徐　敏,趙　莉，杜金城,于上富,丁秀云,霍貴成

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

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益生菌混合物通過抑制NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗?jié)冃越Y(jié)腸炎功效的研究

徐敏,趙莉，杜金城,于上富,丁秀云,霍貴成*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

本文從NF-κB信號(hào)通路出發(fā),探討益生菌混合物對(duì)人工誘發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的治療作用,為治療人類腸炎提供一種安全可靠的方法。給予潰瘍性結(jié)腸炎小鼠一定劑量的益生菌混合物,通過Western-blotting、ELISA實(shí)驗(yàn)法,分別測(cè)定小鼠組織及血清中關(guān)鍵標(biāo)志物中的表達(dá)水平。結(jié)果表明:與腸炎空白組小鼠相比,益生菌聯(lián)合療法使UC小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低(p<0.05),并降低NF-κB的蛋白表達(dá),增加IκB的蛋白表達(dá)。益生菌混合物通過抑制NF-κB信號(hào)通路的活化從而發(fā)揮抗?jié)冃越Y(jié)腸炎功效,益生菌混合物抑制了NF-κB與IκB的分離,阻塞游離的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核,從而無法調(diào)控IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子的表達(dá),最終抑制機(jī)體過度的活化。益生菌混合物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎具有較好的治療作用,具有應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)的潛力。

潰瘍性結(jié)腸炎,益生菌,NF-κB信號(hào)通路

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種病理漫長(zhǎng)、反復(fù)發(fā)作的炎癥性疾病,其臨床表現(xiàn)為腹瀉,黏液膿血便,腹痛,里急后重等,多呈反復(fù)發(fā)作的慢性病程[1-2]。目前潰瘍性結(jié)腸炎的病因與發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚,以往研究主要集中于遺傳易感性和免疫異常等方面。最近有研究顯示,宿主腸道菌群改變、代謝表型改變以及NF-κB信號(hào)通路失調(diào)很可能是導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素。

研究表明,許多益生菌具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)胃腸道消化以及預(yù)防治療結(jié)腸癌等功效[3-4]。它們可與有害菌通過競(jìng)爭(zhēng)位點(diǎn)的方式調(diào)節(jié)腸道菌群平衡;同時(shí),益生乳酸菌還能產(chǎn)生抑菌物質(zhì),從而抑制有害菌的增殖。植物乳桿菌可以通過上調(diào)IFN-γ,并且促進(jìn)Th1型 CD4細(xì)胞分化來增強(qiáng)宿體免疫力從而發(fā)揮抗腫瘤功效[5],而且其可通過抑制NF-κB信號(hào)通路可以發(fā)揮抗炎癥功效,這種功效在不同年齡段的小鼠中差異顯著[6]。值得關(guān)注的是,植物乳桿菌能改善不同年齡段人群的腸道健康,然而該功效與益生菌的攝入量和在胃腸道的定植相關(guān)[7]。此外,嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌以及雙歧桿菌等也在增強(qiáng)健康小鼠的腸道黏膜免疫方面發(fā)揮了一定的作用,而且混合菌的效果更為明顯[8]。

在團(tuán)隊(duì)之前的研究中,王婷婷、周晶等人已篩選出的瑞士乳桿菌KLDS 10010、嗜酸乳桿菌KLDS 20010、植物乳桿菌KLDS 00170,并證實(shí)了三株菌株的耐胃酸、耐腸液及耐膽鹽能力,而且,瑞士乳桿菌KLDS 10010、嗜酸乳桿菌KLDS 20010、植物乳桿菌KLDS 00170單一菌株存在抗腸炎的潛能,但單菌的作用效果與前人的研究存在一定差距[9-10]。因此,本文將瑞士乳桿菌KLDS 10010、嗜酸乳桿菌KLDS 20010、植物乳桿菌KLDS 00170三種菌株混合,對(duì)人工潰瘍性結(jié)腸炎小鼠進(jìn)行灌胃,從小鼠病理學(xué)狀態(tài),免疫學(xué)狀態(tài)等角度探討益生菌聯(lián)合療法對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的治療作用,旨在探尋一種新型的治療人類潰瘍性結(jié)腸炎的方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

