王文娟，鄭　丹，劉　彬

(1.成都市婦女兒童中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，四川 成都　610014；2.廣漢市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，四川 廣漢　618300；3.廣漢市人民醫(yī)院 肝膽科，四川 廣漢　618300)

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臨床經(jīng)驗(yàn)交流

結(jié)合型膽汁酸對(duì)膽管癌的診斷價(jià)值

王文娟1，鄭丹2，劉彬3

(1.成都市婦女兒童中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，四川 成都610014；2.廣漢市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，四川 廣漢618300；3.廣漢市人民醫(yī)院 肝膽科，四川 廣漢618300)

目的 探討膽汁酸代謝的改變對(duì)膽管癌的診斷價(jià)值。方法 采用反向高效液相色譜紫外檢測(cè)法(RP-HPLC-UV)分別測(cè)定15例膽管癌患者、38例膽結(jié)石患者以及21例無(wú)膽道疾病的腹部外傷患者膽汁中9種結(jié)合型膽汁酸濃度。結(jié)果 膽管癌組膽汁中甘氨膽酸(GCA)和甘氨鵝脫氧膽酸(GDCA)明顯高于膽結(jié)石組和對(duì)照組(P<0.05)；膽結(jié)石組膽汁中?；悄懰?TCA)、牛磺脫氧膽酸(TDCA)高于膽管癌組和對(duì)照組(PP<0.05)。結(jié)論 膽汁中結(jié)合型膽汁酸譜可作為潛在的生物學(xué)指標(biāo)來(lái)早期診斷膽管癌。

膽管癌；膽汁；膽汁酸；色譜法

膽管癌是一種惡性程度很高，難于早期診斷和治療的惡性腫瘤。有研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論是肝內(nèi)膽管癌還是肝外膽管癌均源自于膽道系統(tǒng)的導(dǎo)管上皮細(xì)胞[1]。已知的危險(xiǎn)因素包括Caroli 病、慢性病毒性肝炎、化學(xué)性致癌因素、肝內(nèi)膽管結(jié)石、寄生蟲(chóng)病，原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)[2]等。大多數(shù)膽管癌患者在確診時(shí)腫塊已經(jīng)無(wú)法切除，在過(guò)去30年，包括手術(shù)切除的全部膽管癌患者的5年生存率僅為5%[3]，因此膽管癌的早期診斷和鑒別診斷十分重要。膽管癌患者早期，B超、CT和MRI等影像學(xué)檢查很少能發(fā)現(xiàn)病灶，腫瘤標(biāo)志物檢查亦缺乏特異性，待發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期，預(yù)后較差。膽結(jié)石是膽管癌已知的危險(xiǎn)因素，為了幫助提高早期診斷率和與膽結(jié)石的鑒別診斷，本研究對(duì)膽管癌、膽結(jié)石患者以及對(duì)照組膽汁中結(jié)合型膽汁酸譜的分析以期找到更合適的診斷膽管癌的方法。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象廣漢市人民醫(yī)院肝膽科2014年3月至2015年5月收治膽結(jié)石患者38例(男14例，女24例)，年齡(50.50±18.74)歲，為B超和/或腹部CT檢查確診并排除其他消化道疾病患者；膽管癌15例(男6例，女9例)，年齡(55.00±10.42)歲，為病理學(xué)確診并排除其他消化道腫瘤患者；對(duì)照組21例(男12例，女9例)，年齡(46.30±10.52)歲，為無(wú)肝膽疾病的腹部外傷患者。

1.2方法膽汁樣本通過(guò)外科手術(shù)或ERCP獲得，采集后立即-80℃凍存。膽汁測(cè)定方法采用預(yù)先建立起來(lái)的固相萃取-高效液相色譜-紫外檢測(cè)法[4]，用此法測(cè)定膽汁中?；切苊撗跄懰?TUDCA)、牛磺膽酸(TCA)、甘氨膽酸(GCA)、甘氨石膽酸(GLCA)、?；蛆Z脫氧膽酸(TCDCA)、?；敲撗跄懰?TDCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)、甘氨脫氧膽酸(GDCA)和?；鞘懰?TLCA)9種結(jié)合型膽汁酸。

1.2.1色譜條件色譜儀為Shimadzu 2010高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，色譜柱為Waters Nova C18柱(3.9 mm×150 mm,5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-60 mmol/L磷酸鹽緩沖液(66∶34，v/v)，pH 3.3，等度洗脫，柱溫25℃，流速0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)197 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.2樣品預(yù)處理方法取膽汁20 μL,加入5 mL/L甲酸溶液1 mL，旋渦震蕩混勻后加至已活化的固相萃取C18小柱上(預(yù)先用甲醇1 mL和5 mL/L甲酸溶液1 mL依次活化C18小柱)，用5 mL/L甲酸2 mL和450 mL/L甲醇溶液1 mL依次淋洗小柱，最后用3 mL甲醇洗脫膽汁酸。洗脫液在60 ℃氮?dú)庀麓蹈珊笕苡?00 μL流動(dòng)相，超聲30 s，10 μL進(jìn)樣。

