河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科

李　多　于永強(qiáng)　高會斌　劉德清△(張家口 075000)

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白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜保護(hù)作用

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科

李多于永強(qiáng)高會斌劉德清△(張家口 075000)

提要目的：探討白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對慢性萎縮性胃炎(CAG)大鼠胃黏膜保護(hù)機(jī)制。方法: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為空白對照組、模型組、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ組(10、20、40 mg/kg), 采用脫氧膽酸鈉和熱鹽水交替灌胃、結(jié)合饑飽失常方法制備CAG大鼠模型, 治療8周后, 采用ELISA法檢測白細(xì)胞介素-8(IL-8)含量、Western blot法檢測熱休克蛋白70(HSP 70)、核轉(zhuǎn)錄因子-k B(NF-kB)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)蛋白表達(dá)。結(jié)果: 與空白對照組對比, 模型組HSP70蛋白表達(dá)降低(P<0.01), IL-8含量(P<0.01)增加、NF-κB和COX-2蛋白表達(dá)升高(P<0.01)； 與模型組對比, 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ高、中、低3個(gè)劑量組提高HSP70蛋白表達(dá), 降低IL-8含量、NF-κB和COX-2蛋白表達(dá)(P<0.05), 以白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ組(40 mg/kg)作用顯著。結(jié)論: 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對CAG大鼠的保護(hù)作用是通過抗炎作用。

白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ；慢性萎縮性胃炎；白細(xì)胞介素-8；熱休克蛋白70；核轉(zhuǎn)錄因子-kB；環(huán)氧合酶-2

慢性萎縮性胃炎(CAG)是消化系統(tǒng)多發(fā)病, 是一種以胃黏膜廣泛性或局部性固有腺體萎縮、黏膜層變薄、黏膜肌層變厚為主要病理改變的慢性胃炎, 并且常伴有炎性反應(yīng)、腸上皮化生以及不典型增生。[1]CAG于1978年被世界衛(wèi)生組織列為胃癌前狀態(tài)。CAG是一個(gè)多階段、多病因、多基因逐漸變異積累的過程。 它常與幽門螺桿菌感染、煙酒、飲食、十二指腸反流等致病因素有關(guān)。中醫(yī)藥在治療CAG中也起到積極的作用, 有文獻(xiàn)報(bào)道, 胃炎Ⅰ號[2]、復(fù)方中藥安胃湯[3]等在治療CAG中效果明顯。枳術(shù)寬中也是治療胃腸道疾病常用藥, 其君藥為白術(shù), 白術(shù)為菊科植物白術(shù)(Atractylodes macrocephala Koidz)的干燥根, 主產(chǎn)于浙江、湖北等省。其性味甘、苦、溫, 具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效, 其有效成分單體白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ調(diào)節(jié)胃腸道功能和促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收的功效, 具有抗炎[4]、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力作用。[5-6]CAG研究結(jié)果顯示, CAG模型中白介素-8[7]、(IL-8)、熱休克蛋白70[8](HSP 70)、核轉(zhuǎn)錄因子-kB[9](NF-kB)和環(huán)氧合酶-2[10](COX-2)蛋白在疾病進(jìn)展中有重要作用。IL-8可促使NF-kB表達(dá)并發(fā)生活化, 導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng), 胃黏膜受損, 慢慢形成CAG。而在細(xì)胞核內(nèi)NF-K B可增加COX-2的合成。 而HSP70競爭性抑制N-kB活化，阻斷IL-8的過量生成, 中斷IL-8與NF-kB的炎癥級聯(lián)反應(yīng),[11]保護(hù)胃黏膜, 阻止CAG發(fā)生。因此, 本實(shí)驗(yàn)探討白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對CAG大鼠模型體內(nèi)IL-8、HSP70、NF-kB、COX-2的影響, 為臨床工作提供理論基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為8周齡SPF級SD大鼠, 由河北北方學(xué)院動(dòng)物中心提供, 共70只, 雌雄對半, 體質(zhì)量180～200 g。在實(shí)驗(yàn)過程中, 分籠飼養(yǎng), 室溫18℃～25℃, 濕度50%～60%, 空氣新鮮, 自由攝食、飲水, 通風(fēng)良好, 符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)原則。 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對照品(批號111687), 購于中國生物制品藥品鑒定所; 脫氧膽酸鈉, IL-8 Elisa試劑盒(批號131209), 兔抗鼠HSP多克隆抗體(批號bs-1105R)、兔抗鼠NF-kB多克隆抗體(批號bs-1361R)、兔抗鼠COX-2多克隆抗體(批號bs-0081R), Goat Anti- rabbit Ig G/HRP(批號bs-0295G-HRP), BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號140821), 預(yù)染寬范圍蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)條帶(批號111687), DAB顯色劑(批號ZLI-9017)購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1CAG模型的建立：選用50只SD大鼠, 隨機(jī)分為空白對照組10只, 造模組40只, 參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]大鼠先以0.2%的脫氧膽酸鈉溶液灌胃, 1.5 mL/只·d-1, 間隔時(shí)間為5 h, 再用 50℃熱鹽水灌胃, 2 mL/只·d-1, 并且加用饑飽失常(即2 d喂食, 足量, 1 d停食)的方法, 隨機(jī)剖殺, 光鏡下胃黏膜病理學(xué)檢查, 確認(rèn)模型成功, 持續(xù)造模共8周。模型成功后, 隨機(jī)分為模型組, 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ高、中、低3個(gè)劑量組, 每組10只，動(dòng)物如有死亡, 及時(shí)補(bǔ)充。 空白對照組大鼠給予相應(yīng)等量的蒸餾水, 正常喂養(yǎng), 自由活動(dòng)飲水。

