霍建華， 馬愛群， 郭雪艷， 強(qiáng) 華， 劉 平， 白 玲

(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710061； 2陜西省人民醫(yī)院消化科; *通訊作者,E-mail:maaiqun@medmail.com.cn)

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綠色熒光蛋白基因與hERG基因G604S突變共表達(dá)功能研究

霍建華， 馬愛群， 郭雪艷， 強(qiáng) 華， 劉 平， 白 玲

(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710061；2陜西省人民醫(yī)院消化科;*通訊作者,E-mail:maaiqun@medmail.com.cn)

目的 觀察增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因與hERG(human ether-a-go-go-related gene)基因融合后是否影響hERG通道的電生理特性。 方法 HEK293細(xì)胞分別被轉(zhuǎn)入pcDNA3-WT-hERG和/或pcDNA3-G604S-hERG，pEGFP-WT-hERG和/或pEGFP-G604S-hERG。激光共聚焦觀察hERG通道蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位；膜片鉗實(shí)驗記錄hERG電流。 結(jié)果 在轉(zhuǎn)染pcDNA3-WT-hERG或pEGFP-WT-hERG的細(xì)胞中，hERG蛋白表達(dá)于胞質(zhì)與胞膜；在轉(zhuǎn)染pcDNA3-G604S-hERG或pEGFP-G604S-hERG的細(xì)胞中，hERG蛋白僅在胞質(zhì)表達(dá)。HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3-WT-hERG后，hERG電流的最大尾電流密度為(75.4±2.2)pA/pF，明顯高于轉(zhuǎn)染pEGFP-WT-hERG的最大尾電流密度[(15.1±0.7)pA/pF，P<0.05]。共轉(zhuǎn)染pcDNA3-WT-hERG與pcDNA3-G604S-hERG的最大hERG尾電流密度明顯高于pEGFP-WT-hERG/pEGFP-G604S-hERG的最大hERG尾電流密度[(23.1±0.8)pA/pFvs(12.6±0.9)pA/pF，P<0.05]。此外，EGFP基因與野生型或突變hERG基因融合后，明顯改變了hERG通道的電壓依賴性激活及去失活特性。 結(jié)論 EGFP基因與野生型或突變hERG基因融合不影響hERG通道蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位，但明顯改變了hERG電流的大小、激活及去失活特性，因此檢測突變hERG通道的電生理功能時應(yīng)避免使用綠色熒光蛋白基因質(zhì)粒作為表達(dá)載體。

增強(qiáng)型綠色熒光蛋白； hERG； G604S突變； HEK293

先天性長QT綜合征(congenital long QT syndrome, cLQTS)是由編碼心臟離子通道或離子通道相關(guān)蛋白的基因突變導(dǎo)致相應(yīng)的離子通道功能異常，從而引起心電圖QT間期延長、T波異常，易產(chǎn)生室性心律失常，尤其是尖端扭轉(zhuǎn)性室速，并導(dǎo)致暈厥和猝死的一組綜合征。hERG基因(human ether-a-go-go-related gene)突變引起2型先天性長QT綜合征[1-4]。hERG基因G604S突變(hERG蛋白第604位甘氨酸被絲氨酸替代)是西安交通大學(xué)環(huán)境與疾病相關(guān)基因?qū)嶒炇仪捌谠谝粋€中國LQTS家系中發(fā)現(xiàn)的突變[5]。利用全細(xì)胞膜片鉗及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)觀察G604S突變引起hERG功能喪失(G604S突變引起hERG電流喪失，通道蛋白出現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，即只表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，而細(xì)胞膜上無表達(dá))，且對野生型hERG基因明顯的負(fù)顯性抑制作用[6]。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)作為常用的分子標(biāo)記物，可與其他目的基因形成融合蛋白，用于分析目的基因在細(xì)胞內(nèi)或機(jī)體內(nèi)的表達(dá)位置及量的變化，EGFP目前已成為生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)中研究和開發(fā)應(yīng)用最為廣泛的分子之一[7,8]。近年來在先天性長QT綜合征相關(guān)基因突變的致病機(jī)制研究中，將突變目的基因插入到EGFP基因表達(dá)載體中組成綠色熒光融合蛋白重組質(zhì)粒，在熒光顯微鏡下直接觀察突變目的基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位，但其對離子通道電流表達(dá)是否有影響還需進(jìn)一研究。本研究主要觀察將EGFP基因與野生型及G604S突變hERG基因組成融合基因，觀察EGFP蛋白對hERG通道蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位及對hERG電流表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑與儀器

