顏　輝,蔡　豪,賈俊強(qiáng),江明珠,吳瓊英

(江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212018)

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超聲酶解制備牡丹籽降血糖肽的響應(yīng)面優(yōu)化研究

顏輝,蔡豪,賈俊強(qiáng),江明珠,吳瓊英

(江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212018)

為獲得一種新型的降血糖肽,應(yīng)用超聲輔助酶法制備牡丹籽蛋白源降血糖肽,并通過(guò)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化。對(duì)酶解的7個(gè)因素進(jìn)行篩選,確定5個(gè)主要因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化。最優(yōu)工藝參數(shù)為:溫度37.3 ℃,時(shí)間21.68 min,超聲波功率60.52 W(體積600 cm3),pH8.01,加酶量10202 U/g,2%蛋白濃度,超聲波頻率28 kHz,此條件下實(shí)際抑制率達(dá)到40.25%;比相同條件未使用超聲的抑制率提高了14.9%。本研究不僅為超聲輔助加速制備牡丹籽降血糖肽的研究和實(shí)際應(yīng)用提供基礎(chǔ),也為牡丹籽蛋白的綜合利用提供新的方向。

超聲波,牡丹籽蛋白,α-葡萄糖苷酶抑制率,酶解反應(yīng),響應(yīng)面法

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一種內(nèi)分泌代謝疾病,慢性高血糖是其主要發(fā)病癥狀。長(zhǎng)期高血糖可引起高血壓、血管硬化等并發(fā)癥,進(jìn)而導(dǎo)致心、腦、腎等重要器官的病變,嚴(yán)重者威脅生命[1]。目前,大部分糖尿病患者為Ⅱ型糖尿病,其中α-葡萄糖苷酶抑制劑是最具臨床價(jià)值的降血糖藥物[2]。α-葡萄糖苷酶抑制劑能夠與小腸中的α-葡萄糖苷酶的中心活性部位結(jié)合,阻抑酶活性的發(fā)揮,阻滯雙糖水解為單糖,吸收時(shí)間后延,從而降低餐后血糖水平。

有學(xué)者研究表明,多肽可以作為一類α-葡萄糖苷酶抑制劑,如山杏、絲素、雜色蛤、蠶繭、蛋清、乳清、魷魚肝臟蛋白等蛋白,經(jīng)過(guò)酶解,多肽均有抑制α-葡萄糖苷酶活性,有輔助降低血糖的作用[3-9]。上述蛋白存在成本較高、常規(guī)酶解速率慢的缺陷,酶解過(guò)程需要一到兩個(gè)小時(shí)甚至更長(zhǎng)時(shí)間[3-9],難以滿足大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)需要,因此,如何低成本且快速獲得多肽是一項(xiàng)亟待解決的問(wèn)題。

2011年牡丹油被批準(zhǔn)成為我國(guó)新型的食用油,油料牡丹的種植面積逐年上升,2015年已達(dá)200萬(wàn)畝以上[10],榨油后牡丹籽蛋白將成為一種新型的廉價(jià)蛋白原料。

超聲波這種綠色的加工技術(shù),與常規(guī)條件相比具有效率高、設(shè)備要求低、減少酶解反應(yīng)時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)[11-12]。吳進(jìn)菊、張輝、李芳等[13-15]都對(duì)超聲波輔助酶解蛋白制備肽進(jìn)行了研究,超聲波有提高酶解速率和肽產(chǎn)量的作用。

本實(shí)驗(yàn)以牡丹籽蛋白作為原料,采用超聲波輔助酶解反應(yīng)制備降血糖肽,并應(yīng)用響應(yīng)面進(jìn)行工藝優(yōu)化,以期獲得一種高活性牡丹籽降血糖肽及其高效制備方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

ICR小鼠購(gòu)自江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證編號(hào):NO.201600100)。

