王　博，吳俊英,2，徐　超

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·基礎醫(yī)學·

CD137表達與慢性乙型肝炎患者肝臟免疫病理損傷程度的相關性研究

王博1，吳俊英1,2，徐超3

目的：探討CD137表達與慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者肝臟免疫病理損傷程度的相關性。方法：采用ELISA法檢測受試者外周血中CD137L的水平；免疫熒光法檢測肝組織中CD137的表達；Western blot法檢測肝組織中CD137和CD28蛋白水平表達；熒光定量PCR檢測肝組織中CD137和CD28 mRNA的表達。結果：重度CHB組患者血清CD137L的表達水平均明顯高于健康對照組、輕度和中度CHB組患者(P<0.01)。肝組織中CD28 mRNA在中度CHB組和重度CHB組患者的表達水平均較健康對照組及輕度CHB組患者明顯升高(P<0.01)。重度CHB組患者CD137 mRNA表達水平均較健康對照組、輕度CHB組和中度CHB組患者顯著升高(P<0.01)。肝組織中CD28蛋白在中度CHB組和重度CHB組患者的表達水平均較健康對照組及輕度CHB組患者明顯升高(P<0.01)。重度CHB組患者CD137蛋白表達水平均較健康對照組、輕度CHB組和中度CHB組患者中CD137蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)。結論：CD137的活化參與CHB患者肝組織免疫病理損傷過程，與其損傷程度有相關性。

慢性乙型肝炎;CD137;免疫病理損傷;肝損傷

我國是乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus,HBV)感染的高發(fā)區(qū)，其中慢性HBV感染攜帶者約1億例，慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者約2 000萬例[1-2]。CHB患者的肝臟損傷與機體的免疫調控息息相關，在此過程中眾多的調控因子和細胞參與其中，如共刺激分子、細胞因子、T細胞、自然殺傷細胞和樹突狀細胞等，但其具體機制如何，尚有待進一步研究[3-4]。T細胞活化后介導的免疫反應是HBV病毒清除和肝細胞損傷的主要機制[3]。T淋巴細胞活化需要雙信號，除了T細胞接受抗原提呈細胞提供的第一信號(抗原信號)外，共刺激分子結合為T細胞活化提供第二信號，如CD28/B7和CD137/CD137L等。已有研究表明CHB患者外周血中共刺激分子的表達變化與肝臟病理損傷程度有一定相關性[5]，然而對于其在人肝組織中表達情況的研究尚不充分。目前多通過檢測患者外周血淋巴細胞活化的方法來推測患者免疫狀態(tài)，指導臨床治療[6]。事實上，CHB患者肝組織中共刺激分子的表達情況可以更直觀地反映其與肝臟損傷程度的相關性。已有研究表明CD28在中度CHB組和重度CHB組肝組織中的表達水平明顯高于健康對照組[7]，但未進一步探討其他共刺激分子與肝臟免疫病理損傷程度是否有相關性。本研究探討CD137在肝組織中的表達及其與肝臟免疫病理損傷程度間的相關性并與CD28作比較。

1　材料與方法

1.1試劑及儀器兔抗人CD137、CD137L、CD28(北京博奧森生物技術有限公司)，F(xiàn)ITC標記的山羊抗兔熒光二抗(武漢三鷹生物技術有限公司)，hRP標記的羊抗兔二抗(上海碧云天生物技術有限公司)，TRIZOL試劑(美國Invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，7500型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2方法

1.2.1病例選擇病例取自2014年10月至2015年6月中國人民解放軍一二三醫(yī)院和蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院CHB住院患者60例，其中男46例，年齡20～59歲；女14例，年齡18～55歲。CHB的診斷按2010年中華醫(yī)學會肝病學分會和感染病學分會共同修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》標準，所有患者均不合并其他病毒性肝炎并排除酒精性肝病、藥物性肝病以及有自身免疫性疾病的患者。外周血的對照組標本來自于蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院體檢中心的健康體檢者，共30名；肝組織的對照組標本取自于蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院肝膽外科和急診外科，選取癌旁組織(>5 cm)或外傷所致肝破裂的患者，共10例。所有受試者年齡、性別等一般資料均具有可比性。

1.2.2病理學診斷經皮肝穿刺法取肝組織，進行病理學診斷，肝組織炎癥分級包括G0～G4五級，纖維化分期包括S0～S4五期，依據(jù)2000年西安全國病毒性肝炎及肝病學術會議的修訂標準[8]將CHB患者分為輕度CHB組14例、中度CHB組29例和重度CHB組17例。

1.2.3ELISA檢測外周血中CD137L表達水平于反應板微孔中加受試者血清100 μL，37 ℃孵育2 h，洗滌5次，每次3 min，加CD137L抗體100 μL，37 ℃孵育1 h，加入TMB顯色液顯色，在450 nm波長下比色，獲取吸光度值，與標準曲線比較得到CD137L濃度。

