金 磊，王彥平，劉亞鵬，杜 陽(yáng)

（內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

貯存溫度對(duì)液體乳糖酶活性的影響

金 磊，王彥平，劉亞鵬，杜 陽(yáng)

（內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

乳糖酶，別名β-半乳糖苷酶，主要應(yīng)用于乳品行業(yè)，其主要作用是使乳糖水解為葡萄糖和半乳糖。由于乳糖酶存在受熱降解的特性，在對(duì)其進(jìn)行貯存的過(guò)程中，乳糖酶的活性會(huì)隨貯存溫度的變化而變化。對(duì)不同溫度條件下貯存的液體乳糖酶活性進(jìn)行了對(duì)比檢測(cè)與分析。

乳糖酶；活性；溫度；檢測(cè)

乳糖酶也稱為β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，簡(jiǎn)稱β-半乳糖苷酶。乳糖酶可以水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖的混合物［1-2］。目前，乳糖酶廣泛應(yīng)用于乳品行業(yè)，特別是在牛乳中添加乳糖酶可以水解乳糖，解決乳糖不耐癥，增加牛奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和有效利用率。由于乳糖酶是一種熱敏物質(zhì)，貯存溫度對(duì)乳糖酶的活力存在一定影響，進(jìn)而會(huì)影響到產(chǎn)品中乳糖水解的效率，因此，貯存溫度對(duì)乳糖酶的活力至關(guān)重要。為此，該研究對(duì)不同溫度條件下貯存的液體乳糖酶進(jìn)行了對(duì)比檢測(cè)與分析。但是，目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有乳糖酶產(chǎn)品的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法，筆者參考國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)（FCC8）的測(cè)定方法，對(duì)液體乳糖酶的活力值進(jìn)行了測(cè)定［3-8］。

1 試驗(yàn)方法

1.1 研究任務(wù) 通過(guò)對(duì)5、20、37℃3種不同貯存溫度的乳糖酶進(jìn)行酶活檢測(cè)，進(jìn)而對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比與考察。最終得出，不同貯存溫度對(duì)液體乳糖酶的活力值會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響。

1.2 樣品、試劑與儀器

1.2.1 樣品與試劑：乳糖酶，無(wú)水磷酸二氫鉀、三水合磷酸氫二鉀、七水合硫酸鎂、乙二胺四乙酸（EDTA）、鄰硝基苯酚、鄰硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）。

1.2.2 儀器：紫外分光光度計(jì)，精密電子天平，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，pH計(jì)。

1.3 試劑制備

1.3.1 緩沖溶液：稱取8.8g無(wú)水磷酸二氫鉀，8.0g三水合磷酸氫二鉀，246.5 mg七水合硫酸鎂和18.6 mg EDTA溶解在800 mL超純水中，轉(zhuǎn)入1 000 mL的容量瓶，用超純水定容并搖勻，緩沖溶液的pH值為6.45～6.55（如不在該范圍內(nèi)，可用磷酸或氫氧化鉀水溶液進(jìn)行調(diào)整）。

1.3.2 ONPG底物溶液：將250.0 mg ONPG溶解在80 mL反應(yīng)緩沖液中，接著轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用緩沖溶液定容，搖勻。最早在培養(yǎng)開(kāi)始前2 h制備底物。

1.3.3 碳酸鈉溶液：將50 g碳酸鈉和37.2 g二水EDTA溶解在900 mL的水中，轉(zhuǎn)移到1 000 mL的容量瓶中并定容到刻度。

1.3.4 鄰硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取138.0～140.0 mg的鄰硝基苯酚（精確到0.1 mg），用10 mL 96%的乙醇溶解后，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，用超純水定容并搖勻。

1.4 測(cè)定步驟

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別移取鄰硝基苯酚儲(chǔ)備液2、4、6、8、10、12、14 mL到100 mL的容量瓶中，分別加入25 mL碳酸鈉溶液，再用緩沖溶液定容至刻度，搖勻，這樣溶液中鄰硝基苯酚所對(duì)應(yīng)的濃度分別為 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mmol/L。用紫外分光光度計(jì)，在420 nm處測(cè)定每個(gè)稀釋液的吸光度，用超純水校零。

1.4.2 樣品稀釋液的制備：移取適量樣品，用緩沖溶液溶解后，轉(zhuǎn)移至合適的容量瓶中并定容，利用待檢樣品的默認(rèn)活力值來(lái)進(jìn)行稀釋因子的推算，使得稀釋后溶液中含有0.025～0.100 NLU/mL的活力值。

1.4.3 樣品培養(yǎng)與檢測(cè)：取最終濃度的樣品液1 mL加入至合適的試管中，從t=0 min開(kāi)始，按照樣品標(biāo)記的順序，以相同的順序、相同的時(shí)間間隔將加有1 mL樣品的樣品管放入（30±0.1）℃水浴中；從t= 5 min開(kāi)始，按照相同的樣品順序和相同的時(shí)間間隔，在 （30±0.1）℃水浴中用移液槍加入 5.0 mL ONPG底物，混合后再次放入水浴中；從t=15 min開(kāi)始，按照相同的樣品順序和相同的時(shí)間間隔，用移液槍加入2.0 mL碳酸鈉溶液并快速混合均勻，并終止培養(yǎng)。最后，在30 min內(nèi)，用紫外分光光度計(jì)在420 nm處測(cè)定每個(gè)稀釋后樣品的吸光度，儀器用超純水校零。

1.4.4 空白樣品的制備：先用移液槍移取1mL緩沖溶液至空試管中，接下來(lái)再用移液槍先后加入2.0 mL碳酸鈉溶液和5.0 mL ONPG底物，攪拌（空白樣品的制備可以與1.4.3操作同時(shí)進(jìn)行）。在30 min內(nèi)，用紫外分光光度計(jì)在420 nm處測(cè)定每個(gè)稀釋后樣品的吸光度，儀器用超純水校零。