實(shí)驗(yàn)材料與試劑:牡丹籽購(gòu)自山東牡丹科技園;對(duì)硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司;胰蛋白酶購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-9600紫外可見分光光度計(jì)北京北分瑞利分析儀器公司;GYZ-Y3格亞小型家用榨油機(jī)合肥格亞機(jī)械自動(dòng)化有限公司;自制超聲波反應(yīng)器。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1牡丹籽蛋白的制備牡丹籽65 ℃烘干12 h,剝殼,65 ℃烘干8 h,GYZ-Y3格亞榨油機(jī)轉(zhuǎn)速63 r/min、熱榨模式進(jìn)行榨油。牡丹籽粕粉碎后與蒸餾水1∶10混均,1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9.5,50 ℃超聲水浴2 h,3800 r/min離心15 min,所得沉淀重復(fù)提兩次,合并所得溶液,2 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.5,3800 r/min離心20 min,沉淀冷凍干燥。

1.2.2鼠源α-葡萄糖苷酶制備脫臼處死小鼠,用0 ℃生理鹽水洗去雜物,液氮研磨。將pH6.8濃度為0.05 mol/L的PBS與研磨粉混合,按照體積質(zhì)量比10∶1配比,渦旋提取60 s,4 ℃8000 r/min離心15 min,取上清。

1.2.3檢測(cè)方法酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線與酶活力的測(cè)定參照周景祥[16]文章中的方法;α-葡萄糖苷酶抑制率測(cè)定參照Hyun[6]的方法,有改動(dòng)。

配制5 mg/mL pNPG溶液、0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)、0.5 mol/L碳酸鈉溶液,在試管中依次加入磷酸緩沖液、樣品、α-葡萄糖苷酶液和pNPG溶液,反應(yīng)體系如表1所示:

表1　α-葡萄糖苷酶抑制率檢測(cè)體系組成

混合均勻,水浴37 ℃反應(yīng)15 min,加入2 mL碳酸鈉溶液終止反應(yīng),405 nm處檢測(cè)吸光值。抑制率計(jì)算公式如下:

抑制率(%)=[A0-(A-A2)]/(A0-A1)×100

其中A0、A、A1、A2分別為控制組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、背景組對(duì)應(yīng)吸光值。

1.2.4單因素條件的篩選以α-葡萄糖苷酶抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo),在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選用胰蛋白酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn),設(shè)定超聲波體積為600 cm3,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.1加酶量對(duì)抑制率的影響 固定底物濃度2%，溫度37 ℃，時(shí)間20 min，pH8.0，超聲波頻率28 kHz，超聲波功率60 W，考察不同加酶量(2500、5000、7500、10000、12500、15000 U/g)對(duì)抑制率的影響。

1.2.4.2底物濃度對(duì)抑制率的影響固定加酶量7500 U/g，溫度37 ℃，時(shí)間20 min，pH8.0，超聲波頻率28 kHz，超聲波功率60 W，考察不同底物濃度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%)對(duì)抑制率的影響。

1.2.4.3溫度對(duì)抑制率的影響 固定加酶量7500 U/g，底物濃度2%，時(shí)間20 min，pH8.0，超聲波頻率28 kHz，超聲波功率60 W，考察不同溫度(31、34、37、40、43 ℃)對(duì)抑制率的影響。

1.2.4.4時(shí)間對(duì)抑制率的影響固定加酶量7500 U/g，底物濃度2%，溫度37 ℃，pH8.0，超聲波頻率28 kHz，超聲波功率60 W，考察不同時(shí)間(0、10、20、30、40、50、60 min)對(duì)抑制率的影響。

1.2.4.5pH對(duì)抑制率的影響固定加酶量7500 U/g，底物濃度2%，溫度37 ℃，時(shí)間20 min，超聲波頻率28 kHz，超聲波功率60 W，考察不同pH(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)對(duì)抑制率的影響。

1.2.4.6超聲波頻率對(duì)抑制率的影響固定加酶量7500 U/g，底物濃度2%，溫度37 ℃，時(shí)間20 min，pH8.0，超聲波功率60 W，考察不同超聲波頻率(22、28、35、40 kHz,)對(duì)抑制率的影響。

