駱詩露，黃　健，韓道賓，陳澤慧，朱杰華，閔　迅

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，貴州 遵義　563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，貴州 遵義　563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

肺炎鏈球菌SP2108蛋白的原核表達(dá)及免疫原性分析*

駱詩露1，黃健2，韓道賓1，陳澤慧2，朱杰華2，閔迅2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，貴州 遵義563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，貴州 遵義563099)

目的 制備純化的肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae,S.pn)SP2108蛋白，分析其在常見S.pn菌株中的保守性，并評(píng)價(jià)其作為S.pn候選疫苗的可行性。方法 利用PCR法擴(kuò)增全長(zhǎng)SP2108基因，將其克隆至原核表達(dá)載體pCold TF中，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)后IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，經(jīng)Ni-NTA樹脂純化獲得高純度的目的蛋白；將純化蛋白免疫C57BL/6小鼠制備多克隆抗體，并用間接ELISA檢測(cè)效價(jià)，Western blot鑒定該蛋白在6種常見S.pn菌株的保守性。從Genebank中找出不同S.pn菌株的SP2108蛋白質(zhì)氨基酸序列，并用ClustalX 2.1軟件分析其序列保守性。結(jié)果 獲得了可溶性形式的SP2108蛋白，該重組蛋白免疫小鼠后可獲得高滴度的多克隆抗體；Western blot驗(yàn)證了SP2108 蛋白在6株常見S.pn菌株中均有表達(dá)；SP2108蛋白在不同型別S.pn中氨基酸序列保守性為100%。結(jié)論 原核表達(dá)并純化了SP2108蛋白，該蛋白保守性高，免疫小鼠后可獲得高滴度的多克隆抗體，可能是一種較好的S.pn候選蛋白疫苗。

肺炎鏈球菌；SP2108蛋白；原核表達(dá)；保守性；C57BL/6小鼠

肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae,S.pn)是定植于人體鼻咽部黏膜表面的革蘭陽性條件致病菌，可引起肺炎、中耳炎、腦膜炎等疾病，其在65歲以上老年人及5歲以下兒童中具有較高的致病率和致死率[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肺炎居我國5歲以下兒童死因的前五位，在重癥肺炎中，約有50%是由S.pn引起[2]。近年來，由于抗生素的濫用及S.pn多重耐藥菌株的廣泛出現(xiàn)，預(yù)防和控制S.pn感染已經(jīng)進(jìn)入到疫苗接種階段[3]。目前上市的S.pn疫苗主要包括23價(jià)莢膜多糖疫苗和7價(jià)多糖蛋白結(jié)合疫苗，前者抗原性弱，主要適用于中老年人及存在高風(fēng)險(xiǎn)的成年人，對(duì)2歲以下的幼兒無免疫保護(hù)力[4]；后者雖能顯著減低侵襲性S.pn疾病，但該種疫苗存在血清覆蓋范圍窄、生產(chǎn)成本高、非疫苗血清型替換等缺點(diǎn)，不利于在發(fā)展中國家大規(guī)模使用[5]。而S.pn蛋白質(zhì)疫苗具有免疫原性強(qiáng)、保守性高，制備成本低等優(yōu)勢(shì)，其作為現(xiàn)有疫苗的替代品或者補(bǔ)充物已成為了近10年S.pn疫苗研發(fā)的主流。