1.5 結(jié)果計(jì)算

1.5.1 摩爾吸光系數(shù)（E）：以吸光值和ONPG濃度繪制曲線，該曲線應(yīng)為能過(guò)原點(diǎn)的直線。

摩爾吸光系數(shù)的計(jì)算公式：

E=A×139.0/（W×C）

式中：A為樣品吸光度；W為鄰硝基苯酚的質(zhì)量，mg；C為初始樣品量相當(dāng)于139.0 mg時(shí)鄰硝基苯酚溶液的濃度（mmol/mL）。

分別計(jì)算7種不同濃度下的鄰硝基苯酚溶液的摩爾吸光系數(shù)，最終求得平均值，該數(shù)值應(yīng)當(dāng)在（4.6±0.1）范圍內(nèi)。

1.5.2 活力值計(jì)算

酶活力計(jì)算公式：酶活力（NLU/mL）=A×8×f/E× 10×1.30

式中：A為樣品吸光度；8為總的最終體積，mL；f為待測(cè)乳糖酶溶液的稀釋倍數(shù)；E為鄰硝基苯酚摩爾吸光系數(shù)；10為培養(yǎng)時(shí)間，min；1.30為在單位定義中所用因子。

2 試驗(yàn)過(guò)程及數(shù)據(jù)分析

以O(shè)NPG為反應(yīng)底物，在一定反應(yīng)條件下水解10 min，生成鄰硝基苯酚和半乳糖，鄰硝基苯酚在420 nm處有特異性吸收，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較后定量。

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 按照1.4.1的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以稀釋液的吸光度對(duì)鄰硝基苯酚的物質(zhì)的量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同濃度鄰硝基苯酚在420 nm處的吸收值

該標(biāo)準(zhǔn)曲線為通過(guò)原點(diǎn)的一條直線，方程為y=4.5845x+0.0006，相關(guān)系數(shù)R2=1.000。由圖1可以看出，該標(biāo)準(zhǔn)曲線滿足了必須為通過(guò)原點(diǎn)的一條直線的要求。

圖1 鄰硝基苯酚摩爾吸光系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)上文給出的摩爾吸光系數(shù)的計(jì)算公式，可以計(jì)算出表1中7個(gè)摩爾吸光系數(shù)的平均值為= 4.60。

該方法中，通過(guò)連續(xù) 4次對(duì)鄰硝基苯酚在420 nm處的吸光值進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算其摩爾吸光系數(shù)的平均值（鄰硝基苯酚的值變化見(jiàn)表2）。

表2 測(cè)定得到的鄰硝基苯酚的平均摩爾吸光系數(shù)

由表2可以看出，鄰硝基苯酚的E值變化很小，該值大小可能與配制標(biāo)準(zhǔn)溶液中所用到的試劑、溶劑以及儀器性能有關(guān)，該值滿足檢測(cè)方法中對(duì)值的要求，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果不會(huì)有顯著影響。

2.2 酶活力測(cè)試結(jié)果數(shù)據(jù) 對(duì)5、20、37℃3種貯存溫度條件下的液體乳糖酶進(jìn)行了7個(gè)月貯存期的活力值考察。所檢測(cè)得到的乳糖酶活力值數(shù)據(jù)見(jiàn)表3、表4和表5。

2.3 酶活力測(cè)試結(jié)果數(shù)據(jù)對(duì)比 3種溫度貯存乳糖酶的活力數(shù)據(jù)對(duì)比情況見(jiàn)圖2。

表3 乳糖酶貯存條件為5℃時(shí)測(cè)得的乳糖酶活力值

表4 乳糖酶貯存條件為20℃時(shí)測(cè)得的乳糖酶活力值

表5 乳糖酶貯存條件為37℃時(shí)測(cè)得的乳糖酶活力值

圖2 不同溫度貯存液體乳糖酶活力值衰減趨勢(shì)

3 結(jié)論

①乳糖酶的貯存溫度與乳糖酶活力值有直接相關(guān)性。②在不同溫度貯存條件下貯存的乳糖酶，貯存溫度較低的乳糖酶其活力值在貯存期間無(wú)顯著變化；貯存溫度較高的乳糖酶，其活力值在貯存期間存在顯著變化。③該試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度較高環(huán)境下貯存液體乳糖酶，其活力衰減很快；溫度較低環(huán)境下貯存液體乳糖酶，其活力衰減慢且少。因此，對(duì)乳糖酶進(jìn)行冷藏貯存比較好且有必要。

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Effect of Storage Temperature on Liquid Lactase Activity

JIN Lei，WANG Yan-ping，LIU Ya-peng，DU Yang
（Inner Mongolia Dairy Technology Research Institute Co.，Ltd.，Hohhot010110，China）

Lactase,also called β-galactosidase,is able to hydrolyze lactose into glucose and galactose and is mainly applied in dairy industry.Because lactase possesses the characteristic of thermal degradation,its activity is prone to change with the variation of storage temperature during the storage process.The activity of liquid lactase under different storage temperature were compared and analyzed.

lactose；activity；temperature；determination

Q55；TS252

A文章順序編號(hào)：1672-5190（2016）09-0019-03

2016-07-26

項(xiàng)目來(lái)源：內(nèi)蒙古自治區(qū)2013年科技重大專項(xiàng)（乳品生產(chǎn)全產(chǎn)業(yè)鏈新技術(shù)集成應(yīng)用及高端乳制品的研究開(kāi)發(fā)）。

金磊（1977—），男，助理工程師，主要研究方向?yàn)槭称芳庸づc安全。

（責(zé)任編輯：慕宗杰）