2　結(jié)果

2.1人口學(xué)基本特征分析對(duì)3個(gè)組的年齡進(jìn)行分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.42，P=0.25)，對(duì)3個(gè)組性別構(gòu)成進(jìn)行比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.35，P=0.31)，3個(gè)組在人口學(xué)基本特征上均衡可比。

2.2膽汁酸色譜圖分析通過(guò)分析膽汁酸色譜圖可以發(fā)現(xiàn)，膽管癌患者、膽結(jié)石患者及對(duì)照組的色譜圖差異較大(見(jiàn)圖1)，GCA和GCDCA在膽管癌患者的色譜圖中升高較為明顯，而膽結(jié)石患者中各結(jié)合膽汁酸含量較正常組都有升高。

A： 膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖；B：膽管癌患者的色譜圖；C：膽結(jié)石患者的色譜圖；D ：對(duì)照組患者的色譜圖 ；1：TUDCA;2：TCA;3：GCA;4：GLCA;5：TCDCA;6：TDCA;7：GCDCA;8：GDCA;9：TLCA。圖1　各組膽汁酸色譜圖比較

2.39種結(jié)合型膽汁酸構(gòu)成比在3個(gè)組間的比較由于影響膽汁中結(jié)合型膽汁酸含量(絕對(duì)值)的因素較多，其結(jié)果可能受分析方法、地區(qū)人群、飲食結(jié)構(gòu)等影響，所以僅比較各組結(jié)合型膽汁酸的含量，結(jié)果并不可靠。本研究也發(fā)現(xiàn)各組病人膽汁酸組分濃度變異較大，所以采用膽汁酸構(gòu)成比來(lái)比較各組膽汁酸譜的差異。比較3組間9種結(jié)合型膽汁酸構(gòu)成比的差異，發(fā)現(xiàn)膽管癌組膽汁中GCA和GCDCA明顯高于膽結(jié)石組和對(duì)照組，而膽結(jié)石組中TCA、TDCA高于膽管癌組和對(duì)照組(見(jiàn)表1)。

表19種結(jié)合型膽汁酸比值在膽結(jié)石、膽管癌與對(duì)照組中的結(jié)果比較

膽汁酸構(gòu)成比(%)對(duì)照組(n=21)膽結(jié)石組(n=38)膽管癌組(n=15)F/χ2PTUDCA5.0±7.82.7±5.93.7±4.11.92*0.433TCA25.5±16.3A30.6±4.5B16.8±10.0C9.980.0002GCA25.8±9.8B22.8±5.4B36.4±8.7A19.34<0.0001GLCA1.2±0.51.3±0.50.9±0.82.640.0787TCDCA20.8±3.417.7±15.212.5±7.32.260.1123TDCA1.0±2.7A6.8±1.1B3.1±1.5C31.45<0.0001GCDCA18.9±6.1A14.8±5.9B23.9±9.0C10.380.0001GDCA0.9±2.32.7±1.11.8±1.345.63<0.0001TLCA0.9±0.60.6±0.60.9±0.72.160.1232

*：采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)， A、B、C：采用SNK-q檢驗(yàn)兩兩比較后，字母不同的組別，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TUDCA:?；切苊撗跄懰?TCA:?；悄懰?GCA:甘氨膽酸;GLCA:甘氨石膽酸;TCDCA:?；蛆Z脫氧膽酸;TDCA:牛磺脫氧膽酸;GCDCA:甘氨鵝脫氧膽酸;GDCA:甘氨脫氧膽酸;TLCA:?；鞘懰帷?/p>