SP2108蛋白是S.pnABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的底物結(jié)合蛋白，能特異性地結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)麥芽糖，從而調(diào)節(jié)細(xì)菌生長(zhǎng)及在鼻咽部的定植[6-7]。通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法已證實(shí)SP2108位于S.pn的表面，它能夠刺激經(jīng)S.pn全菌免疫后的不同品系小鼠的脾細(xì)胞及自然暴露S.pn的人體外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生IL-17A，且能在S.pn感染早期引起機(jī)體CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，是一個(gè)具有潛力的候選疫苗靶點(diǎn)[8]。本實(shí)驗(yàn)主要通過原核表達(dá)及純化SP2108蛋白，將其免疫小鼠制備多克隆抗體，并進(jìn)一步分析保守性，探討其作為S.pn候選蛋白疫苗的可行性，為研發(fā)新的蛋白疫苗提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株及質(zhì)粒大腸桿菌E.coliDH5a、E.coliBL21(DE3)、pCold TF質(zhì)粒為本課題組實(shí)驗(yàn)室保存；NTCC7466(D39,serotype 2)、TIGR4(serotype 4)S.pn標(biāo)準(zhǔn)菌株購自歐洲菌株保存中心；不同血清型S.pn臨床菌株 CMCC(B) 31693(serotype 19F) 、CMCC(B)31207(serotype 6B)、CMCC(B)31203(serotype 3)、ATCC (BAA-255) (R6 serotype 2)購自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保存中心。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠，SPF級(jí)，6～8周, 雌性，18～20 g，購自中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3主要試劑蛋白質(zhì)Marker、 DL 2000 DNA Marker、T4DNA連接酶、PrimerStar高保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRI/Xho I、DNA純化試劑盒購自TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)mega公司生產(chǎn)；基因組DNA提取試劑盒購自北京天根公司生產(chǎn)；高敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購自上海七海復(fù)泰生物科技有限公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗購自北京中杉金橋公司；Ni2+-NTA 親和層析柱購自美國GE Healthcare 公司；其他試劑購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.4方法

1.4.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)GeneBank中SP2108基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)上游引物F:5'-CGGAATTCTTATTCACCAAATTTTTGTTTG3'；下游引物R:5'-CCGCTCGAGATGTCATCTAAATTTATGAAG-3'，下劃線部分分別為EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4.2PCR擴(kuò)增目的基因以細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取D39標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA，以此為模板行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：98 ℃變性20 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸95 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化回收。

1.4.3構(gòu)建pCold TF- SP2108原核表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I同時(shí)酶切目的基因及質(zhì)粒載體，純化后按一定比例混合并加入T4DNA連接酶16 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用含氨芐西林(100 μg/mL)的LB平板篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒行雙酶切鑒定，并送南京金斯瑞公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4.4重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)中，涂布含氨芐西林(100 μg/mL)的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜后挑取含有重組表達(dá)載體的E.coliBL21(DE3)單個(gè)菌落接種于5 mL含氨芐西林(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)液中，37 ℃，180 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)過夜，次日按1∶50比例轉(zhuǎn)接于含同濃度氨芐西林的LB培養(yǎng)液中，同條件繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=0.5左右時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度0.5 mmol/L), 15 ℃，100 r/min, 誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h 后離心收集誘導(dǎo)菌，并將其重懸于1×Binding Buffer(300 mmol /L NaCl,10 mmol/L PBS ,pH 8.0)中，經(jīng)超聲破菌離心后分別取上清和沉淀行SDS-PAGE鑒定其表達(dá)形式。按照His Bind Column操作說明，將破菌后的上清液轉(zhuǎn)入Ni-NTA親和層析柱中，經(jīng)洗滌緩沖液(300 mmol/L NaCl,10 mmol/L PBS,30 mmol/L咪唑,pH 8.0)充分洗柱后，用洗脫緩沖液(10 mmol/LPBS, 300 mmol /L咪唑, pH 8.0)洗脫目的蛋白，SDS-PAGE分析純度后用PBS進(jìn)行超濾除Nacl及咪唑。Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量,調(diào)整濃度為1 μg/μL后分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5制備多克隆抗體及檢測(cè)抗體效價(jià)取SP2108 純化蛋白與等體積Alum 佐劑充分混合后，經(jīng)皮下多點(diǎn)注射免疫C57BL/6小鼠，共免疫3次，每次間隔14 d,免疫劑量10 μg/只(首次免疫劑量加倍)，同時(shí)設(shè)只注射Alum佐劑陰性對(duì)照組。末次免疫后第7天經(jīng)尾靜脈取血，分離血清。用抗原包被液(pH 9.6的碳酸鹽緩沖液)調(diào)節(jié)純化重組SP2108蛋白濃度為10 μg/mL，加至96孔酶標(biāo)板(100 μL/孔)，4 ℃包被過夜；37 ℃，5%BSA封閉2 h后，用封閉液將小鼠抗SP2108血清從1∶8 000起倍比稀釋，37 ℃反應(yīng)1 h；洗板后，將HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG用封閉液按1∶5 000稀釋，每孔100 μL,37 ℃反應(yīng)45 min；分別加入顯色液A、B各50 μL后37 ℃避光反應(yīng)30 min，最后加入終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取450 nm下的吸光度值。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：以待測(cè)標(biāo)本A450 nm/Alum佐劑對(duì)照A450 nm≥2.1判為陽性，出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)為該抗體的滴度。