HEK293細(xì)胞株由西安交通大學(xué)環(huán)境與疾病相關(guān)基因?qū)嶒炇姨峁┵|(zhì)粒pcDNA3-WT-hERG由美國Wisconsin大學(xué)Blake D.Anson博士惠贈，pcDNA3-G604S-hERG由西安交通大學(xué)環(huán)境與疾病相關(guān)基因?qū)嶒炇仪捌跇?gòu)建，pEGFP-WT-hERG及pEGFP-G604S-hERG均利用酶切法分別由pcDNA3-WT-hERG、pcDNA3-G604S-hERG和pEGFP-C2構(gòu)建成功。脂質(zhì)體2000試劑盒購自美國Invitrogen公司。抗體Anti-K11.1(hERG)及FITC標(biāo)記山羊抗兔二抗購自以色列Alomone公司。TCS SP2型激光掃描共聚焦顯微鏡為德國Leica公司產(chǎn)品。Axon-700B單探頭膜片鉗放大器、DigiData-1322A數(shù)模轉(zhuǎn)換裝置及pCLAMP9.2 膜片鉗數(shù)據(jù)處理軟件均為美國Axon公司產(chǎn)品。

1.2 HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天，HEK293細(xì)胞鋪在6孔板中，培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清、不含抗生素的高糖DMEM；轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度為60%-70%(膜片鉗實(shí)驗)或20%-30%(激光共聚焦實(shí)驗)；轉(zhuǎn)染程序按照脂質(zhì)體2000試劑說明進(jìn)行。細(xì)胞分別被轉(zhuǎn)入pcDNA3-WT-hERG和/或pcDNA3-G604S-hERG，pEGFP-WT-hERG和/或pEGFP-G604S- hERG。48 h后立即進(jìn)行膜片鉗及激光共聚焦實(shí)驗。

1.3 激光共聚焦觀察hERG通道蛋白在細(xì)胞中的定位

增強(qiáng)型綠色熒光表達(dá)載體觀察hERG通道蛋白在細(xì)胞中的定位： 6孔板中放入預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸處理過的蓋玻片，將HEK293細(xì)胞放在蓋玻片上，繼續(xù)生長12 h；將綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-WT-hERG和/或pEGFP-G604S-hERG轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞；48 h后立即棄去培養(yǎng)基，利用激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)觀察hERG通道蛋白在細(xì)胞中的定位：將真核表達(dá)載體pcDNA3-WT-hERG或/和pcDNA3-G604S-hERG轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞；48 h后立即用4%多聚甲醛固定，0.3%的Triton X-100室溫下打孔，一抗兔抗人HERG單克隆抗體(1∶100)和二抗FITC標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶100)標(biāo)記后激光共聚焦顯微鏡上觀察綠色熒光表達(dá)。1.4 全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測hERG通道電生理功能使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄HEK293細(xì)胞表達(dá)電流。pCLAMP9.2軟件記錄電流。細(xì)胞外液(mmol/L)：137 NaCl，4 KCl，1.8 CaCl2，1 MgCl2，10 Glucose，10 HEPES(pH 7.4)。電極內(nèi)液(mmol/L)：130 KCl，1 MgCl2，5 EGTA，5 MgATP，10 HEPES(pH 7.2)。實(shí)驗在室溫(23±1)℃中完成。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 激光共聚焦觀察hERG通道蛋白在細(xì)胞中的定位

HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染進(jìn)不同質(zhì)粒48 h后立即激光共聚焦顯微鏡觀察hERG通道蛋白的表達(dá)和定位,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3-WT-hERG或pEGFP-WT-hERG的細(xì)胞，hERG通道蛋白不但在細(xì)胞質(zhì)里表達(dá)，而且在細(xì)胞膜上有表達(dá)；轉(zhuǎn)染pcDNA3-G604S-hERG或pEGFP-G604S-hERG的細(xì)胞，hERG通道蛋白只表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，而細(xì)胞膜上無綠色熒光表達(dá)(見圖1)，說明突變可以引起通道蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)障礙。當(dāng)共轉(zhuǎn)染pcDNA3-WT-hERG/pcDNA3-G604S-hERG或pEGFP-WT-hERG/pEGFP-G604S-hERG時，細(xì)胞膜上綠色熒光較只轉(zhuǎn)染野生型hERG時明顯減弱，說明G604S突變減弱hERG通道在細(xì)胞膜上的表達(dá)。以上結(jié)果說明EGFP/hERG融合蛋白并不影響hREG蛋白在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)與定位，與免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法觀察hERG通道蛋白在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)定位相一致，說明EGFP基因表達(dá)載體可以作為hERG通道蛋白在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)定位的標(biāo)記工具。

圖1 激光共聚焦顯微鏡定位hERG通道蛋白在HEK293細(xì)胞內(nèi)的定位Figure 1 Confocal imaging of hERG channels in HEK293 cells

2.2 全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的hERG電流

HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染進(jìn)不同質(zhì)粒48 h后立即全細(xì)胞膜片鉗記錄hERG電流,從圖2A-圖2F可以看出轉(zhuǎn)染pcDNA3-WT-hERG或pcDNA3-WT-hERG/pcDNA3-G604S-hERG的細(xì)胞電流形態(tài)一致；轉(zhuǎn)染pEGFP-WT-hERG或pEGFP-WT-hERG/pEGFP-G604S-hERG的細(xì)胞電流形態(tài)相同，但它們的尾電流明顯小于轉(zhuǎn)染pcDNA3-WT-hERG或pcDNA3-WT-hERG/pcDNA3-G604S-hERG的細(xì)胞電流。轉(zhuǎn)染pcDNA3-G604S-hERG或pEGFP-G604S-hERG的細(xì)胞未檢測到hERG電流。圖2G是激活電流的I-V曲線，可以看出pcDNA3-WT-hERG的最大激活電流密度為(46.5±2.5)pA/pF(n=10)，而pEGFP-WT-hERG的最大激活電流密度為(45.4±6.4)pA/pF(n=10)，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；pcDNA3-WT-hERG/pcDNA3-G604S-hERG的最大激活電流密度為(14.3±0.5)pA/pF(n=10)，而pEGFP-WT-hERG/pEGFP-G604S-hERG的最大電流密度為(15.4±1.8)pA/pF，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，n=10)。圖2H是尾電流的I-V曲線，可以看出在pcDNA3-WT-hERG的最大尾電流密度為(75.4±2.2)pA/pF(n=10)，明顯高于pEGFP-WT-hERG的最大尾電流密度[(15.1±0.7)pA/pF，P<0.05，n=10]。pcDNA3-WT-hERG/pcDNA3-G604S-hERG的最大尾電流密度明顯高于pEGFP-WT-hERG/pEGFP-G604S-hERG[(23.1±0.8)pA/pFvs(12.6±0.9)pA/pF，P<0.05，n=10]。以上結(jié)果說明綠色熒光融合蛋白并不影響hERG激活電流，而明顯減小hERG尾電流。

