黃　霞， 盧　禹

( 中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 / 廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510275 )

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文心蘭類原球莖的愈傷組織誘導(dǎo)及其植株再生

黃霞*， 盧禹

( 中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 / 廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510275 )

該研究首次以文心蘭的類原球莖(protocorm-like bodies, PLBs)為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)及其植株再生培養(yǎng)，并分析了不同濃度的TDZ和2,4-D配比對愈傷組織增殖的影響。結(jié)果表明：以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加1 mg·L-1TDZ與3 mg·L-12,4-D，從接種的 PLBs上可以誘導(dǎo)出乳白色的、較疏松的愈傷組織，誘導(dǎo)頻率達(dá)到100%。愈傷組織繼代培養(yǎng)時(shí)，在2,4-D濃度為0.5～2.0 mg·L-1的范圍內(nèi)，其增殖主要受TDZ濃度的影響，TDZ濃度從1.0 mg·L-1降低到0.5 mg·L-1，愈傷組織鮮重增殖倍數(shù)顯著增加，由最低的4.50倍增加到最高的6.04倍。愈傷組織增殖的最適培養(yǎng)基為1/2MS + 0.5 mg·L-1TDZ + 1.0 mg·L-12,4-D。將在最適愈傷組織增殖培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)約1個(gè)月的愈傷組織轉(zhuǎn)移到T2培養(yǎng)基(3.5 g·L-1花寶1號 + 20 g·L-1紅薯 + 25 g·L-1香蕉 + 1 g·L-1tryptone + 20 g·L-1蔗糖 + 3.5 g·L-1phytagel)上，黑暗培養(yǎng)1個(gè)月后，每克鮮重的愈傷組織約誘導(dǎo)出1 328.67個(gè)PLBs。將誘導(dǎo)出的PLBs轉(zhuǎn)移到新鮮的T2 培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)1個(gè)月，萌發(fā)率為90.12%。而將小植株轉(zhuǎn)移到添加1 g·L-1活性炭的1/2MS培養(yǎng)基上，成苗率達(dá)到100%。該研究結(jié)果成功建立了文心蘭的高頻愈傷組織誘導(dǎo)及其植株再生體系，為文心蘭基因工程育種提供了一個(gè)高效、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。

文心蘭, 組織培養(yǎng), 愈傷組織增殖, TDZ, 再分化

文心蘭又名舞女蘭、 跳舞蘭, 屬蘭科(Orchidaceae)文心蘭屬 (Oncidium)，原產(chǎn)于美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)(Chase et al，2009)。文心蘭主要作為切花和盆花生產(chǎn)，其花分枝良好、花形優(yōu)美、花色亮麗，且可連續(xù)開花，具有較高的觀賞價(jià)值和較強(qiáng)的市場競爭力，尤其是在歐美市場中成為暢銷的盆花種類之一。與其它蘭科植物相同，由于傳統(tǒng)分株繁殖系數(shù)較低，業(yè)界主要利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行文心蘭種苗繁殖(崔廣榮，2010)。有關(guān)文心蘭離體快速繁殖技術(shù)的研究大都是針對試管苗工廠化生產(chǎn)而進(jìn)行的，主要集中于研究如何從外植體直接誘導(dǎo)出PLBs、PLBs增殖及植株再生。以文心蘭的花梗及其花芽(彭曉明等，2000；鐘士傳和曹善東，2002)、莖(芽)尖(Lim-Ho，1981；彭曉明等，2000)、根尖(Kerbauy，1984)或葉片(Chen et al，1999)等組織器官為外植體，均可誘導(dǎo)出PLBs，建立文心蘭離體再生體系。在此基礎(chǔ)上，成功的文心蘭基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)均以PLBs為轉(zhuǎn)化受體，但以PLBs作為轉(zhuǎn)化受體得到的轉(zhuǎn)基因植株多是嵌合體，而且轉(zhuǎn)化效率較低(Liau et al，2003；You et al，2003；Raffeiner & Serelc，2009；林吾睿等，2012；Lee et al，2015)。由愈傷組織誘導(dǎo)形成PLBs多為單細(xì)胞起源(Jheng et al，2006)，因此，以愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，對于提高轉(zhuǎn)化效率和獲得穩(wěn)定遺傳目的基因的純合子非常有利。雖然以文心蘭的莖切段(Chen & Chang，2000)、根尖(Chen et al，2000；Wu et al，2004)和莖尖(Jheng et al，2006)等為外植體，可誘導(dǎo)出愈傷組織并實(shí)現(xiàn)了植株再生，但其愈傷組織誘導(dǎo)頻率低、周期長，而且愈傷組織難以保持胚性狀態(tài)。