1.2.4.7超聲波功率對(duì)抑制率的影響固定加酶量7500 U/g，底物濃度2%，溫度37 ℃，時(shí)間20 min，pH8.0，超聲波頻率28 kHz，考察不同超聲波功率(30、60、90、120、150 W)對(duì)抑制率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì),并根據(jù)響應(yīng)值進(jìn)行分析。所采集樣品經(jīng)沸水滅酶10 min,8000 r/min離心15 min取上清液檢測(cè)抑制率。

1.2.5響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取加酶量(A)、時(shí)間(B)、溫度(C)、pH(D)和超聲功率(E)這5個(gè)因素,進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),如表2所示:

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素和水平編碼

1.2.6數(shù)據(jù)分析響應(yīng)面模型的建立與數(shù)據(jù)分析通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行計(jì)算和分析處理。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1不同酶解時(shí)間檢測(cè)其對(duì)鼠源性α-葡萄糖苷酶的抑制效果,如圖1。

圖1　不同酶解時(shí)間對(duì)抑制率的影響Fig.1　The influence of enzymatic hydrolysis time on inhibition rate

在0～20 min內(nèi),抑制率顯著上升,20 min之后抑制率略有下降,這可能是繼續(xù)水解切成無(wú)活性小肽[4-5,9,18],也可能是超聲處理影響了胰蛋白酶酶活力,導(dǎo)致抑制率的變化[11],因此選擇20 min作為實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)點(diǎn)。

2.1.2不同底物濃度檢測(cè)結(jié)果如圖2。底物濃度在0.5%～2%時(shí),隨著蛋白濃度增大,抑制率逐漸上升,2%～3.5%,盡管濃度增加,但抑制率增加極少。在蛋白質(zhì)濃度較低時(shí),隨著蛋白濃度增加,抑制活性的產(chǎn)物多肽也在增多;蛋白濃度進(jìn)一步增大,酶分子的活性中心逐漸被飽和[5,9,17],因此抑制率上升緩慢?？紤]到更加經(jīng)濟(jì)因素,選擇2%的濃度進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

圖2　不同底物濃度對(duì)抑制率的影響Fig.2　The influence of substrate concentration on inhibition rate

圖3　不同加酶量對(duì)抑制率的影響Fig.3　The influence of enzyme amount on inhibition rate

圖4　不同pH對(duì)抑制率的影響Fig.4　The influence of pH on inhibition rate

圖5　不同溫度對(duì)抑制率的影響Fig.5　The influence of temperature on inhibition rate

圖6　不同頻率對(duì)抑制率的影響Fig.6　The influence of frequency on inhibition rate

圖7　不同功率對(duì)抑制率的影響Fig.7　The influence of power on inhibition rate

2.1.3不同加酶量加酶量在2500～10000 U/g范圍內(nèi),加酶量增多,抑制率一直顯著上升,超過(guò)10000 U/g之后,抑制率有所下降。底物濃度不變時(shí),酶分子增多,酶解加快,抑制活性產(chǎn)物增多;隨著加酶量進(jìn)一步增加,酶分子達(dá)到過(guò)飽和,只有部分酶能與蛋白結(jié)合反應(yīng),導(dǎo)致抑制率上升緩慢[5,9,17]。因此選擇10000 U/g作為最優(yōu)加酶量。

2.1.4不同pHpH在6.0～8.0之內(nèi),抑制率一直上升,大于pH8.0,抑制率呈下降趨勢(shì);pH較低或者較高時(shí)都會(huì)影響其空間結(jié)構(gòu)[18],導(dǎo)致酶解的效果不佳[5,9],抑制率下降,這表明胰蛋白酶的最適pH在8.0左右。因此選擇pH8.0作為最優(yōu)pH。