瑞士乳桿菌KLDS 10010、嗜酸乳桿菌KLDS 20010、植物乳桿菌KLDS 00170乳品工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微生物保藏中心。

BALB/c小鼠北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;IL-1β提取試劑盒,IL-6試劑盒,TNF-α試劑盒武漢博士德生物科技有限公司;NF-κB、IκB多克隆抗體三塔生物公司;甲醛溶液天津博迪化工股份有限公司。

電子顯微鏡Motic公司;注射器江蘇治宇醫(yī)療器械有限公司;液氮罐成都金鳳液氮容器有限公司;眼科解剖盒沈陽市久鳴鋁制品廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1益生菌混合物的制備測(cè)定瑞士乳桿菌KLDS 10010、嗜酸乳桿菌KLDS 20010、植物乳桿菌KLDS 00170的生長(zhǎng)曲線,選取穩(wěn)定期初作為取菌時(shí)間點(diǎn),并且采用梯度平板計(jì)數(shù)法對(duì)三株菌到達(dá)穩(wěn)定期初時(shí)的菌數(shù)進(jìn)行計(jì)量。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對(duì)UC小鼠的灌胃量為3×108CFU/20 g(混合菌數(shù)/小鼠體重)時(shí),具有較好的抗?jié)冃越Y(jié)腸炎潛力;按照1∶1∶1,則每只潰瘍性結(jié)腸炎小鼠對(duì)三株菌的需求量均為1×108CFU,根據(jù)平板計(jì)數(shù)結(jié)果,則瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌應(yīng)分別取瑞士乳桿菌菌液0.96 mL,嗜酸乳桿菌菌液0.5 mL,植物乳桿菌菌液0.19 mL時(shí),三株菌穩(wěn)定期初時(shí)的菌數(shù)為1×108CFU;然后離心取菌泥,分別重置于0.1 mL PBS中,4 ℃冰箱保存,用時(shí)震蕩混合,用于每只小鼠的灌胃劑量。

1.2.2動(dòng)物模型的建立將64只BALB/c雌鼠隨機(jī)分成4組,I完全空白組(20只)、Ⅱ腸炎空白組(20只)、Ⅲ SASP組(12只)和Ⅳ益生菌組(12只)。將3%葡聚糖硫酸鈉(DSS)溶于水瓶中,讓Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組小鼠自由飲用7 d,以誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型,然后第8 d,分別解剖完全空白組、腸炎空白組小鼠8只;然后以小鼠表觀狀況、病理學(xué)等為指標(biāo),驗(yàn)證小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型是否建立成功。其中,I完全空白組小鼠飲用滅菌蒸餾水。

1.2.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下:Ⅰ完全空白組(20只):正常飲食,無特殊處理;II腸炎空白組(20只):建模后,按照0.3 mL PBS/只進(jìn)行灌胃,灌胃持續(xù)4周,灌胃頻率1次/2 d;Ⅲ SASP組(12只):DSS造模后,按照0.0092 g SASP溶液/0.3 mL PBS/只進(jìn)行灌胃,灌胃持續(xù)4周,灌胃頻率1次/2天;Ⅳ益生菌組(12只):造模后,按照3×108CFU/0.3 mL PBS/只進(jìn)行灌胃,灌胃持續(xù)4周,灌胃頻率1次/2天。灌胃期間每天記錄小鼠體重、糞便性狀、毛發(fā)情況、隱血等[11];灌胃結(jié)束后,每組分別處死小鼠8只,摘眼球取血,并取小鼠結(jié)腸組織;并對(duì)小鼠結(jié)腸組織行HE染色,記錄病理學(xué)指標(biāo)圖片;每組剩余的小鼠進(jìn)行后續(xù)觀察,2周后同上進(jìn)行處理。本研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖如圖1。

圖1　實(shí)驗(yàn)方案Fig.1　The experimental design in this study

1.2.4小鼠病理學(xué)狀況的觀測(cè)灌胃結(jié)束后,各組隨機(jī)選取待解剖小鼠,對(duì)其腹腔注射20%氨基甲酸乙酯麻醉(6 mL/kg),固定于解剖臺(tái)上,眼球取血分離血清,脫頸處死小鼠,然后沿腹部正中切口,將結(jié)腸從盲腸、直腸中間剪開,快速剖取結(jié)腸,沿著腸系膜剪開,取出肛門至盲腸末端的整個(gè)結(jié)腸和直腸段,并于結(jié)腸末端(距肛門1 cm)處剪取0.5 cm長(zhǎng)的結(jié)腸,福爾馬林浸泡,行HE染色以做病理檢查[12]。

