向少偉，辛立紅，黃國東，賀西南，黃海燕，龍　韻

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院腎內(nèi)科，廣西 南寧 530011；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001）

論 著

腎炎康血清干預(yù)嘌呤霉素氨基核苷誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷研究

向少偉1，辛立紅2，黃國東1，賀西南1，黃海燕1，龍韻1

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院腎內(nèi)科，廣西 南寧 530011；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001）

目的：探討復(fù)方腎炎康對嘌呤霉素氨基核苷誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的保護作用。方法：原代培養(yǎng)大鼠足細(xì)胞，隨機分為正常組，對照組，腎炎康低、中、高劑量組，厄貝沙坦組除正常組外，其余各組分別予以嘌呤霉素氨基核苷，正常組加正常大鼠血清，腎炎康低、中、高劑量組分別加腎炎康低、中、高劑量，厄貝沙坦組加厄貝沙坦，均干預(yù)48h。用原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測細(xì)胞凋亡，實時定量PCR方法檢測P53、Caspase 3 mRNA，western印跡檢測細(xì)胞中P53、Caspase 3蛋白變化。結(jié)果：嘌呤霉素氨基核苷作用下的各組足細(xì)胞凋亡率、P53、Caspase 3mRNA及蛋白表達(dá)均顯著高于正常組（P＜0.05，P＜0.01），藥物干預(yù)的各組足細(xì)胞凋亡率、P53、Caspase 3 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著低于對照組（P＜0.05，P＜0.01），腎炎康高劑量組足細(xì)胞凋亡率、P53、Caspase 3 mRNA及蛋白表達(dá)與厄貝沙坦組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：中藥復(fù)方腎炎康能抑制嘌呤霉素氨基核苷誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，其機制可能與抑制P53、Caspase 3表達(dá)有關(guān)。

足細(xì)胞；凋亡；腎炎康；嘌呤霉素氨基核苷

足細(xì)胞是高度分化的細(xì)胞，是腎臟濾過屏障的關(guān)鍵元素，足細(xì)胞的損失在腎小球硬化和進(jìn)行性蛋白尿腎臟疾病的發(fā)病機制中起著重要作用［1］。嘌呤霉素氨基核苷能誘導(dǎo)腎病綜合征模型［2］，對足細(xì)胞具有顯著致凋亡作用［3］。我們利用嘌呤氨基核苷誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的體外損傷模型，觀察腎炎康血清對足細(xì)胞損傷的保護作用及其機制，總結(jié)如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物

6周齡SPF/VAF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供（合格證號SCXK桂 2003-0003）。

1.2主要試劑

TRIzol Reagent（美國Invitrogen），RNA的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄、SYBR Green mix（日本TOYOBO），TUNEL檢測試劑盒（美國Promega），DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco），兔抗大鼠P53抗體、Caspase 3抗體、大鼠多克隆β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（美國Sigma），ECL試劑盒（美國Santa Cruz）。

1.3實驗方法

大鼠足細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定［4］。無菌取腎后，通過差異過篩法迅速分離腎皮質(zhì)，收集200目篩網(wǎng)上腎小球進(jìn)行接種，37℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)7、8天后消化，消化后產(chǎn)物通過200目篩網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞傳代培養(yǎng)7d，采用倒置相差顯微鏡觀察足細(xì)胞形態(tài)及免疫熒光染色進(jìn)行鑒定，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞純度。

含藥血清的制備。中藥復(fù)方腎炎康由八仙草、田七、薏苡仁、鹿含草按3∶1∶2∶2比例組成。以蒸餾水煎煮3次，過濾、濃縮至含生藥2.5g/mL，高壓滅菌，置于4℃冰箱保存待用。將48只SD大鼠隨機分為正常組、對照組、腎炎康低、中、高劑量組和厄貝沙坦組，每組8只。正常組予以蒸餾水3mL灌胃，每日2次；其余各組分別予以氨基核苷嘌呤霉素5mg/100g（溶于蒸餾水3mL）、腎炎康成人臨床用藥劑量5倍（13.5g/kg）、10倍（27g/kg）、20倍（54g/kg）及厄貝沙坦片成人臨床用藥劑量10倍（25mg/kg），灌胃（均蒸餾水稀釋至3mL），每日2次，連續(xù)7天。末次灌胃2h后股動脈取血，離心取血清，56℃水浴30min滅活補體，無菌針孔濾器（0.22μm）過濾除菌，分別制成正常大鼠血清、氨基核苷嘌呤霉素血清、腎炎康低、中、高劑量血清和厄貝沙坦血清，分裝置入-20℃凍存。