1.2.4免疫熒光檢測肝組織中CD137表達水平石蠟切片脫蠟，用0.1 mol/L、pH 6.0的枸櫞酸緩沖液進行抗原修復，3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，PBS洗滌3次，每次5 min，正常山羊血清封閉30 min，甩去血清，加CD137抗體孵育，4 ℃過夜，次日取出室溫平衡30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加FITC標記的二抗，37 ℃避光孵育2 h，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加DAPI，室溫15 min，PBS洗滌5次，每次5 min，甘油封片，用正置熒光顯微鏡顯微觀察并攝影。

1.2.5RT-PCR法檢測肝組織中CD28和CD137mRNA表達水平向1 mL玻璃勻漿器中加入收集到的肝組織和1 mL Trizol 提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，PCR反應體系為20 μL(SybrGreen mix 10 μL，ROX 0.4 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL，cDNA模版2.0 μL，ddH2O 6.4 μL)設定條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，再72 ℃平衡10 min，實驗獨立重復3次。所有基因引物由美國通用生物公司設計并合成，具體序列如下：CD28上游：5′-AGG CTC CTG CAC AGT GAC TA-3′，CD28下游：5′-GAG CGA TAG GCT GCG AAG-3′，產物長度107 bp。CD137上游：5′-TGC TTG TGA ATG GGA CGA AGG AGA-3′，CD137下游：5′-AGA AAC GGA GCG TGA GGA AGA ACA-3′，產物長度195 bp。GAPDh上游：5′-CAG CCT CAA GAT CAT CAG CA-3′；GAPDh下游：5′-TGT GGT CAT GAG TCC TTC CA-3′，產物長度106 bp。

1.2.6Western blot法檢測肝組織中CD28和CD137蛋白表達水平向1 mL玻璃勻漿器中加入收集到的肝組織和100 μL蛋白裂解液，研磨提取組織總蛋白，BCA法測蛋白濃度。95 ℃ 5 min后上樣，10%SDS-PAGE凝膠中電泳，再轉膜至PVDF膜上，封閉液封閉2 h。孵一抗4 ℃，過夜，TBS-Tween20緩沖液洗3×10 min，孵二抗37 ℃，2 h，TBS-Tween20緩沖液洗3×10 min。加曝光液在Bio-Rad凝膠成像儀上成像并分析。實驗獨立重復3次。

1.3統(tǒng)計學方法采用方差分析和q檢驗及多個樣本比較的秩和檢驗。

2　結果

2.1對照組和不同程度CHB患者血清中CD137L表達水平比較中度和重度組CHB患者血清CD137L表達水平均高于對照組(P<0.05和P<0.01)，重度組CHB患者血清CD137L表達水平亦明顯高于輕度和中度組(P<0.01)，而對照組和輕度組CHB患者血清CD137L表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)。

q檢驗：與對照組比較*P<0.05,**P<0.01；與輕度組比較△△P<0.01；與中度組比較##P<0.01

2.2對照組和不同程度CHB患者肝組織中CD28 mRNA和CD137 mRNA表達水平比較中度和重度組CHB患者肝組織中CD28 mRNA表達水平均明顯高于對照組及輕度組(P<0.01)。重度CHB組患者CD137 mRNA表達水平均較對照組、輕度CHB組和中度CHB組顯著升高(P<0.01)(見表2)。

表2對照組和不同程度CHB患者肝組織中CD28 mRNA和CD137 mRNA相對表達量比較

兩兩比較秩和檢驗：與對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與輕度組比較△P<0.05，△△P<0.01；與中度組比較##P<0.01

2.3對照組和不同程度CHB患者肝組織中CD28和CD137蛋白表達水平比較中度和重度組CHB患者肝組織中CD28蛋白表達水平均明顯高于對照組及輕度組(P<0.01)。重度CHB組患者CD137蛋白表達水平均顯著高于對照組、輕度CHB組和中度CHB組(P<0.01)(見圖1、表3)。免疫熒光檢測CD137蛋白在重度CHB患者肝組織中的表達(見圖2)。

q檢驗：與對照組比較**P<0.01；與輕度組比較△△P<0.01；與中度組比較##P<0.01

3　討論

HBV感染后對肝臟細胞造成的損害，并非由HBV自身直接所致，而是通過HBV誘導的T淋巴細胞活化后產生的細胞免疫所致[9]，因此，T細胞的活化在CHB患者疾病發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮了重要作用。T細胞的活化需要雙重信號刺激，第一信號為T細胞接受抗原提呈細胞提供的抗原信號，第二信號則為淋巴細胞表面的共刺激分子，如CD28/B7和CD137/CD137L等[10]。本研究將CD28和CD137兩種共刺激分子進行對比研究，探討它們與CHB患者肝臟病理損傷程度間的相關性。