文心蘭(Oncidium‘Gower Ramsey’)是一種觀賞性較高、市場競爭力較強(qiáng)的蘭花?；蚬こ逃N技術(shù)為觀賞植物的品種改良提供了有效途徑，而以愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體有利于轉(zhuǎn)基因植株的獲得。目前以文心蘭的莖切段、根尖和莖尖等為外植體，已成功誘導(dǎo)出愈傷組織并獲得了再生植株，但存在愈傷組織誘導(dǎo)頻率低、周期長，而且愈傷組織難以保持胚性狀態(tài)等缺點(diǎn)。本研究以文心蘭PLBs作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)及其植株再生培養(yǎng)，研究影響愈傷組織增殖的因素，從而為文心蘭基因工程育種提供一個(gè)高效、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化受體植株再生體系。

1　材料與方法

1.1 材料

所用的外植體為文心蘭PLBs，由本實(shí)驗(yàn)室從文心蘭腋芽中誘導(dǎo)得到后，通過繼代培養(yǎng)保存。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織誘導(dǎo)用解剖刀將培養(yǎng)4周左右的文心蘭PLBs分成單個(gè)，分別接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM1和CIM2上，置于黑暗中培養(yǎng)1個(gè)月，培養(yǎng)溫度為 (26±2)℃。每種培養(yǎng)基接種30個(gè)外植體，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

圖版 Ⅰ　文心蘭PLBs的愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生　A. 用于愈傷組織誘導(dǎo)的文心蘭PLBs; B. PLBs于CIM1培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的愈傷組織; C. B中愈傷組織的放大圖; D. PLB于CIM2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的愈傷組織; E. D中愈傷組織的放大圖; F. 于1/2MS+0.5 mg·L-1 TDZ+1.0 mg·L-1 2,4-D培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)28 d的愈傷組織; G. PLB誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后形成白色的PLBs; H. 白色的PLBs于光下培養(yǎng)，變綠萌發(fā); I. 壯苗培養(yǎng)2個(gè)月得到可移栽的再生植株。Plate Ⅰ　Callus induction and plant regeneration from the PLBs of Oncidium ‘Gower Ramsey’　A. PLBs used for callus induction; B. Callus induction from PLBs on CIM1 medium; C. Enlarged view of the callus showed in B; D. Callus induction from PLBs on CIM2 medium; E. Enlarged view of the callus showed in D; F. Callus subcultured on 1/2MS medium supplemented with 0.5 mg·L-1 TDZ and 1.0 mg·L-1 2,4-D for 28 d; G. White PLBs produced from callus after four weeks; H. White PLBs turned green and germinated under the light; I. Healthy plants obtained after two months.

根據(jù)Jheng et al(2006)和Chen & Chang(2000)的報(bào)道，以及我們前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)，選用的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成分別為(1)CIM1：以NDM (Tokuhara et al，1993) 作為基本培養(yǎng)基，添加1 mg·L-16-BA、0.1 mg·L-1NAA、1 g·L-1tryptone、20 g·L-1蔗糖和3.5 g·L-1phytagel，pH 5.5；(2)CIM2：以1/2MS作為基本培養(yǎng)基，添加1 mg·L-1TDZ、3 mg·L-12,4-D、1 g·L-1tryptone、20 g·L-1蔗糖和3.5 g·L-1phytagel，pH 5.5。

