張煥麗，李凡姝，馬　慧，崔曉彤，王　霞，劉　娣，翟　歡，肖志剛

（沈陽(yáng)師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)　110034）

超聲波輔助熱水浸提黑木耳多糖和黃酮的研究

張煥麗，李凡姝，馬慧，崔曉彤，王霞，劉娣，翟歡，*肖志剛

（沈陽(yáng)師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110034）

我國(guó)黑木耳資源豐富，其中含有多糖、黃酮等多種活性物質(zhì)，是一種營(yíng)養(yǎng)較高的食用菌，同時(shí)也具有重要的藥用價(jià)值。采用超聲波輔助熱水法提取黑木耳中的多糖和黃酮，分別用苯酚-濃硫酸法和三氯化鋁法測(cè)定提取物中多糖和黃酮。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇液料比、超聲時(shí)間和提取溫度3個(gè)因素進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，并分別建立多糖、黃酮含量的二次回歸方程，通過(guò)響應(yīng)面分析法確定黑木耳多糖和黃酮含量的最佳工藝條件為液料比60∶1，超聲時(shí)間15 min，提取溫度70℃，黑木耳多糖和黃酮的最大含量分別為7.78，0.56 mg/g。

黑木耳；多糖；黃酮；含量；響應(yīng)面法

黑木耳，別名黑菜，因其形狀似耳，色調(diào)呈黑褐色而得名。黑木耳為木耳科植物，生長(zhǎng)在楊樹(shù)、椴樹(shù)、槐樹(shù)等120多種闊葉樹(shù)的腐木上，單生或群生；人工培植以椴木和袋料為主[1]。黑木耳性平、味甘，具有涼血、止血、活血、益胃、潤(rùn)燥的功效[2]。黑木耳是一種含有豐富營(yíng)養(yǎng)素的食用菌，在保健品、藥材方面也具有開(kāi)發(fā)價(jià)值[3]。黑木耳中多糖是其主要活性成分，除此之外，黃酮也發(fā)揮著重要的活性作用[4]。相關(guān)研究表明，黑木耳多糖和黃酮均有抗氧化、降血脂、抗腫瘤、抗衰老等功效[5-6]。我國(guó)黑木耳資源豐富，對(duì)黑木耳在醫(yī)療保健方面的研究也在逐步深入。

目前，我國(guó)對(duì)于黑木耳中活性物質(zhì)的提取工藝研究主要集中在單獨(dú)提取黑木耳某一活性物質(zhì)方面，對(duì)黑木耳多糖和黃酮類(lèi)化合物同步提取工藝方面的研究較少。本文通過(guò)熱水浸提和超聲波2種方法相結(jié)合，同步提取黑木耳中多糖和黃酮，對(duì)綜合提取黑木耳多糖和黃酮工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)精確的計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析得出最佳工藝參數(shù)，為提取物的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論根據(jù)[7]。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

1.1.1材料

黑木耳，市售，產(chǎn)自黑龍江?。黄咸烟?，沈陽(yáng)市東興試劑廠(chǎng)提供；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海多烯生物科技有限公司提供；苯酚，天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)提供；濃硫酸、丙酮，沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠(chǎng)提供；三氯化鋁，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；乙醇，沈陽(yáng)瑞豐精細(xì)化學(xué)品有限公司提供；石油醚，沈陽(yáng)市新化試劑廠(chǎng)提供。以上試劑均為分析純。

1.1.2設(shè)備

DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DK-S26型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；JXFM110型錘式旋風(fēng)磨，上海嘉定糧油儀器有限公司產(chǎn)品；DT-200型電子天平，北京天平物華醫(yī)療儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；TD5Z型離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；WFZUV-2000型紫外分光光度計(jì)，尤尼科（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1黑木耳多糖和黃酮提取工藝流程

（1）多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。準(zhǔn)確稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖0.02 g于100 mL容量瓶中，加水溶解，定容至刻度，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mL于25 mL有塞試管中，加蒸餾水補(bǔ)至2 mL，再以2 mL蒸餾水作為空白，分別加入6%苯酚溶液1 mL，濃硫酸5 mL，靜置15 min后搖勻，室溫放置20 min。然后，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[8]。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程為C1=0.015 9X1+ 0.016 3，R21=0.997 4。

（2）黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品0.02 g于100 mL容量瓶中，加入一定量無(wú)水乙醇使其充分溶解后，再定容至刻度，搖勻，配成蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL于25 mL有塞試管中，加無(wú)水乙醇至10 mL。再向各個(gè)試管中分別加入0.5 mL的10%氯化鋁溶液，然后靜置20 min。于波長(zhǎng)415 nm處以無(wú)水乙醇調(diào)節(jié)零點(diǎn)，測(cè)定各管吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[9]。

黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。

圖2　黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

根據(jù)黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程為C2=0.009 2X2+ 0.007 1，R22=0.998 6。

1.2.3黑木耳多糖和黃酮的測(cè)定

黑木耳粉碎，過(guò)80目篩。稱(chēng)取2 g黑木耳干粉m，放入250 mL錐形瓶中，加入蒸餾水，混勻，先放入超聲儀器中進(jìn)行超聲浸提，后放入恒溫水浴鍋中進(jìn)行水浴浸提，然后以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心15 min，取上清液。殘?jiān)尤肱c上次操作相同的水量，重復(fù)上述過(guò)程，將2次濾液合并[10-13]。向?yàn)V液中加入等比例的乙醇，進(jìn)行過(guò)夜醇沉。醇沉液以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心10 min，上清液和沉淀分離。

上清液置于水浴鍋中濃縮，定容至25 mL，記為V1。吸取1 mL加入具塞試管中，用乙醇溶液定容至10 mL，向試管中加入10%氯化鋁溶液0.5 mL，靜置20 min。于波長(zhǎng)415 nm處，以無(wú)水乙醇調(diào)節(jié)零點(diǎn)，測(cè)定吸光度[14]。

向沉淀中加入丙酮和石油醚，清洗沉淀，再進(jìn)行過(guò)濾分離，直至沉淀表面的溶劑揮發(fā)掉。然后用蒸餾水將沉淀溶解，定容至100 mL，記為V2[15-18]。再吸取1 mL溶液加入有塞試管中，加入1 mL的6%苯酚溶液，5 mL濃硫酸，靜置15 min后搖勻，室溫放置20 min。然后，于490 nm處測(cè)吸光度。

多糖含量按R=C1V1/1 000 m計(jì)算；黃酮含量按R'=C2V2/1 000 m計(jì)算。

1.2.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以液料比（A）、超聲時(shí)間（B）、提取溫度（C）為自變量，分別以黑木耳多糖和黃酮含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)[19-20]。

響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1　響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

2　結(jié)果與分析

2.1黑木耳多糖和黃酮提取結(jié)果分析

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共進(jìn)行17組試驗(yàn)。

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

利用Design Expert軟件，通過(guò)對(duì)黑木耳多糖和黃酮含量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到黑木耳多糖含量和黃酮含量對(duì)編碼自變量液料比、超聲時(shí)間、提取溫度的二次多項(xiàng)回歸方程。

多糖三元二次回歸方程：

Y=7.61+0.43A+0.27B-1.11C-0.62AB+0.25AC+0.42BC-0.71A2-1.62B2-2.57C2.

多糖擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析見(jiàn)表3。

由表3可知，F(xiàn)回歸=154.03，p<0.000 1，表明模型極顯著。失擬項(xiàng)p=0.817 9，表明失擬不顯著。模型中一次項(xiàng)A，B，C對(duì)多糖含量的影響極顯著（p<0.01）；二次項(xiàng)A2，B2，C2對(duì)多糖含量的影響極顯著（p<0.01）；交互項(xiàng)AB，BC對(duì)多糖含量的影響極顯著（p<0.01），AC對(duì)多糖含量的影響顯著。表明試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，因素間的交互作用對(duì)黑木耳多糖含量有影響。模型的調(diào)整確定系R2Adj=0.988 5，即該模型能解釋98.85%的響應(yīng)值變化，說(shuō)明該模型擬合程度良好，可以用此模型對(duì)超聲波輔助熱水浸提法提取黑木耳多糖含量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表3　多糖擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析

黃酮三元二次回歸方程：

Y'=0.55+0.023A+0.021B-0.082C-0.054AB+0.013AC+0.020BC-0.049A2-0.099B2-0.15C2.