足細(xì)胞的分組及處理。等量足細(xì)胞接種和生長，細(xì)胞用PBS洗滌2次，在含1%FCS培養(yǎng)24h。實驗分為6組：①正常組：正常大鼠血清；②對照組：氨基核苷嘌呤霉素血清加正常大鼠血清；③腎炎康低劑量組：氨基核苷嘌呤霉素血清加腎炎康低劑量血清；④腎炎康中劑量組：氨基核苷嘌呤霉素血清加腎炎康中劑量血清；⑤腎炎康高劑量組：氨基核苷嘌呤霉素血清、腎炎康高劑量血清；⑥厄貝沙坦組：氨基核苷嘌呤霉素血清加厄貝沙坦血清。每組設(shè)平行孔8孔，培養(yǎng)干預(yù)48h。

原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測細(xì)胞凋亡：用TUNEL檢測試劑盒檢測進(jìn)入凋亡晚期的足細(xì)胞。操作步驟按說明書進(jìn)行，熒光顯微鏡下細(xì)胞核綠色的為凋亡細(xì)胞。每張切片隨機選取5個視野（×400），計算凋亡指數(shù)（Apoptosis index，AI）：AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

實時定量PCR方法檢測P53、Caspase 3 mRNA水平。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物序列，見表1。反應(yīng)條件為94℃2min預(yù)變性，94℃30s、56℃30s、72℃30s，35個循環(huán)，最后72℃7min延伸。繪制動力學(xué)曲線，讀取Ct值，以GAPDH為內(nèi)參照，用2-△△Ct法計算目的基因表達(dá)量。目的基因量=2-△△Ct，△△Ct=實驗組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）-正常組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）。見表1。

表1　P53、Caspase 3、GAPDH引物序列Table1 Primer sequence of P53，Caspase 3 and GAPDH

western印跡檢測P53、Caspase 3蛋白表達(dá)。收集細(xì)胞，加入RIPA裂解緩沖液，置冰上30min，離心后取上清，Bradford法測定蛋白濃度。每樣品取30μg總蛋白，以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至尼龍膜，經(jīng)脫脂奶粉封閉1h，加入一抗，4℃孵育過夜，洗去一抗后，再加入相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光法膠片曝光并成像。用圖像分析軟件（UVI tec，英國）對X線片上雜交條帶進(jìn)行半定量分析，目的蛋白條帶與β-actin條帶的積分吸光度比值為最終結(jié)果。

2　結(jié)果

各組細(xì)胞凋亡率比較見表2。與正常組比較，嘌呤氨基核苷作用下各組足細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與對照組比較，藥物干預(yù)后的各組足細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與厄貝沙坦組比較，腎炎康中、高劑量組足細(xì)胞凋亡率無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2　各組足細(xì)胞凋亡率比較 （%，）

表2　各組足細(xì)胞凋亡率比較 （%，）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與厄貝沙坦組比較，##P＜0.01。

組別n凋亡率正常組84.28±1.33對照組817.36±3.45**腎炎康低劑量組814.02±2.64**△##腎炎康中劑量組812.03±2.32**△△腎炎康高劑量組88.86±2.32**△△厄貝沙坦組89.32±2.87**△△

各組足細(xì)胞P53 mRNA及蛋白的表達(dá)比較見表3。與正常組比較，嘌呤氨基核苷作用下的各組足細(xì)胞P53 mRNA及蛋白的表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與對照組比較，藥物干預(yù)后的各組足細(xì)胞P53 mRNA及蛋白的表達(dá)顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；與厄貝沙坦組比較，腎炎康高劑量組足細(xì)胞P53 mRNA及蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3　各組足細(xì)胞P53 mRNA及蛋白表達(dá)比較 （）

表3　各組足細(xì)胞P53 mRNA及蛋白表達(dá)比較 （）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與厄貝沙坦組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別nP53/ GAPDHP53/β-actin正常組81.000±0.0000.121±0.022對照組81.766±0.274**1.117±0.075**腎炎康低劑量組81.475±0.251**△##0.902±0.057**△△##腎炎康中劑量組81.401±0.227**△#0.741±0.062**△△##腎炎康高劑量組81.162±0.201*△△0.483±0.053**△△厄貝沙坦組81.143±0.182*△△0.506±0.057**△△

