黃　毅,雷傳文,宋　航,楊智芹,袁小紅,賀新生

(1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽 621010;2.四川大學化學工程學院，四川成都 610065)

?

高速逆流色譜法用于縱條紋炭角菌中過氧麥角甾醇的分離純化

黃毅1,2,雷傳文1,宋航2,楊智芹1,袁小紅1,賀新生1

(1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽 621010;2.四川大學化學工程學院，四川成都 610065)

過氧麥角甾醇生物活性多樣,具有較大開發(fā)價值,但傳統(tǒng)柱色譜分離手段步驟多效率低,本文建立了高速逆流色譜從縱條紋炭角菌中高效快速制備過氧麥角甾醇的方法。通過高效薄層色譜和高效液相色譜測定分配系數(shù),再利用高速逆流色譜考查了多個溶劑體系的分離效果,確定最佳溶劑體系為:正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(體積比為3∶1∶2∶0.8)。以上相為固定相,下相為流動相,轉速為800 r/min(正轉),流速為2 mL/min,檢測波長為220 nm。制備所得過氧麥角甾醇經(jīng)13C-NMR和1H-NMR鑒定,并經(jīng)高效液相色譜分析純度達到96.05%(峰面積歸一化法)。經(jīng)DPPH體外抗氧化活性測試,發(fā)現(xiàn)該化合物在0.2 mg/mL時,對DPPH自由基清除為28.36%,遠低于陽性對照抗壞血酸(93.41%),且量價關系也不明顯,表明其DPPH自由基清除能力較弱。該方法制備過氧麥角甾醇簡便、快速,所得產(chǎn)物純度高,可用于縱條紋炭角菌中該化合物的分離。

過氧麥角甾醇,高速逆流色譜,縱條紋炭角菌,抗氧化活性

縱條紋炭角菌(XylariastriataPat. 1887),屬子囊菌門(Ascomycota),盤菌亞門(Pezizomycotina),糞殼菌綱(Sordariomycetes),炭角菌亞綱(Xylariomycetidae),炭角菌目(Xylariales),炭角菌科(Xylariaceae),炭角菌屬(XylariaHillex Schrank),原始標本采自中國南京的棕櫚樹(Trachycarpusfortunei)樹干上[1]。文獻報道同屬的黑柄炭角菌具有改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)、造血、抗前列腺增生以及提高機體免疫等功能[2],目前已有醫(yī)藥產(chǎn)品開發(fā)成功并上市銷售。化學成分研究也發(fā)現(xiàn)同屬多種炭角菌中具有各種活性小分子[3-8]。本課題組于2012年在四川省綿陽市重新發(fā)現(xiàn)該種后便開始對該菌展開系統(tǒng)性研究,先期完成了培養(yǎng)優(yōu)化工作[9-11]。在后續(xù)化合物分離工作中,筆者發(fā)現(xiàn)該菌含有較多的真菌標識型化合物麥角甾醇,在HPLC跟蹤比對過程中發(fā)現(xiàn)了麥角甾醇的氧化物-過氧麥角甾醇(如圖1所示)也有較高含量。

圖1　過氧麥角甾醇結構式Fig.1　The structural formula of ergosterol peroxide

過氧麥角甾醇(CAS:2061-64-5,C28H44O3)結構比較特殊,在5,8位有過氧橋鍵,具有免疫抑制、抗炎、抗病毒、抗腫瘤和殺錐蟲等多種生理活性[12-16],具有較大開發(fā)價值。該化合物傳統(tǒng)獲取手段主要是柱色譜法,該法固相吸附嚴重,步驟多效率低。近年來迅速發(fā)展的高速逆流色譜(High-speed counter-current chromatography,簡稱HSCCC)技術,因其液-液分配機制,無固相載體,具有了分離效率高、樣品回收率高、適用范圍廣,可一步大劑量制備純品的優(yōu)點,在生物醫(yī)藥、天然產(chǎn)物化學和食品等領域應用愈發(fā)豐富。為了尋找簡單,高效的過氧麥角甾醇大量制備方法,本研究在參考麥角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇等化合物高速逆流色譜分離方法的基礎上,建立了縱條紋炭角菌中該化合物的高速逆色譜分離純化法,并測試了純化的單體化合物過氧麥角甾醇的體外抗氧化活性。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