2.3 綠色熒光融合蛋白對hERG通道電生理特性的影響

將尾電流標(biāo)準(zhǔn)化后，再用Boltzmann方程進(jìn)行擬合,轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒細(xì)胞尾電流擬合曲線顯示，pcDNA3-WT-hERG組半激活電壓(V1/2)為(-15.1±1.1)mV(n=10)，pEGFP-WT-hERG組半激活電壓為(-8.7±0.7)mV(n=9)，兩組相比有顯著性差異(P<0.05,見圖3)。pcDNA3-WT-hERG/pcDNA3-G604S-hERG組半激活電壓(V1/2)為(-15.8±1.3)mV(n=10)，pEGFP-WT-hERG/pEGFP-G604S-hERG組半激活電壓為(-7.7±0.7)mV(n=10)，兩組相比有顯著性差異(P<0.05)。以上結(jié)果說明綠色熒光融合蛋白可改變hERG通道的電壓依賴性激活特性。

圖2 hERG電流的激活電流和尾電流I-V曲線Figure 2 I-V relationships for amplitudes of activation currents and tail currents of hERG recorded during test pulses

圖4A-圖4D所示的是膜片鉗記錄的不同組hERG電流的去失活部分，可以看出pcDNA3-WT-hERG組電流的去失活部分明顯大于其他三組。將去失活電流進(jìn)行雙指數(shù)方程擬合后得出快去失活時間常數(shù)和慢去失活時間常數(shù)。圖4E-圖4F所示的是在不同命令電壓下不同組別的快去失活時間常數(shù)及慢去失活時間常數(shù)。從圖中可看出，在不同的命令電壓下，pcDNA3-WT-hERG組和pcDNA3-WT-hERG/pcDNA3-G604S-hERG組的快去失活時間常數(shù)及慢去失活時間常數(shù)明顯大于pEGFP-WT-hERG組和pEGFP-WT-hERG/pEGFP-G604S-hERG組(P<0.05)，說明綠色熒光融合蛋白加速了hERG電流的去失活。

圖3 不同命令電壓下最大尾電流經(jīng)Boltzmann方程擬合后曲線Figure 3 Amplitudes of tail currents plotted as a function of the test potential and fitted to a Boltzmann function

圖4 HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒后表達(dá)的hERG電流的去失活特性Figure 4 Deactivation of expressed currents in HEK293 cells transfected with different plasmids

3 討論

HERG基因G604S突變是我們前期在一個中國LQTS家系中發(fā)現(xiàn)的國內(nèi)新突變[5]。本研究利用EGFP基因與hERG基因融合技術(shù)觀察到：EGFP/hERG融合蛋白并不影響hREG蛋白在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)與定位，EGFP基因表達(dá)載體可以作為hERG通道蛋白在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)定位的標(biāo)記工具；綠色熒光融合蛋白不影響hERG激活電流，而明顯減小hERG尾電流；綠色熒光融合蛋白可改變hERG通道的電壓依賴性激活特性及去失活特性。

檢測目的基因表達(dá)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和定位可采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，此技術(shù)雖然能較準(zhǔn)確反映目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及定位，但其缺點(diǎn)是須對細(xì)胞進(jìn)行固定及一系列的操作處理，操作繁瑣復(fù)雜。近年來廣泛將EGFP其他目的基因形成重組表達(dá)載體，在熒光顯微鏡下直接觀察細(xì)胞中目的基因表達(dá)蛋白的表達(dá)、轉(zhuǎn)運(yùn)和定位變化。本實(shí)驗中將野生型及G604S突變hERG基因與EGFP基因進(jìn)行融合表達(dá)，結(jié)果表明綠色熒光蛋白與野生型或G604S突變hERG蛋白共表達(dá)后，并不改變hERG蛋白在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)及定位，可準(zhǔn)確反映hERG蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，也說明EGFP可作為野生型或突變型 hERG通道蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位表達(dá)工具，不但操作簡單準(zhǔn)確，而且易于檢測。

在HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染進(jìn)EGFP與野生型或G604S突變hERG融合基因時，膜片鉗技術(shù)檢測到帶有EGFP的hERG尾電流明顯小于無EGFP的hERG電流，且其電壓依賴性激活特性及去失活特性明顯改變。本實(shí)驗中pEGFP-WT-hERG及pEGFP-G604S-hERG均利用酶切法將WT-hERG和G604S-hERG連接于pEGFP-C2質(zhì)粒中EGFP基因的下游端，因此EGFP被融合于hERG基因的N-端上游。既往研究顯示hERG通道蛋白的N-端Per-Arnt-Sim(PAS)區(qū)與通道的去失活有明顯關(guān)系。HERG基因N-端突變可引起hERG電流去失活明顯加速[9,10]。本實(shí)驗中EGFP融合于hERG 基因的N-端可能改變了PAS區(qū)的功能，從而加速了hERG電流的去失活。

綜上所述，本研究提示增強(qiáng)型綠色熒光融合蛋白對野生型或突變型hERG通道蛋白的表達(dá)定位無影響，但會明顯改變hERG電流的電生理功能，因此檢測LQTS相關(guān)hERG基因的電生理功能時應(yīng)避免使用綠色熒光蛋白基因質(zhì)粒作為表達(dá)載體。

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Study on the function of co-expression of enhanced green fluorescent protein gene with congenital LQT2 relating hERG gene G604S mutation

HUO Jianhua1, MA Aiqun1*, GUO Xueyan2, QIANG Hua1, LIU Ping1, BAI Ling1

(1DepartmentofCardiovascularMedicine,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;2DepartmentofDigestiveDiseases,ShaanxiProvincialPeople’sHospital;*Correspondingauthor,E-mail:maaiqun@medmail.com.cn)

ObjectiveTo explore the effect of EGFP tagged to hERG channels on the electrophysiological properties of hERG channels.MethodsHEK293 cells were transfected with pcDNA3-WT-hERG and/or pcDNA3-G604S-hERG, pEGFP-WT-hERG and/or pEGFP-G604S-hERG. The subcellular location of hERG channels in HEK293 cells was analyzed under confocal microscopy. And hERG currents were recorded using the voltage clamp technique.ResultsIn HEK293 cells transfected with pcDNA3-WT-hERG or pEGFP-WT-hERG, hERG channels expressed both on the cell surface and within the cytoplasm. In cells transfected with pcDNA3-G604S-hERG or pEGFP-G604S-hERG, hERG channels only expressed in the cytoplasm. The maximal density of tail currents was (75.4±2.2)pA/pF and(15.1±0.7)pA/pF in cells expressing pcDNA3-WT-hERG and pEGFP-WT-hERG, respectively(P<0.05). The maximal density of tail currents in cells co-expressing pcDNA3-WT-hERG and pcDNA3-G604S-hERG was(23.1±0.8)pA/pF, which was significantly higher than in cells co-expressing pEGFP-WT-hERG and pEGFP-G604S-hERG[(12.6±0.9)pA/pF,P<0.05]. In addition, EGFP/hERG fusion protein altered the voltage-dependent hERG channel activation and deactivation.ConclusionThe enhanced green fluorescent protein shows no effect on the transport and localization of wild-type or mutant hERG channel protein, but significantly alters electrophysiological function of hERG current. Thus, it should be avoided using EGFP as a reporter to study the electrophysiological function of hERG channel.

enhanced green fluorescent protein(EGFP); hERG; G604S mutation; HEK293

國家自然科學(xué)基金資助項目(30801133);陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃基金資助項目(2014JM2-8154)

霍建華，男，1979-03生，博士，主治醫(yī)師,E-mail:huojianhua2005@126.com

2016-07-01

R541.1

A

1007-6611(2016)09-0785-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.09.001