黃酮擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析見(jiàn)表4。

表4　黃酮擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析

由表4可知，F(xiàn)'回歸=37.17，p<0.000 1，表明模型極顯著。失擬項(xiàng)p=0.344 2，表明失擬不顯著。模型中一次項(xiàng)A對(duì)黃酮含量的影響顯著（p<0.05），C對(duì)黃酮含量的影響極顯著（p<0.01）；二次項(xiàng)A2，B2，C2對(duì)黃酮含量的影響極顯著（p<0.01）；交互項(xiàng)AB對(duì)黃酮含量的影響極顯著（p<0.01）。表明試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，因素間的交互作用對(duì)黑木耳黃酮含量有影響。模型的調(diào)整確定系R'2Adj=0.953 2，即該模型能解釋95.32%的響應(yīng)值變化，說(shuō)明該模型擬合程度良好，可以用此模型對(duì)超聲波輔助熱水浸提法提取黑木耳黃酮含量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

2.2黑木耳多糖和黃酮含量的響應(yīng)面分析

利用Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合。根據(jù)二次模型所做的響應(yīng)曲面及其相應(yīng)的等高線(xiàn)圖可以評(píng)價(jià)試驗(yàn)因素對(duì)黑木耳多糖含量的兩兩交互作用，確定各因素的最佳水平范圍。等高線(xiàn)的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著；圓形則相反，此時(shí)兩因素的交互作用可以忽略。

液料比和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)黑木耳多糖含量的響應(yīng)面與等高線(xiàn)見(jiàn)圖3，料液比和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)黑木耳黃酮含量的響應(yīng)面與等高線(xiàn)見(jiàn)圖4。

圖3　液料比和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)黑木耳多糖含量的響應(yīng)面與等高線(xiàn)

由圖3可知，液料比和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)多糖含量的影響顯著。從超聲時(shí)間的曲面斜率略大于液料比的曲面斜率可知，超聲時(shí)間對(duì)黑木耳多糖含量的影響大于液料比的影響。

由圖4可知，液料比和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)黃酮含量的影響顯著。從超聲時(shí)間的曲面斜率略大于液料比的曲面斜率可知，超聲時(shí)間對(duì)黑木耳黃酮含量的影響大于液料比的影響。

3　結(jié)論

黑木耳多糖和黃酮具有多種生物活性功能，在食品、藥品、保健品方面具有極大地發(fā)展前景。本文主要對(duì)結(jié)合2種提取方法提取黑木耳多糖和黃酮的最佳工藝進(jìn)行研究，探究出最佳的工藝提取條件，為黑木耳多糖和黃酮的提取條件提供了科學(xué)依據(jù)。

（1）通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，液料比、超聲時(shí)間和提取溫度這3個(gè)因素對(duì)黑木耳多糖和黃酮含量的影響較大。

圖4　料液比和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)黑木耳黃酮含量的響應(yīng)面與等高線(xiàn)

（2）由響應(yīng)面試驗(yàn)分析得出，提取的最佳工藝為液料比60∶1，超聲時(shí)間15 min，提取溫度70℃，多糖和黃酮含量分別為7.78，0.56 mg/g。

（3）在提取工藝條件為液料比60∶1，超聲時(shí)間15 min，提取溫度70℃下，得到驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，多糖和黃酮含量分別為7.72，0.51 mg/g。

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Process of Ultrasound-assisted Hot Water Extraction of Auricularia auricular Polysaccharides and Flavonoids

ZHANG Huanli，LI Fanshu，MA Hui，CUI Xiaotong，WANG Xia，LIU Di，ZHAI Huan，*XIAO Zhigang
（College of Grain Science and Technology，Shenyang Normal University，Shenyang，Liaoning 110034，China）

China is rich in resources of Auricularia auricular，which contains polysaccharides，flavonoids and other active substances，is a nutrient rich edible fungus，but also has important medicinal value.The extraction of polysaccharide from Auricularia and flavone by ultrasonic assisted hydrothermal method.Respectively，extraction of polysaccharide and flavone content is determined by phenol-sulfuric acid method and AlCl3method.On the basis of single factor test results，central composite experiment of three levels of three factors in selecting the material liquid ratio，ultrasonic time and temperature of extraction，two regression equation and the establishment of polysaccharide and total flavonoids content.The optimal process conditions by response surface method and Auricularia auricula polysaccharide and flavone rate：the ratio of liquid to 60∶1，ultrasonic time of 15 min，extraction temperature is 70℃，the maximum total amount of extracted Auricularia auricula polysaccharides and flavonoids as 7.78，0.56 mg/g.

Auricularia auricula；polysaccharide；flavone；yield；response surface method

TS219

Adoi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.09.031

2016-07-23

遼寧省“百千萬(wàn)人才工程”資助項(xiàng)目（2013921038）；沈陽(yáng)市科技創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)資金（F14-104-3-00）；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀科技人才支持計(jì)劃（第一層次）資助專(zhuān)項(xiàng)（LR2015062）。

張煥麗（1992— ），女，在讀碩士，研究方向?yàn)樯锘ぁ?/p>

肖志剛（1972— ），男，博士，教授，研究方向?yàn)榧Z食油脂及植物蛋白工程。