縱條紋炭角菌子實體,由西南科技大學微生物實驗室提供,培養(yǎng)方法見文獻[9]。經(jīng)自然風干并于50 ℃烘干后,粉碎過100目篩備用。

TBE-300C高速逆流色譜儀(柱體積300 mL,進樣環(huán)體積20 mL)和TBP5002型雙柱塞中壓恒流泵上海同田生物技術有限公司;UV2000D逆流色譜專用紫外檢測器上海三為科學儀器有限公司;1260型高效液相色譜儀,Zorbax Eclipse XDB C-18分析柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)美國安捷倫科技公司;LX-300型冷卻水循環(huán)機北京長流科學儀器公司;R-210旋轉蒸發(fā)儀瑞士步琪公司;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;Bruker 600 MHz核磁共振儀美國布魯克科技有限公司。

高速逆流色譜用分析純乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正己烷等成都科龍化試有限公司;高效液相色譜用色譜純甲醇美國Fisher公司。高效薄層色譜GF254硅膠板煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司;過氧麥角甾醇標準品(純度96.0%)云南西力生物技術股份有限公司;水為實驗室制超純水(電阻率為18 MΩ·cm)。

1.2實驗方法

1.2.1標樣及樣品制備對照品溶液制備:精密稱取過氧麥角甾醇對照品5.0 mg,置于10 mL棕色容量瓶中,加甲醇溶解并定容即得對照品溶液(0.5 mg/mL),置于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆?可穩(wěn)定放置2周。

樣品制備:38 g子實體粉末,按固液比5∶1加入無水乙醇避光冷浸提取5次,每次24 h,濾液合并后經(jīng)55 ℃減壓旋干得黑色醇提浸膏1.71 g。

1.2.2分配系數(shù)測定及分離條件篩選將各種備選溶劑按比例配好,靜止分層后,用已經(jīng)分配平衡的下相溶解少量樣品,過濾除去不溶物,加入等體積的上相,劇烈振搖后靜置,待上相與下相分層后,對兩相溶劑中的過氧麥角甾醇含量進行測定,即可計算分配系數(shù)K=CS/CM(CS-目標成分在固定相中的濃度,CM-目標成分在流動相中的濃度)。

實驗中采用高效薄層色譜(HPTLC)和高效液相色譜(HPLC)兩種方式進行含量測定。HPTLC方法:微量進樣針定量點樣,展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=5∶1,凝鉬酸顯色并拍照,使用ImageJ比色軟件進行色度比較,色度深淺代表濃度;HPLC方法參見文獻[17]中麥角甾醇的方法且略作修改:色譜柱為Zorbax Eclipse XDB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為純甲醇,流速1 mL/min,檢測波長220 nm,柱溫25 ℃。

1.2.3固相保留率的測定對篩選出的分離體系還需進行固相保留率評價,方法是以850 r/min的轉速正向旋轉已被上相充滿管路的主機,同時以10 mL/min的流速往分離管路內泵入流動相,當主機出柱口管路流出流動相后,螺旋柱內固定相和流動相達到動力學平衡,此時量出被流動相推出的上相體積(V出),按以下公式計算固相保留率,保留率≥50%的溶劑體系方可在分離中使用。

式中:V總-管路總體積,V出-流動相推出上相體積,V環(huán)-進樣環(huán)的體積。

1.2.4高速逆流色譜分離樣品確定優(yōu)選體系后,首先按體積比配制溶劑,分液漏斗中低溫(4 ℃)靜止過夜后分離上下相。上相(固定相)和下相(流動相)均超聲波脫氣處理20 min。高速逆流色譜儀開機恒溫預熱15min后，先將固定相以10mL/min恒速度泵滿螺旋管柱，開啟速度控制器，使高速逆流色譜儀螺旋管柱按順時針方向旋轉并達到800 r /min，再以2 mL/min 泵入流動相，待流動相流出分離柱時，六通閥進樣品(樣品需由固定相∶流動相=1∶1比例溶液超聲溶解并經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾),同時開啟檢測器,以220 nm波長進行檢測,根據(jù)出峰情況進行收集。

表1　HSCCC分離過氧麥角甾醇的5種溶劑系統(tǒng)

1.2.5過氧麥角甾醇DPPH自由基清除測定現(xiàn)有體外抗氧活性評測方法中,DPPH法穩(wěn)定性好,靈敏度高且簡便快捷[18],因此本文采用DPPH自由基清除法評價過氧麥角甾醇抗氧化活性。參照Marsdens Blois的文獻[19],以無水乙醇為溶劑,將過氧麥角甾醇單體化合物配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的樣品溶液。分別取2 mL樣品溶液,加入2.0 mL 0.05 mg/mL的DPPH無水乙醇溶液。混勻后室溫避光放置30 min,以無水乙醇為參比,分別測定其在517 nm處的吸光度值,抗壞血酸(維生素C)作為陽性對照,計算過氧麥角甾醇對DPPH自由基的清除能力,計算公式為DPPH自由基清除率(%)=(A空白-A樣品)/A空白×100,式中A空白代表未加樣品的DPPH溶液的吸光度值,A樣品代表加入樣品反應后的樣品的DPPH溶液的吸光度值,實驗平行進行3次,取平均值。