1.2.5小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量的測(cè)定灌胃結(jié)束后,各組隨機(jī)選取待解剖小鼠,對(duì)其腹腔注射20%氨基甲酸乙酯麻醉(6 mL/kg),固定于解剖臺(tái)上,眼球取血,室溫自然凝固1 h后,離心,取血清,待所有樣品收集完后分別用細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)ELISA試劑盒檢測(cè)[13]。

1.2.6小鼠結(jié)腸NF-κB、IκB蛋白的表達(dá)本研究直接測(cè)定與NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)的兩種蛋白,NF-κB、IκB的蛋白表達(dá)情況,從兩種蛋白表達(dá)的角度出發(fā),間接研究益生菌混合物對(duì)機(jī)體炎性情況的改變[14]。灌胃結(jié)束后,各組隨機(jī)選取待解剖小鼠,對(duì)其腹腔注射20%氨基甲酸乙酯麻醉(6 mL/kg),固定于解剖臺(tái)上,眼球取血后,取結(jié)腸組織,液氮速凍后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存,然后用Western-blotting進(jìn)行檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,兩兩比較采用Duncan法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Mean±SD表示,p<0.05為差異有顯著性意義。

2　結(jié)果與討論

2.1潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型的驗(yàn)證

建模后腸炎空白組小鼠表觀狀態(tài)不佳,具體表現(xiàn)在小鼠目光呆滯、毛發(fā)暗沉卷曲,有羌毛現(xiàn)象,見圖2a;并且,腸炎空白組小鼠尾根處有血斑,說明小鼠有顯性便血現(xiàn)象,見圖2b;由HE染色圖(見圖2c)可知,腸炎空白組相對(duì)于完全空白組HE染色圖,小鼠結(jié)腸組織,腸黏膜萎縮,黏膜表面鈍化,隱窩破壞,結(jié)構(gòu)不完整,急性潰瘍性結(jié)腸炎模型建立成功,可進(jìn)行下一步治療實(shí)驗(yàn)。

圖2　潰瘍性結(jié)腸炎小鼠癥狀Fig.2　Clinical symptoms of UC mice

2.2益生菌對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠病理學(xué)的影響

為期4周的混合益生菌治療后,解剖小鼠,取其結(jié)腸組織,進(jìn)行蘇木素-伊紅染色(HE染色),腸炎空白組、益生菌組、SASP組、完全空白組的病理見圖3。

圖3　小鼠HE染色圖Fig.3　The HE staining picture of different groups mice注：a為腸炎空白組小鼠,b為益生菌組小鼠,c為SASP組小鼠,d為完全空白組小鼠,×4倍。

由圖3可知,腸炎空白組小鼠,腸黏膜萎縮,黏膜表面鈍化,隱窩破壞,基本處于腸黏膜屏障失衡狀態(tài)(3-a);經(jīng)過兩個(gè)療程的益生菌混合療法治療之后,益生菌組小鼠腸黏膜細(xì)胞排列基本整齊,腸黏膜結(jié)構(gòu)完整,無組織壞死現(xiàn)象(3-b),說明三株益生菌聯(lián)合可以很好的修復(fù)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的腸黏膜損傷;并且與SASP組、完全空白組小鼠HE染色圖相比,無明顯的差異,說明三株益生菌聯(lián)合具有很好的抗?jié)冃越Y(jié)腸炎作用。

2.3益生菌對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子水平的影響

UC與炎性細(xì)胞水平密切相關(guān)。當(dāng)機(jī)體受到外界刺激(如脂多糖、IL-1β、IL-6、TNF-α)時(shí),NF-κB會(huì)與IκB分離,游離的NF-κB將進(jìn)入細(xì)胞核,從而調(diào)控IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子的表達(dá),從而活化機(jī)體NF-κB信號(hào)通路,迫使機(jī)體處于持續(xù)的活化狀態(tài),過多的炎性細(xì)胞因子會(huì)引起機(jī)體炎癥,從而導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎等炎癥性疾病[15]。因此,選取IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子為指標(biāo),研究益生菌混合物對(duì)人工潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的作用。用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)細(xì)胞因子反應(yīng)板的OD值。在平行標(biāo)準(zhǔn)品OD值中選取一組線性相關(guān)性較大的點(diǎn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。根據(jù)細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出灌胃結(jié)束后小鼠血清細(xì)胞因子水平含量表見表1。