1.2.2模型鑒定標(biāo)準(zhǔn)：參照《中藥新藥臨床研

究指導(dǎo)原則》(2002) CAG的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]: 固有腺體萎縮, 黏膜肌層增厚, 可有腸上皮或假幽門腺上皮化生, 固有膜驗(yàn)證, 可有淋巴濾泡形成。

1.2.3給藥：白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ溶液的配制: 各治療組從第 9 周始每日上午8點(diǎn)分別灌胃給藥, 空白對照組和模型組給予等體積的生理鹽水。按照大鼠與人體表面積比例系數(shù)換算,[14]白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ高劑量組40 mg/kg, 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ中劑量組20 mg/kg, 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ低劑量組10 mg/kg, 每天稱大鼠體質(zhì)量1次, 依據(jù)大鼠末次體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量, 給藥時(shí)間8周。

1.3IL-8的測定采集大鼠空腹動(dòng)脈血5 mL, 及時(shí)分離血清, 取上清液, 置于-20℃冰箱備用。采用ELISA試劑盒進(jìn)行檢查, 嚴(yán)格按照IL-8試劑盒說明書步驟操作, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得出IL-8含量。

1.4HSP70、NF-kB、COX-2檢測大鼠處死后, 取全胃胃竇黏膜組織, 放入-80℃。 提取組織中總蛋白：將剪刀剪碎組織塊, 加入400 μL裂解液于勻漿器中進(jìn)行勻漿。然后置于冰上裂解30 min后, 移入離心管中, 4℃12 000 r/min 離心5 min, 取上清液分裝, 放置-20℃保存。 采用BCA法測蛋白含量, 每孔蛋白上樣量為 25 μg, 將1份蛋白與4份5×上樣緩沖液混勻, 100℃煮沸5 min, 離心上樣；SDS-PAGE電泳, 轉(zhuǎn)膜, 封閉, 然后分別與兔多克隆一抗HSP70 (1︰200), NF-kB (1︰200), COX-2 (1︰200) 4℃孵育過夜, 沖洗辣根過氧化酶標(biāo)記二抗(1︰1500)室溫孵育1 h, 沖洗, DAB顯色, 以GAPDH為內(nèi)參照, 用凝膠分析軟件Qantity one對蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

2　結(jié)果

2.1白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ降低CAG模型大鼠血清IL-8含量與空白對照組比較, 模型組血清IL-8含量升高, 差異具有非常顯著性(P<0.01)，說明CAG模型大鼠血清中IL-8含量有明顯升高。 與模型組比較, 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ高、中、低3個(gè)劑量組中血清IL-8含量顯著下降(P<0.05), 且隨著劑量的增高血清IL-8含量顯著下降(P<0.01)，說明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ降低CAG模型大鼠血清IL-8含量，并與白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ劑量的高低有關(guān)。詳見表1。