2　結果與分析

2.1HSCCC分離體系的篩選

樣品成分的分配系數(shù)K值和螺旋管柱中固定相的保留值是分離系統(tǒng)篩選的兩個關鍵因素。K值應該在0.5～2,固定相保留率需大于50%。文獻[20]曾報道分離麥角甾醇使用含水體系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(體積比為6∶1.7∶6∶0.3)體系獲得滿意效果,因過氧麥角甾醇在HPLC反相色譜上早于麥角甾醇出峰,極性大于麥角甾醇,因此推測使用含水體系應該可行。基于以上預實驗和推斷,筆者考察了表1中5種溶劑體系。

由上表可知,溶劑體系①分配系數(shù)太大,分離將非常耗時。溶劑體系②分配系數(shù)適宜,但保留率較低(45%),且分離時過氧麥角甾醇與其他雜質的分離度較低,該法雖與文獻[21]報道一致,但卻無法適用本研究所述樣品,說明不同的樣品中化合物種類不同,相同分離條件可能不適用。溶劑體系③分配系數(shù)合適,分離效果也不錯,固定相保留率達到了63%,是個不錯的候選體系。通過將溶劑體系③中的甲醇換為乙醇后,在實驗中發(fā)現(xiàn)溶劑體系④和⑤均有較高的固定相保留率(≥75%),且隨著體系中乙酸乙酯含量的減少,分配系數(shù)逐漸增大。對于溶劑體系⑤,HPLC測定分配系數(shù)為1.28,固定相保留率達到82%,且分離度較好,最終確定采用正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(體積比為3∶1∶2∶0.8)溶劑體系分離樣品。實驗中同時對比了HPLC和HPTLC測定的分配系數(shù)K值,發(fā)現(xiàn)兩者相關性很好,說明在分配系數(shù)測試時,HPTLC可替代HPLC。

2.2過氧麥角甾醇的HSCCC的分離

根據(jù)2.1中篩選出的溶劑體系,按照1.2.4所述方法進行分離。將500 mg樣品超聲溶解于20 mL等體積上下相中,進樣進行HSCCC分離,得到高速逆流色譜分離圖2a,根據(jù)HPLC檢測結果收集流份A(保留時間為134 min),旋干回收再次用旋干品重復該分離流程,得到高速逆流色譜分離圖2b,截取流份B部分合并旋干,最終得到過氧麥角甾醇34 mg。

圖2　HSCCC分離色譜圖Fig.2　The separation chromatogram of HSCCC注：a為第一次分離,b為A流份回收后第二次分離。

2.3HSCCC分離成分的純度檢測及鑒定

參照1.2.2中HPLC法對制備得到的樣品進行純度分析,出峰時間與標準品一致,采用峰面積歸一化法,計算分離得到的過氧麥角甾醇純度為96.05%(圖3)。并通過13C-NMR和1H-NMR檢測得到數(shù)據(jù)如下:13C-NMR(CDCl3,125 MHz):δ135.5(CH,C-6),135.3(CH,C-22),132.3(CH,C-23),130.8(CH,C-7),82.3(C,COOC),79.5(C,COOC),66.4(CH,C-3),56.3(CH,C-17),51.6(CH,C-14),51.2(CH,C-9),44.7(C,C-13),42.7(CH,C-24),39.7(CH,C-20),39.3(CH2,C-12),36.9(C,C-10,and CH2,C-4),34.7(CH2,C-1),33.0(CH,C-25),30.1(CH2,C-2),28.6(CH2,C-16),23.3(CH2,C-15),20.8(CH3,C-21),20.6(CH2,C-11),19.9(CH3,C-26),19.6(CH3,C-27),18.1(CH3,C-19),17.5(CH3,C-28),12.8(CH3,C-18)。1H-NMR(CDCl3,600 MHz):δ0.72(3H,s,H-18),0.78(3H,d,J=6.5 Hz,H-26),0.82(3H,d,J=6.5 Hz,H-27),0.85(3H,s,H-19),0.87(3H,d,J=6.7 Hz,H-28),0.96(3H,d,J=6.7Hz,H-21),3.94(1H,m,H-3),5.12(1H,dd,J=8.1,15.1 Hz,H-22),5.17(1H,dd,J=7.7,15.1 Hz,H-23),6.22(1H,d,J=8.1 Hz,H-7),6.47(1H,d,J=8.3 Hz,H-6)。數(shù)據(jù)和文獻[22]報道一致,確定該化合物為過氧麥角甾醇。