1.2.2 愈傷組織繼代培養(yǎng)將CIM1上誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)移至新鮮的CIM1上，而將CIM2上誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)移至添加不同濃度 TDZ 和 2,4-D(如表1所示)的愈傷組織繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基1/2MS + 1 g·L-1tryptone + 20 g·L-1蔗糖 + 3.5 g·L-1phytagel(pH 5.5)上，每個(gè)培養(yǎng)皿中放置0.5 g 左右的愈傷組織，3個(gè)培養(yǎng)皿為一重復(fù)，置于 (26±2)℃，黑暗培養(yǎng)四周后統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以篩選出愈傷組織增殖較快的培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 PLBs的誘導(dǎo)與萌發(fā)愈傷組織于1.2.2篩選出的最適愈傷組織增殖培養(yǎng)基上， 每隔1個(gè)月繼代培養(yǎng)1次，取第3次繼代培養(yǎng)1個(gè)月左右的愈傷組織分成直徑約5 mm的團(tuán)塊，轉(zhuǎn)移到T2培養(yǎng)基(3.5 g·L-1花寶1號 + 20 g·L-1紅薯 + 25 g·L-1香蕉 + 1 g·L-1tryptone + 20 g·L-1蔗糖 + 3.5 g·L-1phytagel，pH 5.5)上(Chan et al, 2005)，每個(gè)培養(yǎng)皿接種0.5 g 左右的愈傷組織，3個(gè)培養(yǎng)皿為一重復(fù)，置于 (26±2)℃，黑暗培養(yǎng)1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將誘導(dǎo)出的PLBs轉(zhuǎn)移至新的T2培養(yǎng)基上，(26±2)℃，1 000～1 500 lx，每天16 h光照培養(yǎng)。

表 1　不同培養(yǎng)基組成對文心蘭愈傷組織增殖的影響

注： 同列中不同小寫字母表示差異顯著，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。愈傷組織鮮重增殖倍數(shù)為繼代培養(yǎng)28 d的愈傷組織鮮重增加量與接種時(shí)的愈傷組織鮮重的比值。

Note: Different small letters in the same column indicate significant differences, while the same letters indicate no significant difference (P>0.05). Proliferation rate of callus fresh weight means the ratio of increased callus fresh weight to initial callus fresh weight after subculture for 28 d.

1.2.4 壯苗PLBs萌發(fā)后，將小苗轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基上，(26±2)℃，1 000～1 500 lx，每天16 h光照培養(yǎng)。壯苗培養(yǎng)基組成為以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加20 g·L-1蔗糖、1 g·L-1活性炭和3 g·L-1phytagel， pH 5.7。

為提高受試者依從性和數(shù)據(jù)記錄的準(zhǔn)確性，推薦使用《受試者日志》，并明確日志卡的注意事項(xiàng)及日志卡問題的完整說明。根據(jù)有效性評價(jià)需要，患兒和（或）其監(jiān)護(hù)人應(yīng)在日志中，選擇并及時(shí)記錄以下內(nèi)容：每日的SBM情況、大便性狀、排便疼痛、FI次數(shù)、憋便次數(shù)、腹痛，以及用藥、補(bǔ)救藥物使用和如廁訓(xùn)練等情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2007和 SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，平均值以平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法(Duncan’s multiple ranger test)進(jìn)行多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對文心蘭PLBs愈傷組織誘導(dǎo)的影響

分別于兩種培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)1個(gè)月后，100% 的PLBs誘導(dǎo)出愈傷組織(圖版Ⅰ：B，D)，但不同培養(yǎng)基組成所誘導(dǎo)出的愈傷組織狀態(tài)有差異。在NDM + 1 mg·L-16-BA + 0.1 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上，PLBs誘導(dǎo)出淡綠色的、較致密的愈傷組織，質(zhì)地偏硬(圖版Ⅰ：C)；而在1/2MS + 1 mg·L-1TDZ + 3 mg·L-12,4-D培養(yǎng)基上，PLBs誘導(dǎo)出乳白色的、較疏松的愈傷組織，質(zhì)地較軟(圖版Ⅰ：E)。

2.2 不同培養(yǎng)基對文心蘭愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響

將誘導(dǎo)出的愈傷組織分別轉(zhuǎn)移到相同組成的新鮮培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)愈傷組織在1/2 MS + 1 mg·L-1TDZ + 3 mg·L-12,4-D培養(yǎng)基上幾乎不增殖，而在NDM + 1 mg·L-16-BA + 0.1 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上增殖迅速，黑暗培養(yǎng)28 d愈傷組織鮮重增加了7.26倍。在NDM + 1 mg·L-16-BA + 0.1 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上的愈傷組織生長雖然比較快，但其比較致密、質(zhì)地偏硬，不能進(jìn)一步誘導(dǎo)出PLBs從而獲得再生植株。因此，我們重點(diǎn)研究以1/2MS為基本培養(yǎng)基時(shí)，TDZ和2,4-D的不同濃度配比對愈傷組織增殖的影響。