表1　灌胃結(jié)束后小鼠血清細(xì)胞因子水平(X±SD)

注:單位為pg/mL;各組均與腸炎空白組進(jìn)行顯著性分析,顯著水平p<0.05。

由表1可知,從IL-1β角度來看,腸炎空白組小鼠血清中IL-1β含量相對(duì)于其他組,其含量顯著較高,可能是由于患潰瘍性結(jié)腸炎,促使機(jī)體持續(xù)活化,從而促進(jìn)IL-1β的高度表達(dá);而經(jīng)過混合益生菌的聯(lián)合治療,使?jié)冃越Y(jié)腸炎小鼠血清中IL-1β含量顯著降低,并于SASP組小鼠此種細(xì)胞因子含量無顯著的差異,說明混合益生菌可以顯著降低機(jī)體細(xì)胞因子IL-1β的水平。從IL-6角度來看,腸炎空白組小鼠血清細(xì)胞因子IL-6的水平與益生菌組、SASP組及完全空白組細(xì)胞因子水平有顯著差異,說明益生菌及SASP處理均可以降低機(jī)體此種細(xì)胞因子水平,其中,益生菌組小鼠與SASP組小鼠此種細(xì)胞因子水平差異不顯著,說明益生菌聯(lián)合能達(dá)到市面上傳統(tǒng)治療潰瘍性結(jié)腸炎的方法。從TNF-α角度來看,腸炎空白組小鼠血清TNF-α水平較高,經(jīng)過2個(gè)療程的治療之后,益生菌組及SASP組小鼠血清TNF-α水平顯著降低,說明3株益生菌聯(lián)合療法可顯著降低血清炎性因子水平。表明,小鼠機(jī)體在受到造模物質(zhì)——葡聚糖硫酸鈉鹽(DSS)刺激后會(huì)產(chǎn)生一定的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng),分泌大量的細(xì)胞因子,但是隨著益生菌的灌胃處理,小鼠腸道NF-κB信號(hào)免疫機(jī)制遭到破壞,抑制了相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)及翻譯過程[16]。

2.4益生菌對(duì)小鼠NF-κB信號(hào)通路兩種關(guān)鍵蛋白表達(dá)情況的影響

不同組小鼠進(jìn)行為期4周的不同療法治療后,利用Western-blotting分析檢測(cè)結(jié)腸內(nèi)NF-κB p65,IκB蛋白的表達(dá)情況。如圖4所示,發(fā)現(xiàn)腸炎空白組小鼠腸道的NF-κB p65蛋白表達(dá)量較高,而IκB的表達(dá)較低;經(jīng)過對(duì)UC小鼠兩個(gè)療程的益生菌混合治療后,發(fā)現(xiàn)小鼠腸道的NF-κB p65蛋白表達(dá)量顯著降低,而IκB的表達(dá)顯著增高。人工模型UC小鼠結(jié)腸組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)量較高,而IκB的表達(dá)較低,說明過多游離的NF-κB p65進(jìn)入細(xì)胞核參與細(xì)胞因子的調(diào)控,從而引起機(jī)體的持續(xù)炎癥反應(yīng);而經(jīng)過對(duì)UC小鼠兩個(gè)療程的益生菌混合治療后,小鼠腸道的NF-κB p65蛋白表達(dá)量顯著降低,而IκB的表達(dá)顯著增高,說明3株益生菌可以抑制NF-κB p65與IκB的分離,從而,游離的NF-κB p65蛋白表達(dá)量顯著降低;益生菌混合物通過抑制NF-κB免疫信號(hào)通路來發(fā)揮抗?jié)冃越Y(jié)腸炎能力。

圖4　不同組小鼠結(jié)腸蛋白Western-blotting表達(dá)情況Fig.4　Western-blotting of colon from different group mice were analyzed注；A代表腸炎空白組,B代表正常空白組,D代表益生菌組,E代表SASP組。