表2　過氧麥角甾醇,抗壞血酸的DPPH自由基抗氧化能力

注:±代表三次實驗平均值范圍。

圖3　過氧麥角甾醇HPLC檢測結果圖Fig.3　The chromatogram of ergosterol peroxide

2.4過氧麥角甾醇DPPH自由基清除能力

由表2可知,相比抗壞血酸,過氧麥角甾醇的自由基清除能力不強,伴隨著溶液濃度的增加,其對 DPPH 自由基的清除能力并未見明顯提高,量效關系也不明顯,這可能和它整體結構中羥基占比較少有關,因此,基本可判斷該化合物DPPH自由基清除能力較弱。

3　結論與討論

高速逆流色譜法已廣泛用于各種天然產(chǎn)物的分離,其設備模塊包括高速逆流色譜主機,分配系數(shù)K值測定用高效液相色譜兩個主要設備。本文嘗試了HPTLC+拍照+ImageJ比色軟件比對計算分配系數(shù)的方案,發(fā)現(xiàn)其與HPLC測定數(shù)值非常相近,鑒于薄層色譜的展開劑、檢測方法多樣性,以及快捷和廉價性的特點,利用薄層掃描搭配HSCCC不失為一種重要的替代方案,只要規(guī)范操作細節(jié),一定有較大的應用空間。

實驗中還調查了轉速,流動相流速和柱溫對分離效果的影響,得出最優(yōu)分離條件是 2 mL/min 流速,800 r/min 轉速,柱溫為 25 ℃。在正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(3∶1∶2∶0.8)四元溶劑體系系統(tǒng)上,通過兩次操作可實現(xiàn)縱條紋炭角菌乙醇提物中過氧麥角甾醇的快速分離,方法相比柱色譜法簡便且無樣品吸附損失,效率更高,可以作為一種新的分離純化方法,在真菌及其代謝產(chǎn)物的生物活性物質制備中推廣應用。

由于真菌種類及生活環(huán)境分布廣泛,其次生代謝產(chǎn)物非常多樣,其中不乏價值巨大的化合物。且相對于植物,真菌因其可發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn),實際開發(fā)應用價值可能更巨大。因此真菌發(fā)酵搭配HSCCC可能成為高價值次生代謝產(chǎn)物的重要工業(yè)化生產(chǎn)手段。伴隨著HSCCC的大型化設備和配套的逐漸成熟,該方向可能成為天然產(chǎn)物生產(chǎn)的重要途徑。

[1]賀新生. 四川盆地蕈菌圖志[M]. 北京:科學出版社,2011:52-57.

[2]馬橙,翁榕安,張平,等. 黑柄炭角菌的研究進展[J]. 菌物研究,2009,7(1):59-62.

[3]吳根福. 黑柄炭角菌產(chǎn)生的DPPH自由基捕捉成分[J]. 微生物學報,2001,41(3):363-366.

[4]龔慶芳,武守華,譚寧華,等. 黑柄炭角菌發(fā)酵菌絲中抗氧化及抗腫瘤活性的有效成分研究[J]. 食品科技,2008,33(12):28-31.

[5]龔慶芳,張玉梅,譚寧華,等. 黑柄炭角菌發(fā)酵菌絲體的化學成分研究[J]. 中國中藥雜志,2008,33(11):1269-1272.

[6]麻兵繼,阮元,劉吉開,等. 長柄炭角菌子實體化學成分研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2008,20(1):63-65.

[7]楊小龍,劉吉開,羅都強,等. 黑柄炭角菌的化學成分[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2011,23(5):846-849.

[8]王興娜,黃午陽,劉吉開,等. 大炭角菌子實體化學成分的研究[J]. 中草藥,2012,43(12):2327-2332.

[9]馬貝貝,霍存錄,賀新生,等. 縱條紋炭角菌子實體培養(yǎng)[J]. 食品與發(fā)酵科技,2013,49(2):44-47.

[10]馮望,吳穎,尤雅,等. 縱條紋炭角菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學,2014(10):90-94.

[11]劉霞,高聰,鐘雨婷,等. 縱條紋炭角菌菌絲體液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 中藥材,2014,37(8):1317-1321.