2.1.5不同溫度溫度在31～37 ℃之內(nèi),抑制率一直不斷上升,37 ℃達(dá)到頂點(diǎn),超過(guò)37 ℃抑制率呈下降趨勢(shì),表明溫度低于或者高于最適溫度抑制率均會(huì)降低[5,9,18],因此選擇37 ℃作為最優(yōu)溫度。

2.1.6不同頻率頻率在22～28 kHz之內(nèi),抑制率顯著上升,28 kHz之后,抑制率呈下降趨勢(shì),不同頻率超聲波對(duì)胰蛋白酶活力影響導(dǎo)致[18],由于超聲波振子頻率特殊因素,選擇28 kHz進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2.1.7不同功率功率在30～60 W之內(nèi),抑制率一直顯著上升,大于60 W,抑制率呈下降趨勢(shì);表明低功率的超聲促進(jìn)酶解進(jìn)行,導(dǎo)致抑制率的增高[11],可能是酶分子的結(jié)構(gòu)遭到高能量強(qiáng)度的超聲波破壞,影響了酶的活性,進(jìn)而導(dǎo)致抑制率下降,這是不同的功率對(duì)酶活性的影響導(dǎo)致抑制率的變化[11,19],因此選擇60 W作為最優(yōu)功率。

2.2響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果在表2中的水平編碼之下,響應(yīng)面設(shè)計(jì)和結(jié)果見表3:

表3　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

2.2.2模型方差分析回歸模型方差分析結(jié)果與回歸方程系數(shù)見表4:

表4　回歸方程模型方差分析表

Y(%)=39.03+1.04A+6.13B+6.65C+0.44D+5.31E-2.36AB-8.08AC-7.86AE-9.74BC-3.72BD-9.88BE-8.74CD-13.29CE+44.71DE-4.33A2-6.65B2-10.54C2-11.05D2-8.1E2-51.97ABC

由表4方差分析可知,一次項(xiàng)中B、C、E極其顯著,交互項(xiàng)與平方項(xiàng)中各項(xiàng)均顯著,各因素重要程度為[20-21]:C(溫度)>B(時(shí)間)>E(功率)>A(加酶量)>D(pH)。

2.2.3響應(yīng)面分析根據(jù)回歸方程,各因素之間交互作用的影響,如圖8所示:

圖8　各因素交互作用對(duì)抑制率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.8　The various interactive effects on inhibition rate of response surface plots注:a.加酶量與時(shí)間,b.加酶量與溫度,c.加酶量與功率,d.時(shí)間與溫度,e.時(shí)間與功率,f.溫度與功率。

由圖8可以直觀的看出各因素交互作用對(duì)抑制率的影響,曲線密集或陡峭程度越高則表明對(duì)結(jié)果響應(yīng)值得影響越大[22-23]。在本文選定的實(shí)驗(yàn)條件參數(shù)范圍內(nèi),由圖8a可知,沿著時(shí)間方向等高線比加酶量方向等高線更加密集陡峭,時(shí)間對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響要遠(yuǎn)大于加酶量對(duì)其的影響;圖8b中可以看出沿著溫度方向等高線比沿著加酶量方向更加密集,坡度也更加陡峭,溫度對(duì)抑制率的影響要遠(yuǎn)比加酶量大;圖8c中沿著功率方向等高線要比沿加酶量密集,功率對(duì)抑制率的影響高于加酶量對(duì)其的影響;圖8d中沿著溫度方向等高線比時(shí)間更加密集,溫度對(duì)抑制率的影響要比時(shí)間更大,圖8e中時(shí)間方向等高線比功率更加密集,時(shí)間比功率影響更加顯著;圖8f中溫度方向等高線比功率密集,溫度比功率影響更加顯著。

2.2.4最優(yōu)工藝與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)單因素與響應(yīng)曲面分析得出酶解牡丹籽蛋白最優(yōu)工藝條件:溫度37.3 ℃,21.68 min,60.52 W(體積600 cm3),pH8.01,加酶量10202 U/g,2%蛋白濃度,28 kHz,在此條件預(yù)測(cè)抑制率達(dá)到40.18%。為驗(yàn)證模型可靠性,進(jìn)行3次驗(yàn)證,測(cè)得抑制率為40.25%,與預(yù)測(cè)值基本一致,數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)用性。