1.4.6Western Blot檢測(cè)SP2108蛋白的表達(dá)將R6、 2、3、6B、14、19F型的S.pn菌株分別接種于THY液體培養(yǎng)基中，置5% CO237 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)取2 mL菌液離心收集沉淀，PBS洗滌2次，加50 μL 1×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液充分混勻，沸水煮10 min后，室溫最高轉(zhuǎn)速離心5 min，取5 μL上清行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)PVDF膜，經(jīng)5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h后，加小鼠抗 SP2108血清(1∶2 000稀釋)作為一抗，4 ℃搖床上孵育過夜；室溫，PBST洗滌3次(10 min/次)，加入 HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)為二抗，室溫?fù)u床上孵育1 h；PBST洗滌3次(10 min/次)后用高靈敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。E.coliBL21(DE3)作陰性對(duì)照。

1.4.7分析保守性從Genebank中查找不同型別S.pn的SP2108蛋白質(zhì)氨基酸序列，用ClustalX 2.1軟件分析其序列保守性。

2　結(jié)果

2.1SP2108基因的擴(kuò)增PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳后，可在1 272 bp處見清晰的擴(kuò)增條帶，且無非特異性條帶，大小與預(yù)期一致(見圖1)。

M:DNA Marker 2000； 1-2 SP2108基因擴(kuò)增產(chǎn)物。圖1　SP2108基因PCR擴(kuò)增

2.2原核表達(dá)載體的構(gòu)建挑取目的基因與pCold TF連接轉(zhuǎn)化E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞后的單個(gè)菌落行PCR，進(jìn)一步提取PCR陽性菌落的重組質(zhì)粒行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，可見與SP2108目的基因大小相符的酶切片段，結(jié)果見圖2。測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中D39型S.pn菌株的SP2108基因進(jìn)行比對(duì)，序列相符，提示SP2108重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化轉(zhuǎn)化的pCold TF-SP2108-E.coliBL21 (DE3)經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)后，在相對(duì)分子量約105 KD處可見特異蛋白條帶，為SP2108蛋白50 KD和pCold TF 55 KD標(biāo)簽蛋白之和，大小與預(yù)期相符(圖3A中的第4泳道)。該蛋白主要以可溶性形式存在，經(jīng) Ni-NTA柱親和層析純化后，可獲得高純度的目的蛋白(圖3B中的第8泳道) 。

2.4ELISA檢測(cè)多克隆抗體效價(jià)將制備的重組SP2108蛋白免疫C57BL/6小鼠，采用間接ELISA法測(cè)定抗SP2108 IgG抗體的效價(jià)，其中，對(duì)照組血清幾乎未檢測(cè)到抗SP2108抗體，而實(shí)驗(yàn)組小鼠血清抗體滴度達(dá)1:8.19×106，提示SP2108蛋白能刺激小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。

2.5SP2108蛋白在不同血清型S.pn中的表達(dá)情況不同血清型S.pn菌體裂解后的上清行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，以抗SP2108小鼠血清為一抗，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行ECL顯色色鑒定，結(jié)果示：6 株S.pn菌在分子量約50 KD 處均有特異性反應(yīng)條帶出現(xiàn)，而E.coliBL21未見反應(yīng)條帶(見圖 4)。

1-7：CMCC(B)31207、CMCC(B)31203、CMCC(B) 31693、TIGR4、ATCC (BAA-255) R6、NTCC7466、E.coli BL21。　　圖4　6種不同血清型S.pn中 SP2108 蛋白的表達(dá)分析

2.6保守性分析從Genebank數(shù)據(jù)庫中查找6種國內(nèi)流行血清型別(2、7F、14、15B、18A、19A)S.pn菌株中SP2108蛋白的氨基酸序列,通過ClustalX2.1軟件對(duì)序列行完全比對(duì)分析，結(jié)果示SP2108蛋白在不同型別S.pn間保守性為100%，提示SP2108蛋白在我國主要流行S.pn菌株間具有較高的保守性(見圖5)。