3　結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)建立潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型,以小鼠病理學(xué)狀態(tài)及免疫學(xué)狀態(tài)為指標(biāo),研究3株益生菌聯(lián)合對(duì)人工潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的作用,得出3株益生菌可顯著改善UC小鼠的病理學(xué)損傷,并通過抑制NF-κB信號(hào)通路來降低小鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)。潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制多認(rèn)為與環(huán)境因素、遺傳因素、免疫因素等有關(guān),最近的研究熱點(diǎn)多認(rèn)為,潰瘍性結(jié)腸炎與NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)。當(dāng)機(jī)體受到外界刺激(如脂多糖、IL-1β、IL-6、TNF-α)時(shí),NF-κB會(huì)與IκB分離,游離的NF-κB將進(jìn)入細(xì)胞核,從而調(diào)控IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子的表達(dá),從而活化機(jī)體NF-κB信號(hào)通路,迫使機(jī)體處于持續(xù)的活化狀態(tài),過多的炎性細(xì)胞因子會(huì)引起機(jī)體炎癥,從而導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎等炎癥性疾病[17],這與我們的研究結(jié)果一致。3株益生菌聯(lián)合療法發(fā)揮作用的機(jī)制可能是因?yàn)?一方面,益生菌細(xì)胞壁可能存在某種活性成分,可能通過抑制NF-κB與IκB分離,從而阻止游離的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核,無法調(diào)控細(xì)胞因子的表達(dá),抑制機(jī)體NF-κB信號(hào)通路的持續(xù)活化,從而起到抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的功效[18],如圖5,這也與本文中得到結(jié)論一致,人工模型UC小鼠結(jié)腸組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)量較高,而IκB的表達(dá)較低,過多游離的NF-κB p65進(jìn)入細(xì)胞核參與細(xì)胞因子的調(diào)控,從而引起機(jī)體的持續(xù)炎癥反應(yīng),經(jīng)過對(duì)UC小鼠兩個(gè)療程的益生菌混合治療后,發(fā)現(xiàn)小鼠腸道的NF-κB p65蛋白表達(dá)量顯著降低,而IκB的表達(dá)顯著增高,說明3株益生菌可以抑制NF-κB p65與IκB的分離,從而,游離的NF-κB p65蛋白表達(dá)量顯著降低;另一方面3株益生菌可能競(jìng)爭(zhēng)UC小鼠致病菌的位點(diǎn),從而平衡腸道菌群,來發(fā)揮抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的功效[19]。

圖5　益生菌株對(duì) NF-κB信號(hào)通路的影響Fig.5　Effects of probiotics strains on NF-κB signaling pathway

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Anti-colitis effect of probiotics mixture by the restrain of the NF-κB signaling pathway

XU Min,ZHAO Li,DU Jin-cheng,YU Shang-fu,DING Xiu-yun,HUO Gui-cheng*

(Northeast Agriculture University,Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Harbin 150030,China)

Based on the NF-Kappa B signaling pathway,the effect of probiotic mixture on the artificial ulcerative colitis mice was investigated,which provided a safe and reliable way for the treatment of human gastrointestinal Inflammation.Ulcerative colitis mice were provided with some probiotic mixture,and expression of crucial marker were determined by Western-blotting and ELISA tests. Results showed that the serum levels of IL-6,IL-1βand TNF-αwere significantly decreased(p<0.05),and that the protein expression of NF-κB was decreased and the protein expression of IκB was increased,in the probiotics group. Oral administration ofL.plantarum、L.acidophilusandL.helveticussuppressed NF-κB signaling pathway and had the anti-colitis effects. In detail,the probiotics inhibited the dissociation of NF-κB from IKB-α,blocking the translocation of NF-κB into the nucleus,down-regulated expression levels of the cytokine gene and suppressed the over-activation of the mice. Thus,probiotic mixture had good effect on the ulcerative colitis and had the potential to be applied into the clinical medicine.

Ulcerative colitis;Probiotic;NF-κB signaling pathway

2016-03-16

徐敏(1991-),女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail:15104595049@126.com。

霍貴成(1958-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物與生物技術(shù)，E-mail:gchuo058@126.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31401512);國(guó)家863項(xiàng)目(2011AA100902)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)17-0348-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.060