各組足細(xì)胞Caspase 3 mRNA及蛋白的表達(dá)比較見表4。與正常組比較，嘌呤氨基核苷作用下的各組足細(xì)胞Caspase 3 mRNA及蛋白的表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與對照組比較，藥物干預(yù)后的各組足細(xì)胞Caspase 3 mRNA及蛋白的表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與厄貝沙坦組比較，腎炎康高劑量組足細(xì)胞Caspase 3 mRNA及蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表4　各組足細(xì)胞Caspase 3mRNA及蛋白表達(dá)比較（）

表4　各組足細(xì)胞Caspase 3mRNA及蛋白表達(dá)比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與厄貝沙坦組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

?

3　討論

研究表明足細(xì)胞減少20%以下就出現(xiàn)系膜擴張、一過性蛋白尿；減少21%～40%，出現(xiàn)球囊粘連和局灶節(jié)段腎小球硬化，輕度持續(xù)性蛋白尿，腎功能正常；減少大于40%，出現(xiàn)節(jié)段性到全球性腎小球硬化，持續(xù)性大量蛋白尿，腎功能減退［5］。越來越多的證據(jù)表明，足細(xì)胞凋亡是足細(xì)胞數(shù)量下降的主要原因，并導(dǎo)致蛋白尿和腎小球損傷。人類p53基因是一種功能強大的抑癌基因，對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡起著關(guān)鍵性調(diào)控作用，p53可以通過上調(diào)Bax的表達(dá)水平和下調(diào)Bcl-2的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。高糖、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）等誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡均與P53活化有關(guān)［6-8］。半胱天科氨酸蛋白酶家族（Caspase）是一類與凋亡密切相關(guān)的蛋白水解酶家族，負(fù)責(zé)選擇性地切割某些蛋白質(zhì)，從而造成細(xì)胞凋亡。其中Caspase 3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用。研究表明，AngⅡ使體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞Caspase-3活性增加，從而誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡［9］。而AT1受體阻斷劑能抑制糖尿病腎病模型大鼠腎臟TGF-β1表達(dá)，進(jìn)而使細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)減少，從而減少足細(xì)胞凋亡［10］。我們的研究表明，嘌呤霉素氨基核苷誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，也與p53及Caspase-3活化有關(guān)，這與既往的研究一致［11-12］。

慢性腎臟病主要表現(xiàn)為水腫、蛋白尿、血尿等，反復(fù)發(fā)作，纏綿難愈，屬中醫(yī)“水腫”、“虛勞”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為本病除脾腎虧虛之外，濕熱病邪是關(guān)鍵?；蛞驖裥熬脩?，郁而化熱；或因素體陰虛內(nèi)熱，熱與濕合；或感染熱毒，與濕相合；或因藥邪（激素、抗生素等）所傷，助濕化熱。故有“腎炎濕熱論”之說［13］。而濕熱之邪易與瘀合，如濕邪久蘊，阻滯氣機、閉滯脈絡(luò)而成瘀；或濕熱煎液成瘀；或久病氣虛，血行不暢而成瘀。腎炎康湯主要含八仙草、三七、薏苡仁、鹿含草等。方中八仙草清濕熱、散瘀、消腫、解毒、利尿；三七有散瘀止血、消腫止痛、補血活血等功效；薏苡仁健脾利水滲濕；佐以鹿含草補虛益腎。全方以清熱利濕，活血化瘀為主，祛邪而不傷正，扶正而不留邪。本研究結(jié)果顯示，腎炎康含藥血清能顯著降低嘌呤氨基核苷誘導(dǎo)的大鼠足細(xì)胞凋亡率，抑制P53及Caspase 3合成，其高劑量組效果與厄貝沙坦相當(dāng)。據(jù)此我們推測，中藥復(fù)方腎炎康可能通過抑制P53及Caspase 3的表達(dá)，減少足細(xì)胞的凋亡，從而起到減輕腎損害的作用。

［1］ Brinkkoetter PT，Ising C，Benzing T.The role of the podocyte in albumin filtration［J］.Nat Rev Nephrol，2013，9（6）：328-336.