2.2.5結(jié)果討論本研究使用超聲波輔助酶解的方法制備牡丹籽降血糖肽。普通酶解在溫度37.3 ℃,pH8.01,加酶量10202 U/g,底物濃度2%條件下,40 min才到達(dá)最佳抑制率,抑制率僅為25.35%,相較而言,超聲波輔助酶解的抑制率提高14.9%,這可能是超聲波輔助酶解過(guò)程對(duì)蛋白質(zhì)、酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生了影響導(dǎo)致的[11-15,18-19],研究結(jié)果與林洮等[19]對(duì)超聲波促進(jìn)酶解反應(yīng)的研究結(jié)果一致。王晟等[3]通過(guò)對(duì)木瓜蛋白酶制得山杏蛋白降血糖肽的研究,該肽對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制;本文中牡丹籽降血糖肽的抑制類型有待以后研究。

因此,使用超聲波輔助酶解,不僅提高了產(chǎn)量,也縮短了反應(yīng)時(shí)間,達(dá)到了預(yù)期目的。不僅為Ⅱ型糖尿病患者提供了新型降血糖藥物,而且為牡丹籽蛋白的高效化利用提供了新的方向,具有較高的實(shí)用前景與價(jià)值。

3　結(jié)論

本研究采用超聲波輔助胰蛋白酶的技術(shù)手段制備牡丹籽降血糖肽,通過(guò)超聲波提高酶解反應(yīng)速率以及目標(biāo)產(chǎn)物得率,相較正常酶解,時(shí)間縮短為原來(lái)的1/2,α-葡萄糖苷酶抑制率卻是原來(lái)的2倍以上;因此,超聲波明顯促進(jìn)多肽的制備效果,在實(shí)際生產(chǎn)中極具應(yīng)用價(jià)值。

在本實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)對(duì)超聲波頻率、功率、底物濃度、溫度、時(shí)間、pH、加酶量的單因素篩選和響應(yīng)面優(yōu)化。最終確定最佳工藝參數(shù)為:溫度37.3 ℃,21.68 min,60.52 W(體積600 cm3),pH8.01,加酶量10202 U/g,2%蛋白濃度,28 kHz,在此條件實(shí)際抑制率達(dá)到40.25%。

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Optimization of ultrasonic-assisted enzymatic preparation of peony seed hypoglycemic polypeptide by response surface methodology

YAN Hui,CAI Hao,JIA Jun-qiang,JIANG Ming-zhu,WU Qiong-ying

(School of biotechnology,Jiangsu University of Science and Technology,Zhenjiang 212018,China)

In order to get a new type of hypoglycemic peptide,ultrasonic-assisted enzymatic was used to prepare peony seed hypoglycemic peptide,and the process was optimized by one-factor and response surface experiments. Five factors were determined to be optimized by the response surface methodology from the seven factors of enzymolysis. The optimal process parameters were temperature of 37.3 ℃,time of 21.68 min,power of 60.52 W(volume of 600 cm3),pH8.01,enzyme of 10202 U/g,protein concentration of 2%,frequency of 28 kHz,and the actual inhibition rate was 40.25% under this condition,which was increased by 14.9% compared with the no ultrasonic condition. This study not only provided basis for ultrasonic assisted preparation of peony seeds hypoglycemic peptide,but also gave a new utilization direction of peony seed protein.

ultrasonic;peony seed protein;α-glycosidase inhibition rate;enzymatic hydrolysis reaction;response surface methodology

2016-02-26

顏輝(1971- )，男，博士，副教授，研究方向：生物制藥，E-mail:yanh1006@163.com。

市重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃-產(chǎn)業(yè)前瞻與共性關(guān)鍵技術(shù)(GY2015006)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)17-0220-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.035