結(jié)果如表1所示，以1/2MS為基本培養(yǎng)基時(shí)，在2,4-D濃度為0.5～2.0 mg·L-1范圍內(nèi)，愈傷組織增殖主要受TDZ濃度的影響。當(dāng)培養(yǎng)基中的TDZ濃度從1.0 mg·L-1降低到0.5 mg·L-1，愈傷組織鮮重增殖倍數(shù)顯著增加(由最低的4.50倍增加到最高的6.04倍)；而保持培養(yǎng)基中的TDZ濃度不變，在一定范圍內(nèi)添加不同濃度的2,4-D，愈傷組織鮮重增殖倍數(shù)并沒有顯著變化。

2.3 文心蘭愈傷組織誘導(dǎo)PLBs及PLBs萌發(fā)的結(jié)果

愈傷組織于T2培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)三周后，肉眼可見其表面形成白色的PLBs(圖版Ⅰ：G)。誘導(dǎo)培養(yǎng)1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)每克鮮重的愈傷組織約誘導(dǎo)出(1 328.67 ± 198.58)個(gè)PLBs。

移至光下培養(yǎng)，培養(yǎng)物逐漸變綠，1個(gè)月后可看到PLBs萌發(fā)(圖版Ⅰ：H)。萌發(fā)率為(90.12 ± 3.65)%。

2.4 文心蘭壯苗培養(yǎng)的結(jié)果

將PLBs萌發(fā)后得到的小植株轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)約2個(gè)月，得到可以移栽網(wǎng)室的健壯再生植株(圖版Ⅰ：I)。成苗率達(dá)到100%。

3　討論與結(jié)論

基因工程育種是培育新品種的有效手段之一，文心蘭轉(zhuǎn)基因研究中幾乎都是以PLBs作為轉(zhuǎn)化受體，由于顆粒較大的PLBs是一個(gè)分化程度較高的個(gè)體，因此以其作為轉(zhuǎn)化受體材料很容易獲得嵌合體，使轉(zhuǎn)化效率普遍較低(崔廣榮，2010；Lee et al，2015)。由愈傷組織誘導(dǎo)形成PLBs多為單細(xì)胞起源(Jheng et al，2006)，以愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，對于提高轉(zhuǎn)化效率和獲得穩(wěn)定遺傳目的基因的純合子非常有利。因此，不少研究者致力于建立文心蘭的愈傷組織誘導(dǎo)及其植株再生體系，雖有成功的報(bào)道，但一直未能應(yīng)用到文心蘭的基因轉(zhuǎn)化中，究其原因主要是愈傷組織誘導(dǎo)頻率低、獲得再生能力所需時(shí)間較長且狀態(tài)難以維持。

以文心蘭的莖切段(Chen & Chang，2000)、根尖(Wu et al，2004)、莖尖(Jheng et al，2006)和葉(Chen & Chang，2000)為外植體，均可誘導(dǎo)出愈傷組織，其中根尖較葉片、莖段愈傷組織誘導(dǎo)頻率高，最高也只達(dá)到25%。其誘導(dǎo)出的綠色、較致密的愈傷組織需要在降低2,4-D和TDZ濃度的培養(yǎng)基上繼代3次以上才可得到具有再生能力的乳白色、較疏松的愈傷組織。而本試驗(yàn)以PLBs為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)頻率為100%，在添加了1 mg·L-1TDZ和3 mg·L-12,4-D的 1/2MS培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)出乳白色、較疏松的愈傷組織。另外，已有研究發(fā)現(xiàn)愈傷組織在繼代培養(yǎng)中容易分化出PLBs或芽，而且容易出現(xiàn)褐化死亡現(xiàn)象，這對愈傷組織的大量增殖非常不利，更是阻礙了在文心蘭轉(zhuǎn)基因操作中的應(yīng)用。本試驗(yàn)中愈傷組織繼代培養(yǎng)階段并未觀察到褐化現(xiàn)象，也無PLBs或芽的分化，而降低TDZ濃度有利于愈傷組織增殖。

已有報(bào)道表明，文心蘭愈傷組織再生時(shí)需要添加植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，細(xì)胞分裂素和生長素的種類及濃度配比大大影響愈傷組織的再生頻率(Wu et al，2004；Jheng et al，2006)。來源于PLBs的愈傷組織在不含有植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)而添加了20 g·L-1紅薯和25 g·L-1香蕉的培養(yǎng)基中，即可重新誘導(dǎo)出PLBs。由此可見，培養(yǎng)材料來源不同，即使是相同的培養(yǎng)目標(biāo)，培養(yǎng)基的成分也有很大差異。

