劉佳慧，王修俊，*，尹　爽，田　多，王紀輝

（1.貴州大學發(fā)酵工程與生物制藥省級重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

響應面法優(yōu)化酶-超聲波輔助同步提取鴨骨素工藝

劉佳慧1，2，王修俊1，2，*，尹爽1，2，田多1，2，王紀輝1，2

（1.貴州大學發(fā)酵工程與生物制藥省級重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

以新鮮鴨骨為原料，采用酶-超聲波輔助同步提取鴨骨素，并以可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量為考察指標，在單因素試驗的基礎上采用響應面法優(yōu)化鴨骨素提取工藝條件。結(jié)果表明，酶-超聲波輔助同步提取鴨骨素的最佳工藝條件為：超聲溫度62℃，超聲功率248W，超聲時間5.1 h，酶添加量

1.34%。此條件下鴨骨素提取液中可溶性固形物含量和蛋白質(zhì)含量分別為（25.8±0.047）°Bx和（20.9± 0.018）g·100 g-1。采用酶-超聲波輔助同步提取的鴨骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量極顯著高于單一酶解法、微波提取法和超聲波提取法（P＜0.01）。

鴨骨素；提取工藝；酶解；超聲波；響應面法

我國是畜禽肉類消費量最大的國家之一，而動物骨骼約占動物體重的20%～30%，因此我國畜禽骨資源極為豐富［1-3］。三穗麻鴨是我國四大名鴨之一，貴州省三穗縣大力發(fā)展鴨產(chǎn)業(yè)，現(xiàn)已成為貴州省的特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，但每年都有大量的鴨骨未得到充分利用，只是部分加工成骨油、飼用骨粉、肥料等附加值很低的傳統(tǒng)產(chǎn)品［4-6］，造成資源浪費和環(huán)境污染。鴨骨素中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，但是精深加工開發(fā)與利用方面較差，導致精細加工產(chǎn)品及功能性產(chǎn)品較少。

畜禽骨骨素是新鮮畜禽骨經(jīng)酸法、堿法和酶法制得的初級骨提取物，具有一定的增香效果。骨素產(chǎn)品作為一種天然的營養(yǎng)食品，富含蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸及其他無機鹽，這些物質(zhì)都是易于被人體吸收和必需的營養(yǎng)物質(zhì)。根據(jù)骨素的這些特性可以將其添加到營養(yǎng)口服液、速溶氨基酸沖劑等保健品當中，從而達到促進新陳代謝和傷口愈合的效果。因此，可以用該類物質(zhì)來研制滿足不同人群需求的保健食品。

酶解法是一種新的動物蛋白水解液的生產(chǎn)方法，與現(xiàn)有的化學法和物理法相比，具有定向、易控、溫和等優(yōu)點［7-10］。近年來，聲學技術(shù)同生物、食品技術(shù)領域不斷交叉、滲透，應用超聲技術(shù)在水溶液中提高酶活力、促進酶催化反應已有研究報道［11-12］。超聲波不但能加速酶解速度，而且能改善產(chǎn)品品質(zhì)，優(yōu)化反應條件［13-14］；同時在食品加工技術(shù)中，超聲可以輔助或強化提取。本試驗采用酶-超聲波輔助同步提取法對鴨骨中鴨骨素的提取效果進行研究，通過Box-Behnken試驗設計和響應面分析，獲得提取效果最佳的工藝參數(shù)條件，為鴨骨副產(chǎn)品深加工的開發(fā)與利用提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與設備

1.1.1材料與試劑

新鮮鴨骨，由貴州三穗翼宇鴨業(yè)有限公司提供，預處理后于-18℃冰箱中保存，備用。

木瓜蛋白酶（800U/mg）、堿性蛋白酶（800U/mg）、中性蛋白酶（800 U/mg）、胰蛋白酶（800 U/mg），均由上海源葉生物有限公司生產(chǎn)；硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、氫氧化鈉等，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2儀器與設備