［2］ Aizawa K，Takeda S，Tashiro Y，et al.Renoprotection by continuous erythropoietin receptor activator in puromycin aminonucleosideinduced nephrotic syndrome［J］.Am J Nephrol，2012，36（5）：419-426.

［3］ Yu SY，Qi R.Role of bad in podocyte apoptosis induced by puromycin aminonucleoside［J］. Transplant Proc，2013，45（2）：569-573.

［4］ 賈苗，張益民，賴德源.大鼠足細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2010，32（23）：2565-2567.

［5］ Wharram BL，Goyal M，Wiggins JE，et al.Epub 2005 Aug 17.Podocyte depletion causes glomerulosclerosis： diphtheria toxin-induced podocyte depletion in rats expressing human diphtheria toxin receptor transgene［J］.J Am Soc Nephrol，2005，16（10）：2941-2952.

［6］ Gao F，Yao M，Shi Y，et al.Notch pathway is involved in high glucose-induced apoptosis in podocytes via Bcl-2 and p53 pathways［J］.J Cell Biochem，2013，114（5）：1029-1038.

［7］ Chen X，Ren Z，Liang W，et al.c-Abl mediates angiotensin II-induced apoptosis in podocytes［J］.J Mol Histol，2013，44（5）：597-608.

［8］ Shi S，Yu L，Zhang T，Qi H，et al.Smad2-dependent downregulation of miR-30 is required for TGF-β-induced apoptosis in podocytes［J］.PLoS One，2013，8（9）：e75572.

［9］ Yuan H1，Ren ZL，Hu FQ，et al.Renin induces apoptosis in podocytes through a receptor-mediated［J］.angiotensin II-independent mechanism，2012，344（6）：441-446.

［10］ Tundemir M，Oztürk M.The effects of angiotensin-II receptor blockers on podocyte damage and glomerular apoptosis in a rat model of experimental streptozotocin-induced diabetic nephropathy［J］.Acta Histochem，2011，113（8）：826-832.

［11］ Wada T，Pippin JW，Marshall CB，et al.Dexamethasone prevents podocyte apoptosis induced by puromycin aminonucleoside：role of p53 and Bcl-2-related family proteins［J］.J Am Soc Nephrol，2005，16（9）：2615-2625.

［12］ Li X，Zhang X，Li X，et al.The role of survivin in podocyte injury induced by puromycin aminonucleoside［J］.Int J Mol Sci，2014，15（4）：6657-6673.

［13］ 江燕，何偉明，余承惠.腎炎濕熱論［J］.四川中醫(yī)，2014，32（1）：53-54.

Objective：To investigate the protective effect of Compound ShenYanKang Granules，a Chinese herbal recipe mainly composed of Galium aparine，Panax notoginseng，Coicis Semen，Herba Pyrolae，on the podocyte injury induced by Puromycin amino nucleside. Method：The primary-cultured podocytes of rats were randomly divided into normal group，control group，low-dose，middle-dose， high-dose groups of ShenYanKang and irbesartan group. The podocytes in the normal group were given normal rat serum alone while that of the other groups were all given serum containing Puromycin amino nucleoside，and additionally，ShenYanKang groups and irbesartan group were given serum containing low-dose，middle-dose and highdose ShenYanKang and irbesartan respectively for 48 hours. The apoptosis of podocyte was determined by TUNEL assay. P53 and Caspase-3 mRNA were observed by real-time PCR. Expression of p53 and Caspase-3 protein were examined by Western blot. Result：The apoptosis rate of podocytes，P53 and Caspase 3 mRNA expression level in Puromycin amino nucleoside control group were significantly higher than that in the normal group（P＜0.05 or P＜0.01），and were decreased in the medication groups（P＜0.05 or P＜0.01 compared with that in Puromycin amino nucleoside control group）.The apoptosis rate of podocytes，P53 and Caspase 3 expression level in high-dose ShenYanKang group was not significantly different from that in irbesartan group（P＞0.05）.Conclusion： Compound ShenYanKang could inhibit the podocyte apoptosis induced by Puromycin amino nucleoside and its mechanism may be related to the inhibition of P53 and Caspase 3 expression.

Podocyte；Apoptosis；ShenYanKang；Puromycin amino nucleoside

R255.689.7

B

1004-2814（2016）02-0102-03

2015-10-13

廣西壯族自治區(qū)教育廳項目（編號：200810LX078）