不能還原硝酸鹽。

目前，國內(nèi)對耐鹽菌的研究較多［16-18］。 對耐鹽菌耐鹽機制及生化特性的研究，無論在轉(zhuǎn)基因抗鹽菌株的構(gòu)建還是環(huán)境修復(fù)等方面均有廣闊的應(yīng)用前景［19］。內(nèi)蒙古地區(qū)擁有豐富的鹽堿湖系統(tǒng)生物資源優(yōu)勢，是極其寶貴的基因資源，具有重大的科學(xué)研究和經(jīng)濟開發(fā)價值［20-21］。

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《畜牧與飼料科學(xué)》雜志簡介

《畜牧與飼料科學(xué)》是經(jīng)科技部和國家新聞出版總署批準的學(xué)術(shù)類期刊。1973年創(chuàng)刊，是《中國學(xué)術(shù)期刊綜合評價數(shù)據(jù)庫》《中國學(xué)術(shù)期刊（光盤版）》《中國核心期刊（遴選）數(shù)據(jù)庫》《中文科技期刊數(shù)據(jù)庫》等全文收錄期刊。

主要欄目：基礎(chǔ)科學(xué)、試驗研究、水產(chǎn)科學(xué)、實驗技術(shù)、生物工程、遺傳與繁育、資源與環(huán)境、動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)、草業(yè)科學(xué)、食品科學(xué)、畜牧生產(chǎn)、教學(xué)研究、藥物科學(xué)、動物檢疫、經(jīng)濟與管理、疾病防治、工藝設(shè)備、生態(tài)工程、特種養(yǎng)殖等。

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Physiological and Biochemical Characteristic of a Strain of Halotolerant Bacterium MIM19 Isolated from Salt Alkaline Lake

ZHANG Xi-yuan，MENG Jian-yu
（Institute for Applied and Environmental Microbiology，College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

The physiological and biochemical characteristic of a halotolerant bacterium designated as MIM19 which was isolated from the Hunshandake Salt Lake in Inner Mongolia were investigated.The results showed that the strain was found to be gramnegative and pink-pigmented bacterium.It was able to secreted lipoidase,urease,lysine decarboxylase and arginine dihydrolase, liquefied gelatin and reduced nitrite.

salt alkaline lake；halophiles；physiological and biochemical characteristic

Q93-3

A文章順序編號：1672-5190（2016）09-0022-03

2016－08－09

項目來源：國家自然科學(xué)基金項目（31460002）；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校科學(xué)研究項目（NJZY14084）。

張曦媛（1994—），女，所學(xué)專業(yè)為生物工程。

孟建宇（1977—），男，副教授，主要研究方向為應(yīng)用與資源微生物學(xué)。

（責(zé)任編輯：趙俊利）