FA2004B電子天平，DZKW-4電子恒溫水浴鍋，GZX-GF101-3-BS-Ⅱ電子恒溫鼓風干燥箱，RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，GL-20G高速冷凍離心機，SIN82T手持式折光儀，HC-300T2高速多功能粉碎機，KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2方法

1.2.1鴨骨素提取工藝流程

鴨骨→解凍→粉碎→超聲酶解→滅酶→過濾→離心→濃縮→鴨骨素提取液

1.2.2操作要點

1.2.2.1原料選擇

挑選較大的鴨腿骨、胸骨和翅骨，盡量剔除鴨肉。

1.2.2.2粉碎

將鴨骨于粉碎機內(nèi)粉碎5min，成鴨骨泥。

1.2.2.3滅酶

將粉碎后的鴨骨置于95℃水浴鍋中滅酶15min。

1.2.2.4過濾、離心

酶解液過濾后以4 000 r/min離心10min。

1.2.2.5濃縮

取離心后上層酶解液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上80℃濃縮10min，至接收燒瓶中液體無明顯增加。

1.2.3試驗方案設計

1.2.3.1單因素試驗

準確稱取鴨骨粉100 g，液料比120mL/100 g（由于液料比較小情況下獲得酶解產(chǎn)物較少，不利于后續(xù)試驗，所以選擇液料比120 mL/100 g），超聲溫度60℃，超聲時間3 h，超聲功率210W，加酶量1.0%的條件下，考察木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶對鴨骨素提取液中可溶性固形物含量的影響，進行酶種類的篩選。

準確稱取鴨骨粉100 g，在液料比120mL/100 g木瓜蛋白酶添加量1.0%，超聲溫度60℃，功率210W，時間3 h的條件下，以鴨骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量為指標，分別考察超聲溫度、超聲功率、超聲時間、加酶量、液料比對酶解提取效果的影響，初步確定因素與水平，單因素試驗設計見表1。

表1　單因素試驗設計Table 1　Single factor experiment design

1.2.3.2響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以總可溶性固形物含量（°Bx）和蛋白質(zhì)含量為響應值，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，以超聲溫度、超聲功率、超聲時間、加酶量為主要影響因素。進行四因素三水平組合試驗，因素與水平見表2。

表2　Box-Behnken試驗設計因素水平編碼表Table2　ExperimentalvariablesandlevelsforBox-Behnken design

1.2.3.3不同提取方式的比較

酶解法提取條件：準確稱取鴨骨100g，加入木瓜蛋白酶1.0%，液料比120mL/100g，水浴溫度60℃條件下酶解3h，測定鴨骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量。

超聲法提取條件：準確稱取鴨骨100g，液料比120mL/100g，超聲溫度60℃，超聲時間3h，測定鴨骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量。

微波法提取條件：準確稱取鴨骨100g，液料比120mL/100g，微波功率300W，提取時間1h，測定鴨骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量。

1.2.4測定項目與方法

1.2.4.1可溶性固形物含量（SSC）

使用手持折光儀測量，用百利度（°Bx）來反映可溶性固形物的含量。

1.2.4.2蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法［15］測定。計算公式為：

式中：X為試樣中蛋白質(zhì)的含量（g/100g）；V1為試液消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積（mL）；V2為空白試劑消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積（mL）；V3為吸取消化液的體積（mL）；c為硫酸或鹽酸標準滴定液濃度（mol/L）；0.0140為1.0mL硫酸［C（1/2H2SO4）=1.000mol/L］或鹽酸［C（HCl）=1.000mol/L］標準滴定溶液相當?shù)牡馁|(zhì)量（g）；m為試樣的質(zhì)量（g）；F為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。

1.2.5數(shù)據(jù)處理

采用Excel2003軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用Design-Expert8.0.6軟件對響應面試驗進行分析，采用SPSS17.0軟件進行差異顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