3　討論

膽管癌是一種常見(jiàn)于肝膽管內(nèi)外的病死率極高的惡性腫瘤，它一般與慢性膽汁淤積、膽汁酸明顯升高以及膽管阻塞等相聯(lián)系。膽管阻塞可能會(huì)引起膽管癌患者膽汁中膽汁酸濃度和成分的變化，并且膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)的改變可能造成膽汁酸排泄減少?gòu)亩黾又掳┠懼嵩谀懝苌掀さ睦鄯e[5]。有證據(jù)顯示膽汁淤積和異常的膽汁酸代謝輪廓與膽管癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系更為密切[6]。然而哪些膽汁酸會(huì)促進(jìn)膽管癌的發(fā)生和能引起膽道腫瘤侵襲性生長(zhǎng)的機(jī)制還尚未明確。最新的研究[7]顯示，結(jié)合型膽汁酸而非游離膽汁酸可刺激膽管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且游離和結(jié)合膽汁酸比值的平衡在其對(duì)膽管癌的致癌性中扮演了重要角色。動(dòng)物模型[8]顯示結(jié)合型膽汁酸通過(guò)1-磷酸鞘氨醇受體2(S1PR2)介導(dǎo)刺激細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2 (ERK1/2)和蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路。有體外研究進(jìn)一步顯示[9]結(jié)合型膽汁酸激活了ERK1/2和AKT信號(hào)通路，并明顯刺激了膽管癌細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)。還有研究[10]顯示膽汁酸的致癌機(jī)制可能與膽管細(xì)胞的氧化應(yīng)激機(jī)制有關(guān)，該研究發(fā)現(xiàn)GCDCA在大鼠膽管細(xì)胞中可誘導(dǎo)活性氧(ROS)的產(chǎn)生和谷胱甘肽(GSH)的消耗從而引起細(xì)胞脫氧核糖核酸(DNA)氧化損傷，而其他膽汁酸未引起明顯的改變，還發(fā)現(xiàn)GCDCA對(duì)細(xì)胞長(zhǎng)期的DNA氧化損傷導(dǎo)致膽管細(xì)胞癌變。

本研究顯示GCA、GCDCA在膽管癌患者膽汁中明顯增加，TCA則減少，TDCA比膽結(jié)石組減少比對(duì)照組增加；而TCA、TDCA在膽結(jié)石患者膽汁中明顯升高，GCDCA和GCA則明顯減少。本研究發(fā)現(xiàn)膽管癌患者膽汁中甘氨結(jié)合型膽汁酸相對(duì)增高，?；墙Y(jié)合型膽汁酸相對(duì)減少；膽結(jié)石患者則是?；墙Y(jié)合型膽汁酸相對(duì)升高，甘氨結(jié)合型相對(duì)減少。有報(bào)道[11]顯示牛磺結(jié)合型膽汁酸的鈣結(jié)合力明顯低于甘氨結(jié)合型，本研究中膽結(jié)石組?；墙Y(jié)合型膽汁酸升高可能引起膽汁酸與Ca2+總結(jié)合力下降，膽汁中游離Ca2+增加，而Ca2+在多個(gè)環(huán)節(jié)參與了結(jié)石的形成[12]。Sharif[13]等報(bào)道膽管癌患者與其他良性膽道疾病相比較初級(jí)膽汁酸和它們的甘氨結(jié)合型明顯增加，這與本研究甘氨結(jié)合型膽汁酸在膽管癌中升高的結(jié)果一致。膽汁酸在膽管細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)平衡對(duì)維持膽管細(xì)胞正常生理功能和免受膽汁酸毒性作用具有重要意義[14]。因此本研究認(rèn)為膽汁中膽汁酸的亞組分改變可能對(duì)膽管癌的發(fā)生發(fā)展具有一定的作用，增加的致癌膽汁酸打破了膽汁酸水平的平衡再加上膽汁酸的細(xì)胞毒性引起膽管上皮細(xì)胞DNA氧化損傷和突變從而引起癌變的發(fā)生。膽管癌和其他良性的膽道疾病可能具有其特異的膽汁酸代謝譜，膽汁中結(jié)合型膽汁酸代謝輪廓分析可能有助于膽管癌的早期診斷。

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[收稿2016-04-26;修回2016-05-28]

(編輯：王福軍)

The value of analysis on conjugated bile acids in biliary tract cancer

WangWenjuan1,ZhengDan2,LiuBin3

(1.Clinical Laboratory of Chengdu Women and Children’s Central Hospital, Chengdu Sichuan 610014,China;2.Clinical Laboratory of Guanghan People's Hospital,Guanghan Sichuan 618300,China;3.Hepatology of Guanghan People's Hospital,Guanghan Sichuan 618300,China)

Objective To explore the possibel value of change on metabolism of bile acid in diagnosis of biliary tract cancer.Methods 15 biliary tract cancer patients, 38 gallstone patients and 21 normal controls were randomly enrolled. The concentrations of nine conjugated bile acids in bile were determined by RP-HPLC-UV.Results The proportion of GCA and GCDCA were increased in biliary tract cancer group than that in biliary tract stone group (P<0.05). The proportion of TCA and TDCA were increased in biliary tract stone group than that in both biliary tract cancer and control groups (P<0.05).Conclusion Conjugated bile acids might be the potential biomarkers for the early diagnosis of biliary tract cancer.

biliary tract cancer ；bile；bile acids；chromatography

R735.8

B

1000-2715(2016)04-0403-03