[12]Yasukawa K,Akihisa T,Kanno H,et al. Inhibitory effects of sterols isolated from Chlorella vulgaris on 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced inflammation and tumor promotion in mouse skin[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin,1996,19(4):573-576.

[13]Lindequist U,Lesnau A,Teuscher E,et al. Antiviral activity of ergosterol peroxide[J]. Pharmazie,1989,44(8):579-80.

[14]Nakanishi T,Murata H,Inatomi Y,et al. Screening of anti-HIV-1 activity of North American plants. Anti-HIV-1 activities of plant extracts,and active components of Lethalia vulpina(L.)Hue[J]. Journal of Natural Medicines,1998,52:521-26.

[15]Bok J W,Lermer L,Chilton J,et al. Antitumor sterols from the mycelia of Cordyceps sinensis[J]. Phytochemistry,1999,51(7):891-98.

[16]Ramos-Ligonio A,López-Monteon A,Trigos á,et al. Trypanocidal Activity of Ergosterol Peroxide from Pleurotus ostreatus[J]. Phytotherapy Research,2012,26(6):938-943.

[17]張萍,肖新月,黃瑋,等. RP-HPLC-UV法測定5種發(fā)酵蟲草制劑中麥角甾醇的含量[J]. 藥物分析雜志,2010,31(2):258-260.

[18]Krystyna Pryzynska,Anna Pekal. Application of free radical diphenylpicrylhydrazyl(DPPH)to estimate the antioxidant capacity of food samples[J]. Analytical Methods,2013,5(17):4288-4295.

[19]Marsdens Blois. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical[J]. Nature,1958,181:1199-1200.

[20]章能勝,王金彬,汪小艷,等. 高速逆流色譜法從蝙蝠蛾擬青霉中快速分離制備麥角甾醇純品[J]. 色譜,2011,28(1):68-72.

[21]章能勝,王金彬,胡豐林,等. 玫煙色擬青霉中過氧麥角甾醇的高速逆流色譜法分離純化及質譜分析[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2009(6):14-17.

[22]Andreas Schinkovitz,Aman Kaur,Ernst Urban,et al. Cytotoxic Constituents from Lobaria scrobiculata and a Comparison of Two Bioassays for Their Evaluation[J]. Journal of natural product,2014,77(4):1069-73.

Isolation and purification of ergosterol peroxide fromXylariaStriataby high-speed counter-current chromatography

HUANG Yi1,2,LEI Chuan-wen1,SONG Hang2,YANG Zhi-qin1,YUAN Xiao-hong1,HE Xin-sheng1

(1.School of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China; 2.Department of Pharmaceutical and Biological Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

Due to the various bio-activities,Ergosterol peroxide presents great application value. The column chromatography is the most commonly methods used in separation of this compound. However,sample loss caused by irreversible adsorption is very uneconomical and biggest challenges in industrial application. In present work,an effective and rapid high-speed counter-current chromatography(HSCCC)method for isolating and purifying ergosterol peroxide fromXylariaStriatahas been developed. After using HPTLC and HPLC to determinate the partition coefficient,the isolation efficiency of different solvent systems was observed. The result showed that the solvent system composed of n-hexane,ethyl acetate,ethanol and water(3∶1∶2∶0.8,v∶v∶v∶v)was the best,the lower phase was used as the mobile phase and performed at a flow rate of 2 mL/min,while the apparatus rotated at 800 r/min,and detected at 220 nm. The prepared ergosterol peroxide was identified by13C-NMR and1H-NMR. Its purity was 96.05% analyzed by high performance liquid chromatography. And the antioxidant potential of ergosterol peroxide was also investigated by the method of DPPH radical scavenging activity. Results revealed that ergosterol peroxide showed weaker DPPH radical scavenging activity(28.36%)at the concentration of 0.2 mg/mL compared with standard compound ascorbic acid(93.41%). The dose dependent was not observed also explained its weak DPPH radical scavenging activity. The established method was quite simple,fast,and suitable for the large-scale isolation and separation of ergosterol peroxide fromXylariaStriata.

Ergosterol peroxide;high-speed counter-current chromatography;XylariaStriata;antioxidant potential

2016-03-18

黃毅(1979-)，男，博士，講師，研究方向：真菌天然產(chǎn)物開發(fā)，E-mail:huangyi@swust.edu.cn。

國家自然科學基金(21272189)；四川省苗子工程項目(2015RZ0015)；西南科技大學創(chuàng)新基金(CX14-041)；西南科技大學研究生創(chuàng)新基金(15ycx090)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)17-0262-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.043