2.1.1酶種類的選擇

研究表明［16］酶解液中可溶性固形物含量與蛋白質(zhì)含量呈線性關系，為節(jié)約選酶試驗的時間，暫以可溶性固形物含量為考察指標。由圖1可知，采用不同種類的酶對鴨骨進行酶解，酶解液中可溶性固形物含量較對照有不同程度的增加。其中，以木瓜蛋白酶水解后鴨骨素提取液中可溶性固形物含量最高。因此，選用木瓜蛋白酶對鴨骨素進行提取。

2.1.2超聲溫度對鴨骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量的影響

由圖2可知，隨著超聲溫度的升高，鴨骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量均呈先升高后降低的趨勢。進行酶解反應時，隨著溫度升高，酶解反應加快，當超聲溫度為60℃時，鴨骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量最高，但繼續(xù)升高超聲溫度，蛋白酶變性失活，不利于酶解反應。在溫度的作用下，鴨骨中可溶性固形物和蛋白質(zhì)也在不斷溶出，因此，在酶和超聲溫度的雙重作用下，確定適宜的超聲溫度為60℃。

2.1.3超聲功率對鴨骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量的影響

由圖3可知，隨著超聲功率的提高，鴨骨素提取液中可溶性固形物與蛋白質(zhì)含量均呈先下降后上升再下降的變化趨勢。超聲功率較低時，隨超聲功率升高，酶的活性逐漸上升，促進鴨骨素的析出，超聲功率為240W時兩指標均達到最高值，而當超聲功率繼續(xù)提高時酶活性則下降［17-20］。適宜功率的超聲波在一定程度上促進酶的催化作用，影響程度因酶的種類而不同，試驗中要根據(jù)不同的酶選擇最佳的超聲功率，本試驗確定適宜的超聲功率為240W。

2.1.4超聲時間對鴨骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量的影響

由圖4可知，隨超聲時間延長，鴨骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量均不斷升高，當超聲5 h時，鴨骨素中可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量達到最高，之后其含量均呈下降趨勢，這可能是由于超聲5 h時酶促反應充分，繼續(xù)增加超聲時間不再促進酶的水解。因此，確定適宜的超聲時間為5 h。

2.1.5加酶量對鴨骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量的影響

由圖5可知，當加酶量過少時，酶解速度較慢或酶解反應不完全，隨著加酶量的增加，鴨骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量均不斷升高。當酶添加量為1.3%時，可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量達到最高值，此時鴨骨被酶完全水解，繼續(xù)增加酶的用量則可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量不再升高。因此，確定適宜的加酶量為1.3%。

2.1.6液料比對鴨骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量的影響

由圖6可知，當液料比為60mL/100 g時，鴨骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量達最高，之后繼續(xù)增加溶劑用量，可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量持續(xù)下降，這是因為溶劑的增加使反應體系內(nèi)酶的濃度變小，導致酶與底物反應不徹底，從而使可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量下降。因此，確定適宜液料比為60mL/100 g。

2.2響應面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1回歸模型的建立及方差分析

為確定鴨骨素的最佳提取工藝，參考單因素試驗結(jié)果，通過Box-Behnken進行響應面試驗，試驗設計與結(jié)果見表3。

表3　Box-Behnken試驗設計與結(jié)果Table3　DesignandresultsofBox-Behnkentest

利用Design-Expert8.0.6軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到SSC（Y1）、蛋白質(zhì)含量（Y2）對自變量A、B、C、D（其中變量以得到的-1到1區(qū)間的最佳條件代入）的二次多項回歸方程為：

Y1=25.64+1.13A+0.82B+0.90C+0.68D-0.20AB-0.13AC+0.55AD-0.47BC-0.32BD-0.100CD-3.67A2-2.58B2-2.66C2-2.69D2

Y2=20.58+0.98A+1.51B+0.17C+0.57D-0.097AB-0.085AC-0.22AD-0.44BC-0.22BD-0.062CD-2.75A2-1.41B2-2.30C2-1.94D2

以可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量為響應值的響應面方差分析結(jié)果分別見表4、5。