本研究首先在CHB患者血清中檢測CD137L的表達，發(fā)現(xiàn)其在中度和重度CHB患者血清中的表達均高于健康對照組(P<0.05和P<0.01)，但在輕度CHB組，患者血清中CD137L的表達與健康對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與既往報道[11]一致。提示在患者因HBV感染發(fā)展成為CHB的過程中，共刺激分子CD137L在其中發(fā)揮了一定作用，但其具體機制，還需更多的研究探討。

在CHB患者的血清中檢測到CD137L的變化后，研究了肝組織中CD137的表達，發(fā)現(xiàn)重度CHB組CD137的表達明顯高于健康對照組(P<0.01)，但輕度CHB組和中度CHB組變化不明顯。此外，較之對照組，CD28在中度CHB組和重度CHB組中的表達也明顯增高(P<0.01)，但輕度CHB組變化不明顯，與既往研究[7]一致。推測CHB患者肝臟組織中CD28和CD137的表達增加可能與機體的免疫狀態(tài)有關，在HBV早期侵入時，機體對病毒的清除力不強，T細胞活化數(shù)目較少，肝組織病理改變也輕，共刺激信號分子的表達則弱。隨著疾病的進展，肝組織的病理改變加重，但對病毒的殺傷作用增強，活化的T細胞數(shù)目亦增加，此時共刺激分子CD28和CD137的表達也增高[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，中度CHB組和重度CHB組CD28表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但CD137在重度CHB組的表達則明顯高于中度CHB組(P<0.01)。這可能與二者在T細胞活化的不同時段發(fā)揮主要作用有關。雖然CD28和CD137同為第二信號，但CD28在靜止和活化的T細胞上都表達，而CD137主要表達于活化的T細胞上。在重度CHB患者的肝組織中，機體對病毒的清除能力強，病理改變較重，活化的T細胞數(shù)目也較多，此時CD137的升高會更加顯著。同時，由于CD28是T細胞活化時表達最早的共刺激分子，而CD137則在T細胞活化晚期發(fā)揮主要作用，且CD137既可提供協(xié)同CD28的共刺激信號，也可提供不依賴于CD28共刺激分子的第二信號[13-14]。因此，在CHB患者肝臟組織病理改變的重度期，提供第二信號，活化T細胞的過程中，CD137較CD28起到了更加重要的作用[15-16]。

由于CHB患者在做肝臟穿刺術前多已接受過治療，且因個體化差異治療效果不一，因此本研究中所得結果是否穩(wěn)定可靠，仍需大批量的標本證明。綜上所述，機體肝臟組織的免疫病理損傷程度加重，CD28和CD137的表達亦升高，重度時CD137的表達變化更加顯著，聯(lián)合檢測CD28和CD137能更準確地判斷肝組織病理損傷程度，同時，這也為CHB的免疫治療提供新思路。

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(本文編輯劉璐)

Relationship between the CD137 expression and immunopathological injury degree of liver in patients with chronic hepatitis B

WANG Bo1,WU Jun-ying1,2,XU Chao3

(1.LabofClinicalLaboratoryDiagnostics,BengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233030;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,BengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233030;3.DepartmentofInfectiousDiseases,The123rdHospitalofPLA,BengbuAnhui233000,China)

Objective:To investigate the correlation of the expression of CD137 and immunopathological injury degree of liver in patients with chronic hepatitis B(CHB).Methods:The levels of CD137 in peripheral blood and liver tissue were measured by ELISA and immunofluorescent assay,respectively.The levels of the protein and mRNA expressions of CD137 and CD28 in liver tissue were detected using Western blot and qPCR,respectively.Results:The level of serum CD137 in severe CHB group was significantly higher than that in healthy control group,mild and moderate CHB groups(P<0.01).The expression levels of CD28 mRNA in liver tissue in moderate and severe CHB groups were higher than that in healthy control group and mild CHB group(P<0.01).The expression level of CD137 mRNA in liver tissue in severe CHB group was significantly higher than that in healthy control group,mild and moderate CHB groups(P<0.01).The expression levels of CD28 protein in liver tissue in moderate and severe CHB groups were higher than that in healthy control group and mild CHB group(P<0.01).The expression level of CD137 protein in liver tissue in severe CHB group was higher than that in healthy control group,mild and moderate CHB groups(P<0.01).Conclusions:The activation of CD137 involves in the immunopathological injury process of liver in CHB patients,and is related to the degree of liver.

chronic hepatitis B;CD137; immunopathological injury；liver injury

2015-10-28

安徽省高校省級自然科學研究重點項目(KJ2012A195)；蚌埠醫(yī)學院研究生科研創(chuàng)新計劃(byycx1408)

單位] 蚌埠醫(yī)學院1.臨床檢驗診斷學實驗中心，2.醫(yī)學檢驗系,安徽 蚌埠 233030;3.中國人民解放軍第123醫(yī)院 傳染科,安徽 蚌埠 233000

[作者簡介] 王博(1989-)，男，碩士研究生.

吳俊英，碩士研究生導師，教授.E-mail：jywu@126.com

1000-2200(2016)09-1125-04

R 392.32

ADOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.09.002