分組例數(shù) 劑量(mg/kg)IL-8(pg/mL)空白對照組106.67±0.25模型組1021.92±1.06**白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ低劑量組101017.47±1.34△白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ中劑量組102013.01±1.12△△白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ高劑量組10409.18±0.98△△

注：與空白對照組比較，** P<0.01；與模型組比較，△ P<0.05, △△ P<0.01

2.2白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對CAG模型大鼠蛋白表達(dá)影響與空白對照組比較, 模型組HSP70蛋白表達(dá)減少, NF-kB、COX-2蛋白表達(dá)升高, 差異具有非常顯著性(P<0.01)，說明CAG模型大鼠HSP70蛋白表達(dá)明顯下降, NF-kB、COX-2蛋白表達(dá)明顯升高。與模型組比較, 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ3個(gè)劑量組中HSP70蛋白表達(dá)顯著增加, NF-kB、COX-2蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05), 說明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ提高CAG模型大鼠HSP70蛋白表達(dá), 降低CAG模型大鼠NF-kB、COX-2蛋白表達(dá)。詳見表2。

分組例數(shù)劑量(mg/kg) HSP70NF-κBCOX-2空白對照組102.20±0.010.23±0.040.43±0.09模型組101.10±0.08**0.76±0.05**1.23±0.09**白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ低劑量組10101.39±0.07△0.65±0.07△1.03±0.07△白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ中劑量組10201.57±0.06△△0.52±0.07△△0.83±0.09△△白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ高劑量組10401.86±0.08△△0.41±0.06△△0.63±0.08△△

注：與空白對照組比較，** P<0.01；與模型組比較，△ P<0.05, △△ P<0.01

3　討論

IL-8是一種糖蛋白, 定位于人染色體4q12-21, 由3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子組成, 包括69、72和77個(gè)氨基酸3種形式, 其中72個(gè)氨基酸是活性形式, 長5.2 kb。 研究表明, 炎癥參與某些腫瘤病理學(xué)發(fā)展過程。炎癥細(xì)胞可分泌大量細(xì)胞因子與細(xì)胞外基質(zhì)形成新微環(huán)境, 還可以形成炎性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò), 促進(jìn)腫瘤的發(fā)生, 細(xì)胞遷移和侵襲。CAG發(fā)展為胃癌與幽門螺旋桿菌感染密切相關(guān)。幽門螺旋桿菌感染引起胃黏膜慢性炎癥, 釋放大量IL-8、NF-κB等炎性因子, IL-8、NF-κB持續(xù)高表達(dá), 抑制肌體免疫應(yīng)答、導(dǎo)致胃黏膜細(xì)胞惡變等; 同時(shí)高表達(dá)的炎性因子通過不同作用機(jī)制促進(jìn)胃癌的形成與發(fā)展。[15]文獻(xiàn)報(bào)道, IL-8在胃癌腫瘤組織、血清中高表達(dá)。 付浩等[16]研究發(fā)現(xiàn), IL-8蛋白陽性表達(dá)率在正常胃黏膜-癌前狀態(tài)-胃癌的發(fā)生過程中逐漸升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 與空白對照組比較, 模型組血清IL-8含量升高, 具有顯著差異；說明CAG模型大鼠血清中IL-8含量明顯升高。與模型組比較, 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ組血清IL-8含量顯著下降, 說明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ降低CAG模型大鼠血清IL-8含量。

HSP70是應(yīng)激反應(yīng)蛋白并在生物進(jìn)化過程中高度保守, 是細(xì)胞內(nèi)分子伴侶, 當(dāng)組織遇到各種不良刺激時(shí) 它能結(jié)合未折疊或新生蛋白, 輔助或穩(wěn)定其形成正確空間構(gòu)象; 調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫系統(tǒng), 維持調(diào)節(jié)蛋白整體性; 還可以結(jié)合變性蛋白, 使結(jié)合蛋白降解。有研究發(fā)現(xiàn), 在如胃潰瘍、慢性胃炎等胃黏膜病變損傷修復(fù)中, 誘導(dǎo)HSP70表達(dá)可增強(qiáng)胃黏膜細(xì)胞的抵抗力, 保護(hù)胃黏膜細(xì)胞。有研究表明, 誘導(dǎo)HSP70表達(dá)增加能減輕肝切除、急、慢性胃潰瘍、慢性結(jié)腸炎等疾病的組織損傷, 增強(qiáng)細(xì)胞抵抗力。[17]目前HSP70在慢性萎縮性胃炎中的作用機(jī)制可能為HSP70可增強(qiáng)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài), 調(diào)節(jié)增殖與凋亡的動(dòng)態(tài)平衡, 減少突變, 另外研究發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌感染可能通過抑制HSP70表達(dá), 獲得免疫逃避, 而長期定植。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 與空白對照組比較, 模型組HSP70蛋白表達(dá)減少, 具有顯著差異；說明CAG模型大鼠HSP70蛋白表達(dá)明顯下降。與模型組比較, 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ組HSP70蛋白表達(dá)顯著增加, 說明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ提高CAG模型大鼠HSP70蛋白表達(dá)。