由表4可知，響應面模型P＜0.0001，表明回歸模型的回歸效果極顯著；失擬項P=0.3054＞0.05，即模型失擬項不顯著，表明響應面模型符合，即試驗數(shù)據(jù)可靠。本模型的R2=0.9741，表明響應面模型與試驗數(shù)據(jù)擬合良好［21］。響應面模型的顯著性分析結(jié)果表明：A、B、C、D、A2、B2、C2、D2對鴨骨素提取液中可溶性固形物含量影響極顯著（P＜0.01），AD、BC對鴨骨素提取液中可溶性固形物含量影響顯著（P＜0.05）。各試驗因素對提取液中可溶性固形物含量的影響依次是A（超聲溫度）＞C（超聲時間）＞B（超聲功率）＞D（加酶量）。

由表5可知，響應面模型P＜0.0001，表明回歸模型的回歸效果極顯著；失擬項P=0.1733＞0.05，即模型失擬項不顯著，表明響應面模型符合，即試驗數(shù)據(jù)可靠。本模型的R2=0.9589，表明響應面模型與試驗數(shù)據(jù)擬合良好。響應面模型的顯著性分析結(jié)果表明：A、B、D、A2、B2、C2、D2對鴨骨提取液中蛋白質(zhì)含量影響極顯著（P＜0.01），各試驗因素對鴨骨素提取液中蛋白質(zhì)含量的影響依次是B（超聲功率）＞A（超聲溫度）＞D（加酶量）＞C（超聲時間）。

表4　可溶性固形物含量為響應值的回歸模型方差分析結(jié)果Table4　Thevarianceanalysisresultsoftheregressionmodel withthesolublesolidcontentastheresponsevalue

表5　蛋白質(zhì)含量為響應值的回歸模型方差分析結(jié)果Table 5　The results of variance analysis of the regressionmodel with protein content as the response value

2.2.2響應面交互作用分析

2.2.2.1可溶性固形物含量

由Design-Expert8.0.6軟件繪制以可溶性固形物含量為響應值的各因子交互作用的響應面圖，見圖7。

由圖7A、B可知，超聲溫度和超聲功率、超聲溫度和超聲時間的交互作用對鴨骨素提取液中可溶性固形物含量的影響不明顯；由圖7C、D可知，隨著超聲溫度的升高和加酶量的增加，以及超聲功率的增加和超聲時間的延長，鴨骨素提取液中可溶性固形物含量呈先增后降的變化趨勢，超聲溫度和加酶量、超聲功率和超聲時間的交互作用對鴨骨素中可溶性固形物含量的影響達顯著水平；由圖7E可知，隨著超聲功率和加酶量的增加，可溶性固形物含量先升高后下降；由圖7F可知，隨著超聲時間的延長和酶的增加，鴨骨素提取液中可溶性固形物含量先上升后降低，當超聲時間為5 h、酶添加量達到1.3%時，可溶性固形物含量達到最高點。

2.2.2.2蛋白質(zhì)含量

由Design-Expert 8.0.6軟件繪制以蛋白質(zhì)含量為響應值的各因子交互作用的響應面圖，見圖8。

圖8A反映出隨著超聲溫度的升高和超聲功率的增大，鴨骨素提取液中蛋白質(zhì)含量明顯增高，方差分析結(jié)果表明，超聲溫度和超聲功率交互作用對蛋白質(zhì)含量的影響達到極顯著水平；由圖8B可知，隨著超聲溫度的升高和超聲時間的延長，蛋白質(zhì)含量先升高后降低；由圖8C、D可知，隨著超聲溫度的升高和加酶量的增加及超聲功率和時間的增加，蛋白質(zhì)含量增加不顯著；由圖8E可知，隨著超聲功率和加酶量的增加，蛋白質(zhì)含量先升高后下降；由圖8F可知，隨著超聲時間的延長和加酶量的增加，蛋白質(zhì)含量達到最高點后下降，在超聲時間5 h，加酶量1.3%時，蛋白質(zhì)含量最高。