圖5　不同血清型別S.pn間SP2108蛋白保守性分析

3　討論

由于S.pn多糖疫苗和多糖蛋白結(jié)合疫苗在臨床運(yùn)用過程中暴露出了諸多缺點(diǎn)，使得S.pn蛋白質(zhì)疫苗成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，而選擇理想的蛋白靶點(diǎn)成為了S.pn蛋白疫苗研發(fā)的重心。理想的S.pn蛋白選擇應(yīng)包括3個(gè)方面：①保守性高，在所有S.pn血清型菌株中都表達(dá)；②免疫原性強(qiáng)，能對(duì)所有年齡階段人群均引起免疫保護(hù)；③在S.pn表面表達(dá)，能在感染早期引起機(jī)體免疫應(yīng)答。目前已經(jīng)報(bào)道了多種S.pn表面毒力蛋白在不同小鼠模型中的保護(hù)作用，例如S.pn表面蛋白A(PspA)，膽堿結(jié)合蛋白(CbpA)、表面粘附素(PasA)等，雖然它們都表達(dá)于S.pn表面，但由于其序列保守性不高，變異性大，保護(hù)效果較為局限[9-10]。因此，有必要繼續(xù)篩選理想的S.pn表面毒力蛋白。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是細(xì)菌質(zhì)膜上轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸、磷脂、糖和肽等物質(zhì)的龐大的蛋白質(zhì)家族 ，是細(xì)菌跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的重要組成部分，其與細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)代謝、滲透壓維持以及耐藥性關(guān)系緊密[11]。研究證實(shí)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AdcA/AdcAII通過影響Zn2+平衡而影響S.pn在鼻咽部定植及毒力的發(fā)揮[12]。而關(guān)于該家族中SP2108 蛋白在細(xì)菌毒力方面的報(bào)道甚少。因此，本研究以SP2108蛋白為研究對(duì)象，成功獲得了可溶性形式表達(dá)的SP2108 重組蛋白，該蛋白具有很好的免疫原性，ELISA檢測(cè)其多克隆抗體效價(jià)極高，Western Blot鑒定結(jié)果示該多克隆抗體可以識(shí)別6種不同血清型S.pn菌株中的SP2108蛋白，ClustalX2.1軟件分析的蛋白質(zhì)氨基酸序列保守性也高達(dá)100%，初步提示該蛋白不存在抗原表位變異，具有高度的保守性，提示其可能是一個(gè)良好的候選蛋白疫苗。

本研究首次制備了純度較好的SP2108重組蛋白和高滴度的SP2108蛋白抗體，并證實(shí)了該蛋白的免疫原性和保守性，為該蛋白疫苗的后期體內(nèi)、外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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[收稿2016-05-11;修回2016-07-12]

(編輯：王靜)

Prokaryotic expression and conservative analysis of SP2108 protein fromStreptococcuspneumoniae

LuoShilu1,HuangJian2,HanDaobin1,ChenZehui2,ZhuJiehua2,MinXun2

(1.Department of Labroatory Medicine,Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2.Department of Labroatory Medicine, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To obtain purified pneumococcal SP2108 protein, and analyse its conservatism in common ofstreptococcuspneumoniae. Its feasibility as a candidate vaccine was evaluated as well.Methods The full length SP2108 gene was amplified by PCR and then subcloned into the prokaryotic expression vector TF pCold. Recombinant protein SP2108 was expressed and purified from the host bacteria of BL21(DE3). C57BL/6 mice were immunized with purified protein to produce polyclonal antibodies. The antibody titers were determined by indirect ELISA. And then the polyclonal antibodies were used to analyze the expression and conservation of SP2108 in six different types ofS.pnstrains. The amino acid sequence conservation was analyzed by ClustalX2.1 software.Results The soluble form of SP2108 protein was successfully prepared. And specific polyclonal antibodies were obtained and were used to confirm the conservatism of SP2108 protein in 6 different strains ofS.pn. The conservative of SP2108 proteins among different types ofS.pnstrain was 100%.Conclusion SP2108 protein were successful expressed inE.coliand was purified. The protein is highly conserved,which may be a ideal candidate forS.pnvaccine.

Streptococcuspneumoniae; SP2108 protein; prokaryotic expression; conservation;C57BL/6 mice

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：81460317)；貴州省聯(lián)合基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合LH字[2014]7553)。

閔迅，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：病原微生物分子致病機(jī)制，E-mail:2815400619@qq.com。

R378.12

A

1000-2715(2016)04-0382-05