NF-κB是一種多向性細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子, 以無活性的形式存在, 無調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄功能, 只有被激活時(shí), NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮重要作用。大量文獻(xiàn)報(bào)道, NF-κB參與肌體的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答, 調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)基因, 調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長。NF-κB與COX-2的關(guān)系也非常密切。[18]COX-2則是一種胞裝蛋白, 與炎癥、腫瘤等病理過程相關(guān)。COX-2可通過AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活細(xì)胞NF-κB, COX-2選擇性抑制劑, 可抑制NF-κB活性, 抑制腫瘤增殖, COX-2在腫瘤形成中的作用機(jī)制可能為催化致癌物質(zhì)的形成, 催化前列腺素, 調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化, 增加細(xì)胞與胞外基質(zhì)的黏附力等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 與空白對照組比較, 模型組NF-κB蛋白表達(dá)升高, 具有顯著差異；說明CAG模型大鼠NF-κB、COX-2蛋白表達(dá)明顯升高。與模型組比較, 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ組NF-κB、COX-2蛋白表達(dá)顯著下降, 說明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ降低CAG模型大鼠NF-κB、COX-2蛋白表達(dá)。

其中在炎癥反應(yīng)中IL-8可促使NF-κB表達(dá)并發(fā)生活化, 兩者相互影響, 導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng), 胃黏膜在這種長期炎癥作用下受損, 慢慢形成CAG。此外, 在細(xì)胞核內(nèi)NF-κB可增加前列腺素合成限速酶COX-2的合成。而HSP70競爭性抑制NF-κB活化, 阻斷IL-8的過量生成, 中斷IL-8與NF-κB的炎癥級聯(lián)反應(yīng),[11]保護(hù)胃黏膜, 阻止CAG發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可能通過抑制IL-8的釋放、降低NF-κB和COX-2的合成、提高HSP70的合成, 切斷炎癥因素對胃黏膜的損傷, 對CAG起到治療作用, 為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

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(2016-02-29收稿)

Protection of Atractylenolide I for Gastric Mucosa of Chronic Atrophic Gastritis Rats

Digestive System Department of No. 1 Affiliated Hospital, Hebei North University

LIDuoYUYong-qiangGAOHui-binLIUDe-qing(Zhangjiakou 075000)

Objective: to explore the protective mechanism of Atractylenolide I for gastric mucosa of chronic atrophic gastritis (GAC) rats. Methods: The laboratory animals were randomly divided into control group, model group and Atractylenolide I group (10, 20, 40 mg/kg). The models were established by alternate intragastric administration with sodium deoxycholate and hot saline, which was combined with irregular diet. 8 weeks later, ELISA was taken to detect IL-8 content, and Western blot to detect HSP 70, NF-κB and COX-2 expressions. Results: Compared to control group, HSP 70 of model group decreased (P<0.01), IL-8 increased (P<0.01), , NF-κB and COX-2 increased (P<0.01); compared to model group, low, medium and high dose groups of Atractylenolide I increased HSP 70 expression, decreased IL-8, NF-κB and COX-2 (P<0.05), especially significantly in the high dose group (40 mg/kg) . Conclusion: Atractylenolide I may provide protection for CAG rats through anti-inflammatory action.

Atractylenolide I; chronic atrophic gastritis (GAC); IL-8 (interleukin-8); HSP 70 (heat shock protein 70); NF-κB (nuclear factor-κB); COX-2

R285.5

A

1007-5615(2016)03-0005-04

△河北省康保縣人民醫(yī)院內(nèi)科(康保 076650)