2.2.3響應面分析優(yōu)化結(jié)論驗證

對二次多元回歸模型進行分析并求解，得出鴨骨素提取最佳工藝參數(shù)為：超聲溫度61.59℃，超聲功率248.57W，超聲時間5.07 h，加酶量1.34%，此條件下可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量分別可達到25.82°Bx、20.99 g·100 g-1。為證實響應面法優(yōu)化所得結(jié)論的準確性，將最佳工藝修正為超聲溫度62℃、超聲功率248W、超聲時間5.1 h、加酶量1.34%，此條件下進行3次平行試驗，測得可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量平均值分別為（25.8±0.047）°Bx、（20.9±0.018）g·100 g-1。該值落在響應值的95%置信區(qū)間內(nèi)，說明響應面優(yōu)化得到的工藝參數(shù)可靠。

2.3不同提取方式的比較

由表6可知，酶-超聲波輔助同步提取法與單一酶解法比較，鴨骨提取液中蛋白質(zhì)含量提高了約

26.6%，可溶性固形物含量提高了約23.4%，且遠高于單一微波提取法和單一超聲波提取法。因此，酶-超聲波輔助同步提取法是提取鴨骨素的最佳方法。

表6　不同提取方式的比較Table 6　Comparison of different extractionmethods

3　結(jié)論

在單因素試驗的基礎上，通過響應面分析法，得到酶-超聲波輔助法同步提取鴨骨中鴨骨素的最佳工藝參數(shù)為：超聲溫度62℃，超聲功率248W，超聲時間5.1 h，加酶量1.34%。此條件下，鴨骨素提取液中可溶性固形物含量為（25.8±0.047）°Bx，蛋白質(zhì)含量為（20.9±0.018）g·100 g-1，較單一酶解提取法、微波法和超聲波法鴨骨提取液中蛋白質(zhì)含量和可溶性固形物含量都有不同程度的提高。

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Optim ization of Enzymatic-Ultrasonic Assisted Extraction of Duck Bone Extract by Response SurfaceM ethodology

LIU Jia-hui1，2，WANG Xiu-jun1，2，*，YIN Shuang1，2，TIAN Duo1，2，WANG Ji-hui1，2

（1.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy，Guizhou University，Guiyang550025，China；2.Collegeof LiquorMaking&Food Engineering，Guizhou University，Guiyang550025，China）

The fresh duck bone was taken as raw material，the duck bone extractwas obtained by enzymatic-ultrasonic assisted extraction with the contents of soluble solid and protein as indexes.On the basis of single factor experiment，response surface method was used to optimize the extraction process of duck bone.The results showed that，the optimum technological conditions for the simultaneous extraction of duck bone by enzymatic-ultrasonic assisted extraction were:ultrasonic temperature 62℃，ultrasonic power 248W，ultrasonic time 5.1 h，enzyme addition amount of 1.34%.Under these conditions，the total soluble solid content could reach（25.8±0.047）°Bx and the protein content could reach（20.9±0.018）g·100 g-1.The contents of soluble solid and protein in duck bone extractwith enzymatic-ultrasonic assisted extractionmethod were extremely significant higher than that of single enzyme hydrolysis，microwave or ultrasonic extractionmethod（P＜0.01）.

duck bone extract；extraction process；enzymatic hydrolysis；ultrasonic；response surfacemethod

TS251.94

A

10.3969/j.issn.1009－6221.2016.04.018

貴州省科技成果轉(zhuǎn)化引導基金計劃（黔科合成轉(zhuǎn)字［2014］5093號）

劉佳慧（1992—），女，漢族，在讀碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

王修俊，學士，教授，碩士生導師，研究方向：食品保鮮貯藏與加工，食品質(zhì)量安全與品質(zhì)控制。

2016-04-11