總而言之，本研究成功建立了一個(gè)高效的文心蘭愈傷組織誘導(dǎo)及其植株再生體系，可望應(yīng)用于文心蘭的基因工程育種。

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Callus induction and plant regeneration ofOncidium‘Gower Ramsey’ by means of protocorm-like body culture

HUANG Xia*, LU Yu

(GuangdongKeyLaboratoryofPlantResources,SchoolofLifeSciences,SunYat-senUniversity, Guangzhou 510275, China )

Oncidium‘Gower Ramsey’ is a species of orchid with high ornamental value and strong market competitiveness. Gene engineering breeding technology provides an effective way for the genetic improvement of ornamental plants. And callus is an ideal transformation receptor. Up to now, callus induction and plant regeneration ofOnciudiumhave been successfully achieved using stem segment, root tip and shoot tip. But there are some shortcomings for theseinvitroregeneration systems, such as low frequency and long period of callus induction, difficulty in maintaining embryogenic state of callus, etc. In this research, for the first time protocorm-like bodies ofOncidium‘Gower Ramsey’ were used as explants for callus induction and plant regeneration. The effects of different concentrations and combinations of TDZ and 2,4-D on callus proliferation were investigated. The results showed that 1/2MS medium supplemented with 1 mg·L-1TDZ and 3 mg·L-12,4-D could promote the induction of whitish and friable callus, the induction rate was 100%. The proliferation rate of callus was mainly affected by the concentration of TDZ, while the callus subculture medium consisted of TDZ in combination with 2,4-D at the concentrations of 0.5 to 2.0 mg ·L-1. When the concentration of TDZ decreased from 1.0 to 0.5 mg·L-1, proliferation rate of the callus fresh weigh increased significantly. And the optimal medium for callus proliferation contained 1/2MS basal medium, 0.5 mg·L-1TDZ and 1.0 mg·L-12,4-D. After four weeks of subculture in the dark, the highest proliferation rate of the callus fresh weigh, which was 6.04 folds, appeared on the optimal medium, while the lowest proliferation rate of the callus fresh weigh, which was 4.50 folds, appeared on the medium containing 1/2MS basal medium, 1.0 mg·L-1TDZ and 2.0 mg·L-12,4-D. The callus subcultured on the optimal proliferation medium for about one month were transferred to T2 medium (3.5 g·L-1Hyponex 1 + 20 g·L-1sweet potato + 25 g·L-1banana + 1 g·L-1tryptone + 20 g·L-1sucrose + 3.5 g·L-1phytagel) and cultured in the dark for PLBs induction. Approximately, 1 328.67 protocorm-like bodies could be generated in one month from an initial culture of 1 g callus fresh weight. Subsequently, the cultures transferred onto the fresh T2 medium. The germination rate of protocorm-like bodies was as high as 90.12% after one month of culture under the light. When transplanted on 1/2MS medium supplemented with 1 g·L-1active carbon, all shoots became healthy plants after two months. In this study, the callus induction and plant regeneration system ofOncidium‘Gower Ramsey’ with high frequency was successfully developed to provide an efficient and stable transformation receptor system for the genetic transformation ofOncidium.

Oncidium‘Gower Ramsey’, tissue culture, callus proliferation, TDZ, redifferentiation

10.11931/guihaia.gxzw201501038

2015-01-28

2015-08-07

國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAD01B0702)[Supported by the National Key Technology R & D Program during the Twelfth Five-year Plan Period (2013BAD01B0702)]。

黃霞(1974- )，女，廣東廉江市人，博士，副教授，研究方向?yàn)橹参锷砼c分子生物學(xué)，(E-mail)huangxia@mail.sysu.edu.cn。

Q945

A

1000-3142(2016)09-1082-05

黃霞， 盧禹. 文心蘭類原球莖的愈傷組織誘導(dǎo)及其植株再生 [J]. 廣西植物， 2016， 36(9):1082-1086

HUANG X, LU Y. Callus induction and plant regeneration ofOncidium‘Gower Ramsey’ by means of protocorm-like body culture [J]. Guihaia， 2016， 36(9):1082-1086